Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національний аграрний університет

УДК 619:578.833.31.

Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней

16.00.03 - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук

Білоконь Валерій Іванович

Київ 2006

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Національному аграрному університеті Кабінету Міністрів України

Науковий керівник - доктор ветеринарних наук, професор СКИБІЦЬКИЙ Володимир Гурійович, Національний аграрний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології

Офіційні опоненти: доктор ветеринарних наук, професор Литвин Володимир Петрович, Національний аграрний університет, професор кафедри епізоотології та інфекційних хвороб тварин

кандидат біологічних наук, Кучерявенко Олексій Олександрович, Інститут ветеринарної медицини УААН, заступник директора з наукової роботи

Провідна установа - Білоцерківський державний аграрний університет Міністерства аграрної політики України, м. Біла Церква

Захист дисертації відбудеться “29” червня 2006р. о 13 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.004.03 у Національному аграрному університеті за адресою : м. Київ, вул. Героїв оборони 15, навчальний корпус №3, ауд.65

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Національного аграрного університету за адресою: 03041, м. Київ, вул. Героїв оборони 13, навчальний корпус №4, к.41

Автореферат розісланий “26” травня 2006р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Міськевич С.В.

вірус чума свиня імуногенний

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Класична чума свиней (КЧС) - досить поширена інфекція, здатна спричиняти суттєві економічні збитки свинарським господарствам. Так, збитки, нанесені епізоотією КЧС у Німеччині, за 10 років склали понад 4 млрд. німецьких марок.

Незважаючи на те, що на території України нині спалахи хвороби ліквідовані, існує постійна загроза спалаху інфекції, зокрема, у зв'язку з інтенсивними контактами у господарській та інших сферах людської діяльності з регіонами, неблагополучними щодо КЧС свиней.

Важливим елементом у профілактиці КЧС є створення несприйнятливості чутливих тварин шляхом їх імунізації. Оскільки в Україні, на період визначення напряму дисертаційних досліджень, останні не були розроблені, перед нами й було поставлено відповідне завдання, від вирішення якого повністю залежала якість вітчизняного препарату специфічної профілактики КЧС.

Для специфічної профілактики КЧС застосовувались різноманітні засоби, зокрема, ряд інактивованих та живих вакцин, гіперімунні сироватки, практикувалось симультанне щеплення. Найбільших успіхів у галузі створення вакцин та розробки профілактичних заходів досягли Каротин А.С.(1935), Дутамура (1935), Дорсет (1935), Кулеско І.І. (1944) та інші вчені. Застосування інактивованих вакцин проти КЧС зіграло позитивну роль у зниженні напруженості епізоотичної ситуації у неблагополучних щодо КЧС регіонах. Проте недостатня імуногенність, висока вартість та незручності під час щеплення сприяли тому, що дослідники віддали перевагу аттенуйованим препаратам. Ці препарати, як правило, високоімуногенні, оперативно забезпечують специфічну несприйнятливість, значно дешевші від інактивованих, однак часто не позбавлені реактогенних властивостей і, при певних обставинах, можуть виявляти імуносупресивну дію.

Було б важливим мати в розпорядженні вакцини обох типів - інактивовані й живі та використовувати їх залежно від конкретної епізоотичної ситуації у регіоні.

Актуальність теми. Актуальність теми диктується відсутністю ефективних засобів специфічної профілактики класичної чуми свиней та постійною загрозою виникнення цієї хвороби, здатної заподіяти суттєві економічні збитки.

Зв'язок роботи з науковими програмами, темами, планами. Дослідження виконані згідно з тематикою науково-дослідної роботи кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету “ Вивчення клітинного імунітету тварин з метою теоретичного та експериментального обґрунтування засобів і методів імунопрофілактики” (номер Держреєстрації - 0101U01755 ), тематикою лабораторії вакцинних препаратів Інституту ветеринарної медицини УААН (номер Держреєстрації - 0101U000819).

Мета і завдання роботи. Метою роботи було експериментальне обґрунтування методики культивування вакцинного штаму в процесі розробки біотехнології вірусвакцини проти КЧС. Для досягнення мети необхідно було вирішити наступні наукові завдання:

- отримати первиннотрипсинізовані клітинні культури з тестикул овець і кіз та оптимізувати окремі етапи відповідних методик;

- здійснити дослідження у плані отримання постійної клітинної лінії тестикул ягнят (ТЯ);

- розробити цитохімічний варіант імуноферментного аналізу для виявлення та титрування вірусу КЧС у клітинних культурах;

- оптимізувати методику культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС у первиннотрипсинізованій клітинній культурі ТЯ;

- охарактеризувати імуногенні властивості вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у клітинній культурі ТЯ, при експериментальній інфекції у свиней.

Об'єкт дослідження-- вакцинний штам ЛК-М вірусу класичної чуми свиней.

Предмет дослідження -- культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС у клітинних культурах ТЯ і SК-6, вплив різних факторів на його врожайність; імуногенність штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у первиннотрипсинізованій клітинній культурі ТЯ.

Методи досліджень: вірусологічні (вивчення властивостей вірусного штаму), імунологічні (визначення впливу вірусного штаму на імунітет тварин), клінічні (визначення клінічного стану тварин під дією вакцинного та контрольного штаму класичної чуми свиней), патологоанатомічні (оцінка характерних змін при загибелі тварин від класичної чуми свиней), статистичні (визначення достовірності проведених досліджень).

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в Україні розроблено технологію культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС, яка забезпечує достатню його урожайність та високі імуногенні властивості.

Розроблено цитохімічний варіант імуноферментного аналізу (ІФА) з метою виявлення та титрування вірусу КЧС у заражених клітинних культурах.

Вперше охарактеризовано вплив штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у первиннотрипсинізованій клітинній культурі тестикул ягнят, на деякі показники клітинного імунітету.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені оптимальні методики отримання первиннотрипсинізованої клітинної культури із ТЯ, методика зараження клітинних культур вакцинним штамом вірусу КЧС, методика виявлення та титрування останнього у клітинних культурах, які були використані при створенні науково-технічної документації (НТД) на виготовлення та застосування вакцини ЛК-М проти КЧС, впровадженої у практику ветеринарної медицини України (ТУУ 46.15.079 - 95), додатки до ТУУ №1 (2000р.) та №2 (2005р.)

Особистий внесок здобувача. Здобувач особисто отримував біологічний матеріал (тестикули тварин, сироватку крові), здійснював трипсинізацію, культивував клітини, оцінював їх моношар, оптимізував параметри культивування та зараження клітинних культур, визначав титр вірусу й здійснював усі інші маніпуляції щодо експериментального обгрунтування результатів, одержаних під час вирішення поставлених у роботі наукових завдань; аналізував результати власних досліджень, робив наукові висновки та пропозиції для виробництва. Окремі дослідження виконував разом з іншими науковцями: Собком Ю. А., Панченком О. О., Вергун Л. Ю., Ситюком М. П.

У розробці цитохімічного варіанту ІФА для детекції вірусу брали участь: кандидат ветеринарних наук Собко Ю. А., кандидати біологічних наук Вергун Л.Ю. та Темніханов Ю. Д., доктор ветеринарних наук Прискока В. А., лікар ветеринарної медицини Левченко К. А.

Визначенню впливу вакцинного штаму ЛК-М, репродукованого в клітинній культурі ТЯ, на деякі показники імунітету сприяв кандидат ветеринарних наук Столюк В. В.

Експерименти на свинях виконували разом з головним інспектором ветеринарної медицини Васильківського району Хижняком М.М., приватним підприємцем Іващенком С.А., науковим співробітником Луком О.М., головним лікарем районного підприємства ветеринарної медицини Новоушицького району Візнюком С.П., приватним підприємцем Семеновим О.О., науковим співробітником ІВМ Ситюком М. П.

Апробація результатів дисертації. Основні результати досліджень, викладені у дисертації, були повідомлені й обговорені на щорічних конференціях професорсько-викладацького складу та аспірантів Національного аграрного університету (1998 - 2004 рр.), а також на Всеукраїнській конференції ветеринарних вірусологів у м. Маріуполь (2002 р.), Міжнародному конгресі спеціалістів ветеринарної медицини ( 3-4 серпня 2004 р.) та курсах підвищення кваліфікації головних спеціалістів вірусологічних відділів обласних державних лабораторій ветеринарної медицини (2001-2005рр.).

Публікації. За темою дисертаційної роботи опубліковано 7 наукових праць. Із них 6 статей - у фахових виданнях, перелік яких затверджений ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація містить такі розділи: вступ, огляд літератури, власні дослідження, аналіз та узагальнення результатів досліджень, висновки та пропозиції виробництву, список використаних джерел літератури, додатки.

Робота викладена на 168 сторінках комп'ютерного тексту, ілюстрована 21 рисунком, у ній наведено 17 таблиць. До списку літератури входить 257 джерел, у т.ч. 196 - іноземними мовами.

МАТЕРІАЛ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Робота виконана на базі кафедри мікробіології, вірусології та біотехнології Національного аграрного університету. Частину досліджень проведено на базі НВП “Біо-Тест-Лабораторія ” (м. Київ), деякі з них - в умовах Центру з вивчення особливо небезпечних хвороб тварин УААН (м. Житомир) та у тваринницьких господарствах (К.С.П. “Придніпровське” Обухівського району Київської області ) .

У процесі виконання роботи були використані штами вірусів, первинні й перещеплювальні клітинні культури, різні види тварин: свині, вівці, кози.

Штами вірусу КЧС : штам ЛК-М - вакцинний, отриманий в умовах НВП “Біо-Тест-Лабораторія” ( за нашою участю) методом клонування вакцинного штаму ЛК-ВНДІВІМ, адаптований до КК ТЯ (депонований у Державному науково-контрольному інституті біотехнології і штамів мікроорганізмів, м. Київ);

штам Ші - Минь, одержаний у Центрі з вивчення особливо небезпечних хвороб тварин (м. Житомир), вірулентний для свиней різного віку при парентеральному зараженні.

Клітинні культури (КК): постійні лінії клітин РК-15 та SK-6 ( одержані з банку клітинних культур НВП “Біо-Тест-Лабораторія”), адаптовані до живильних середовищ вітчизняного виробництва: ГЛА, RPMI. Зберігаються у замороженому стані (- 196 ⁰ С);

первиннотрипсинізована клітинна культура з тканин тестикул ягнят, отримана за загальноприйнятою методикою та власною модифікацією ряду елементів.

Сировиною для отримання первиннотрипсинізованої КК ТЯ були тестикули ягнят. В умовах господарства відбирали баранчиків віком 1 - 4 місяці й кастрували їх закритим способом. Тестикули із загальною піхвовою оболонкою поміщали в склянку з підтримуючим середовищем RРМІ - 1640, охолодженим до 4 ⁰ С, яке містило антибіотики - стрептоміцину сульфат 2 мг/см³ та бензил-пеніциліну 2000 ОД / см³. Матеріал транспортували в лабораторію і відразу ж піддавали трипсинізації.

Трипсинізацію здійснювали при різних температурних режимах (4⁰С, 20⁰С та 37⁰С). Використовували стандартний 0,25%-ний розчин трипсину. Під час трипсинізації у флакон із шматочками тканини почергово вносили трипсин та живильне середовище RPMI без сироватки крові. Така модифікація забезпечувала стабільний позитивний результат під час отримання клітинної культури з тканин тестикул ( наша модифікація ).

Після підрахунку кількості живих клітин одержували суспензію на ростовому живильному середовищі (ГЛА / RPMI 50 / 50 з 10 % сироватки крові вівці), додавали зазначене живильне середовище з таким розрахунком, щоб концентрація клітин становила 200 тис./ см³, та висівали в скляні або пластикові матраси, ролерні флакони, 96 - лункові планшети фірми SARSTED (залежно від потреб). Інкубували в стаціонарних та ролерних умовах (1-2об./хв) при температурі 37⁰ С. Стан формування моношару клітин визначали візуально та за допомогою інвертованого мікроскопа Оpton - ID - 02.

Зараження клітинних культур здійснювали за загальноприйнятим методом і різноманітними модифікаціями. У першому випадку живильне середовище зливали, у кожний матрас з культурою вносили вірусвмісну рідину, яку розподіляли по всьому моношару клітин. Адсорбцію здійснювали протягом 30-45 хвилин при кімнатній температурі (18-25⁰С), після чого вносили живильне середовище (ГЛА або Ігла на основі ФГМ-С з 4 % сироватки вівці або ягнят, рН 7,5-7,6).

Заражені клітинні культури інкубували протягом 4 - 5 діб у термостаті при температурі 37⁰С. Титр вірусу визначали за допомогою розробленого нами гістохімічного варіанту ІФА.

У зв'язку з пошуком методу зараження клітинних культур, який забезпечував би належну врожайність вірусного штаму та був достатньо технологічним, паралельно з описаним методом, проводили зараження за різними варіантами :

з попереднім відмиванням моношару та без відмивання;

з використанням процедури “адсорбція” вірусу та шляхом безпосереднього внесення вірусу в ростове живильне середовище.

Досліджували також вплив інших елементів на врожайність вірусу: інфікуючої дози, присутності трипсину у підтримуючому середовищі, експозиції культивування.

Кров від свиней відбирали за методикою У. Ерфле з співавторами (1987 р.).

Постановку гістохімічного варіанту імунопероксидазного методу здійснювали в пластикових планшетах фірми SARSTED. Використовували імунопероксидазний кон'югат власного приготування. Специфічну щодо збудника КЧС сироватку отримували на свинях, пероксидазу одержували від фірми SEGMA. Кон'югацію проводили за власною методикою. Результати постановки ІФА визначали візуально.

Постановку реакції інгібіції міграції лейкоцитів здійснювали за методикою, описаною Г. Фримелем (1987), у якості клітин-мішеней використовували лейкоцити селезінки мишей.

Перещеплювальну клітинну культуру ТЯ отримували на основі первиннотрипсинізованої клітинної культури ТЯ шляхом клонування та тривалого пасажування in vitro.

Достовірність результатів досліджень визначали шляхом статистичного опрацювання отриманих цифрових даних за програмою “Біом-3”.

Результати власних досліджень

Використовуючи загальновідомий принцип отримання первинно-трипсинізованих клітинних культур та запровадивши ряд власних модифікацій, нам вдалось розробити методику отримання первинно-трипсинізованої клітинної культури з тканин тестикул баранчиків і козлят. Клітини обох культур мали епітеліоподібний вигляд, формували якісний моношар протягом 3-4-х діб. Останній, за оптимальних умов, залишався без видимих деструктивних явищ протягом 10-14-ти діб.

Шляхом клонування та опромінення (0,5 мегарад) під час тривалого пасажування клітинної культури ТЯ, була отримана постійна клітинна лінія (перещеплювальна) ТЯ. За чутливістю та здатністю забезпечувати належну репродукцію вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС вона не поступається відповідній первиннотрипсинізованій клітинній культурі.

Орієнтуючись на відомі дослідження, що стосуються суті гістохімічних варіантів детекції патогенів, нами була розроблена методика виявлення вірусу КЧС у клітинних культурах та інших біологічних (патологічних) матеріалах, яка грунтується на гістохімічному варіанті ІФА. В процесі її розробки шляхом гіперімунізації кіз були одержані антивидові (проти імуноглобулінів свині) імуноглобуліни, отримані на їх основі імунопероксидазні кон'югати, оптимізовані всі етапи постановки гістохімічного варіанту ІФА та під час виявлення збудника КЧС ( чи його компонентів) у клітинних культурах. В таблиці 1 представлені результати титрування вірусу КЧС за допомогою розробленого нами гістохімічного варіанту ІФА та методу імунофлуоресціюючих антитіл.

Як свідчать вищенаведені дані, показники титру вірусу КЧС при застосуванні гістохімічного варіанту ІФА суттєво перевищували показники титру, визначені за допомогою ІФА (Р<0,05). Останній, крім того, надзвичайно громіздкий, потребує серйозного інструментального забезпечення, врахування результатів вимагає великого досвіду й надмірної зорової напруги, що послужило підставою віддати перевагу цитохімічному варіанту ІФА, підготувати та затвердити методичні рекомендації, користуватись ними в процесі оптимізації культивування вакцинного штаму вірусу КЧС і внести його в регламент виробництва вакцини проти КЧС.

Зважаючи на важливість інфікуючої дози вірусів у процесі їх культивування, ми здійснили ряд експериментів на клітинних культурах ТЯ та SK-6, заражаючи їх різними інфікуючими дозами штаму ЛК-М вірусу КЧС, з розрахунку на одну клітину. Титри вірусу визначали за допомогою гістохімічного варіанту ІФА та виражали їх у бляшкоутворюючих одиницях (БУО ; табл. 2,3).

Як видно з представлених у таблицях даних, найвищу врожайність вірусу вакцинного штаму ЛК- М спостерігали тоді, коли доза зараження становила 1 БУО /кл. (Р<0,05).

Наведені в таблиці та представлені на гістограмі (рис1) дані свідчать про те, що вміст трипсину у підтримуючому живильному середовищі в кількості 0,002 % сприяє підвищенню врожайності вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС в процесі репродукції його у первиннотрипсинізованій клітинній культурі (Р< 0,05).

Важливим елементом характеристики вірусної інфекції чутливої біологічної вірусної системи є, як відомо, необхідність ретельного дослідження динаміки накопичення вірусу. Особливого значення останнє набуває при розробці оптимальної технології отримання відповідного вірусного матеріалу.

Динаміка накопичення вакцинного штаму ЛК -М вірусу КЧС у клітинних культурах ТЯ та SК -6

У серії лабораторних експериментів клітинні культури вирощували в пластикових матрасах об'ємом 50 см³. Після формування моношару клітини заражали попередньо визначеною оптимальною дозою вірусу (1 БУО / кл.).

Заражені клітинні культури інкубували при 37⁰С та досліджували через 84, 108, 132 і 156 годин за допомогою цитохімічного варіанту ІФА.

Залежність вивчали на клітинних культурах ТЯ та SК-6. Досліджували вплив вмісту сироватки вівці у підтримуючому середовищі ГЛА + RPMI на врожайність зазначеного вище вірусу. Клітинні культури були вирощені у вигляді моношару в пластикових матрасах об'ємом 50см³. Зараження здійснювали штамом ЛК-М вірусу КЧС 1БУО / кл. Підтримуюче середовище контрольних зразків являло собою комбінацію ГЛА + RPMI (без сироватки), підтримуюче середовище для дослідних зразків містило сироватку крові вівці у різній концентрації : 2%,4% та 8 %.

Інкубацію здійснювали при температурі 37⁰С протягом 96 годин, потім визначали інфекційний титр вірусу за допомогою цитохімічного варіанту ІФА.

Як свідчать результати досліджень, наявність сироватки у підтримуючому середовищі помітно сприяє підвищенню врожайності штаму ЛК-М вірусу КЧС (Р < 0,05).

Оскільки вміст сироватки понад 2 % не впливає на подальше зростання врожайності вірусу, було вирішено використовувати підтримуюче середовище з додаванням 2 % сироватки.

Відомим у вірусологічній практиці прийомом, що дає змогу отримувати більш концентровані вірусні матеріали та суттєво економити живильне середовище, є ролерне культивування.

Як свідчать наведені у таблиці 7 дані, ролерне культивування забезпечує закономірно вищу концентрацію штаму ЛК-М вірусу КЧС (Р<0,05).

Вплив вакцинного штаму вірусу КЧС на деякі показники гуморального та клітинного імунітету у свиней вивчали на поросятах неплемінного походження, віковий діапазон яких був 3-4 місяці з масою тіла 30-40 кг.

Як показали результати дослідження, кількість еритроцитів у тварин після введення їм вакцини ЛК-М коливалась невірогідно (Р> 0,05). Кількість лейкоцитів периферійної крові у свиней дослідної групи вірогідно знизилася на сьому добу експерименту й становила 8,9 ± 0,32 Г/л, що на 2,6 Г/л було нижчим за показник контролю на даний період дослідження та 2,4 Г/л - за відповідний показник на третю добу експерименту (Р< 0,01). Така ж тенденція спостерігалася і на 14-ту добу від початку дослідження.

Коливання відносної кількості моноцитів спостерігалося у свиней обох груп, проте були невірогідними (Р > 0,05).

Максимальний відносний вміст лімфоцитів у свиней дослідної групи встановлений на 14-ту добу досліду і становив 51,2 ± 2,56 %, проте найвища абсолютна їх кількість була на сьому добу після введення вакцини і становила 5,02 ± 0,393 Г/л, що вірогідно, на 0,44 Г/л, перевищувало відповідний показник контролю (Р< 0,01). На 14-ту добу цей показник у тварин дослідної групи дещо знизився, але залишався вищим за відповідні дані контролю (Р < 0,01).

Абсолютна кількість Т-клітин набула максимального значення на третю добу від початку дослідження і становила 2,75 ± 0,299 Г/л, вірогідно - на 0,28 Г/л перевищуючи дані контролю (Р < 0,01). У подальші строки дослідження спостерігалося поступове вірогідне зниження кількості Т-лімфоцитів (Р < 0,01). Поступове вірогідне зниження кількості В-клітин порівняно із показниками до початку досліджень - до 0,89 Г/л (Р< 0,01)

спостерігалося до сьомої доби експерименту, проте на 14-ту добу відзначене її суттєве зростання - до 1,15 Г/л.

Спостерігалось суттєве зниження абсолютної кількості О-клітин на 14 - ту добу дослідження (на 0,26 Г/л порівняно з показниками до введення вакцини та на 0,31 Г/л порівняно з показником на сьому добу експерименту).

Дослідження Т-теофілінрезистентних клітин показало, що кількість лімфоцитів даної субпопуляції набула максимального значення на третю добу експерименту і становила 1,99 ± 0,214 Г/л, що, проте, невірогідно перевищувало відповідні дані до початку досліду (Р > 0,05) та вірогідно, на 0,2 Г/л - відповідні показники на 14-й день з моменту введення вакцини (Р< 0,01).

Кількість Т-теофілінчутливих клітин набула максимального значення на третю добу експерименту - 0,66 ± 0,095 Г/л, проте, коливання даного показника у тварин дослідної групи виявилося невірогідним (Р > 0,05).

Дослідження не виявило вірогідного впливу вакцини ЛК-М на фагоцитарну активність нейтрофілів (Р > 0,05).

Серед змін біохімічних показників сироватки крові вакцинованих свиней відзначено вірогідне зростання загального вмісту глобулінів на 14-ту добу експерименту, причому цей показник вірогідно перевищував відповідні дані до введення вакцини на 10,47 %, а дані тварин контрольної групи - на 9,57 % (Р < 0,01; Р < 0,001).

Максимального значення вміст ?-глобулінів у свиней дослідної групи набув на 14-ту добу після введення вакцини і становив 19,39 ± 2,899 %, що вірогідно перевищувало відповідні дані до введення вакцини та відповідні показники контролю - на 8,88 та 10,13 % (Р< 0,01).

На основі розробленої методики культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС було виготовлено 24 серії вірусвакцини. Препарат виявився ареактогенним та імуногенним. При вивченні імуногенності його на поросятах 3,5-4 - місячного віку було визначено, що в 1см³ міститься до 100 тисяч протективних доз. Цей показник вищий від препаратів, які виробляються в Україні.

ВИСНОВКИ

Експериментально обґрунтовано методику культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС в гетерологічній клітинній культурі, отриманій з тканини тестикул ягнят, яка забезпечує інтенсивну репродукцію вірусу зі збереженням достатнього рівня його імуногенних властивостей.

Отримано перещеплювальну клітинну культуру з тестикул ягнят, чутливу до вірусу КЧС, Ауєскі.

Розроблено гістохімічний варіант непрямого імуноферментного аналізу, який дає змогу виявляти та титрувати вірус КЧС у клітинних культурах.

Оптимізовано методику отримання первиннотрипсинізованих клітинних культур з тестикул ягнят та козлят, які забезпечують високий врожай клітин.

Оптимізовано методику культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу КЧС у первиннотрипсинізованій клітинній культурі ТЯ та перещеплювальній КК SK-6, яка забезпечує стабільно високу його врожайність. Оптимальна інфікуючи доза вірусу становила 1 БУО/кл.

Встановлено що на врожайність штаму ЛК-М вірусу КЧС впливає доза зараження, вміст трипсину в підтримуючому середовищі, якість підтримуючого живильного середовища та умови культивування. Процедура “адсорбції” та “відмивання” не змінюють інфекційного титру вірусу. Трипсин у концентрації 0,002% у підтримуючому живильному середовищі сприяє закономірному підвищенню інтенсивності репродукції вірусу КЧС . Титр вірусу зростає на 1.0lg БУО/см³ (Р<0,05).

Встановлено оптимальну інфікуючу дозу - 1БУО/клітину (Р<0,05) та експозицію інкубації заражених клітинних культур штамом ЛК-М вірусу КЧС-108-132 години.

Охарактеризовано імуногенну активність штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у первиннотрипсинізованій культурі клітин ТЯ. Поросята віком 2-4 місяці, яким було введено даний штам вірусу, не захворіли на КЧС при експериментальному зараженні вірулентним штамом збудника КЧС (шт. Ші-Минь) у дозі 4 lg ЛД_50.

ПРОПОЗИЦІЇ ВИРОБНИЦТВУ

Для промислового напрацювання вірусного матеріалу в умовах біофабрики рекомендуємо з цією метою використовувати ролерні установки .

Нагромадження антигену ВКЧС штаму ЛК - М здійснювати на перещеплювальних або первинних культурах овечого або козячого походження , вільних від контамінації пестивірусами.

Періодично - через два-три пасажі - перевіряти перещеплювальну культуру на предмет контамінації пестивірусами та сторонньою мікрофлорою, а первинну культуру клітин додатково до вищезазначеного, в таких самих інтервалах повністю поновлювати, запобігаючи небажаній втраті чутливості.

Тестування напрацьованого вірусного матеріалу здійснювати на перещеплювальних культурах клітин свинячого походження з метою більшої достовірності показників інфекційної активності на клітинах господаря вірусу, а також для кращої наглядності в мікроскопічному дослідженні.

Сироватку для культивування клітин отримувати в літньо - осінній період від будь-яких ссавців, за винятком ВРХ та тварин, які мали з ними безпосередній контакт, і відразу перевіряти на предмет присутності віруснейтралізуючих антитіл до пестивірусів у реакції нейтралізації.

Відбір тестикулярної тканини проводити від клінічно здорових донорів у господарствах, вільних від інфекційних хвороб.

Кастрацію тварин виконувати закритим методом, а отриманий матеріал поміщати в ростове середовище, аналогічне тому, на якому далі відбуватиметься культивування клітин.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ

1. Білоконь В.І. Удосконалення методів культивування вірусу класичної чуми свиней ( штаму ЛК-М )//Ветеринарна біотехнологія. Бюлетень. - №6. - 2005. -С.50-53.

2. Білоконь В.І. Вплив трипсину на врожайність вірусу класичної чуми свиней у первиннотрипсинізованій культурі клітин тестикулярної тканини баранчиків // Науковий вісник НАУ.- №75.-2004.- С.13-15.

3. Вергун Л.Ю., Собко Ю.А.,Білоконь В.І. Імунопероксидазний метод для виявлення вірусу класичної чуми свиней та визначення антитіл до нього в сироватці крові тварин // Науковий вісник НАУ. - №16. -1999. -С. 27 - 29. (проведені науково-практичні дослідження по підбору методики культивування вірусу КЧС у клітинних культурах, які використовуються при тестуванні вірусу і антисироваток до нього).

4. Скибіцький В.Г., Бондар С.В., Білоконь В.І. Пестивірусна інфекція великої рогатої худоби // Науковий вісник НАУ. - №28. - 2000. - С.146 - 150..(здійснене пасажування вірусу діареї ВРХ з визначенням ступеня його інфекційної активності в чутливій клітинній культурі).

5. Шиков О.Т., Ситюк М.П., Білоконь В.І., Панченко О.О.,Собко Ю.А., Ображей А.Ф.Комплексне вивчення протичумної вакцини “ ЛК - М “// Ветеринарна біотехнологія.Бюлетень . - №2. - 2002. - С.263 - 268.(безпосередня участь у виробництві вакцини ЛК-М вірусу КЧС та при її дослідженні на імуногенність і нешкідливість ).

6. Шиков О. Т., Ситюк М.П., Білоконь В. І., Панченко О. О., Собко Ю. А., Ображей А. Ф. Испытание иммуногенности производственных серий вирусвакцины “ЛК-М” против классической чумы свиней// Ветеринарна медицина. Міжвідомчий науковий тематичний збірник. - Харків. - 2002. - №80. - С. 641- 645. (безпосередня участь у виробництві вакцини ЛК-М вірусу КЧС, та при її дослідженні на імуногенність і нешкідливість ).

7.Столюк В.В., Мельник М. В., Білоконь В.І., Скибіцький В.Г. Вплив вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней, репродуко-ваного у первиннотрипсинізованій клітинній культурі тестикул ягнят, на імунологічні показники свиней // Науковий вісник НАУ. - №89. - 2005. - С. 73 - 77.(виконання експериментальної частини, пов'язаної з імунізацією тварин, відбором сироваток, аналізом отриманих результатів).

АНОТАЦІЇ

Білоконь В.І. Розробка лабораторного регламенту культивування вакцинного штаму ЛК-М вірусу класичної чуми свиней. Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата ветеринарних наук за спеціальністю 16.00.03. - ветеринарна мікробіологія та вірусологія. - Національний аграрний університет, Київ, 2006.

Дисертація присвячена розробці методики (технології) культивування вакцинного штаму ЛК-М збудника класичної чуми свиней.

У результаті виконання дисертаційних досліджень були оптимізовані основні елементи отримання первиннотрипсинізованої клітинної культури з тестикул ягнят, розроблено гістохімічний варіант імуноферментного аналізу, призначеного для виявлення та титрування вірусу КЧС у клітинних культурах, отримано перещеплювальну клітинну культуру ТЯ та охарактеризовано її основні біологічні властивості, чутливість до вірусів. Експериментально обґрунтовано раціональну методику отримання достатньо концентрованого вірусного матеріалу ( штам ЛК-М вірусу КЧС ), досліджено імуногенні властивості штаму ЛК-М вірусу КЧС, репродукованого у гетерологічній клітинній культурі ТЯ, охарактеризовано вплив його на деякі показники клітинного імунітету у свиней.

Ключові слова: класична чума свиней, штам ЛК-М, вірус КЧС, клітинна культура з тестикул ягнят, гістохімічний варіант імуноферментного аналізу.

Белоконь В.И. Разработка лабораторного регламента культивирования вакцинного штамма ЛК-М вируса классической чумы свиней. Диссертация на соискание научной степени кандидата ветеринарных наук по специальности 16.00.03. - ветеринарная микробиология и вирусология. - Национальный аграрный университет, Киев, 2006.

Диссертация посвящена разработке методики (технологии) культивирования вакцинного штамма ЛК-М возбудителя классической чумы свиней.

В результате выполнения диссертационных исследований были оптимизированы основные элементы получения первичнотрипсинизиро-ванной клеточной культуры с тестикул ягнят, включая промежуточные процессы такие как подбор донора, методика отбора донорского органа, режим транспортировки в лабораторию, а также получение первичнотрипсинизированной клеточной культуры с тестикул ягнят.

Разработан гистохимический вариант иммуноферментного анализа, предназначенного для выявления и титрования вируса КЧС в клеточных культурах. Метод оказался пригоден и для тестирования вируснейтрализирующих антител к возбудителю классической чумы свиней и занял достойное место в практике диагностических исследований свинопоголовья как на присутствие колостральных и поствакцинальных антител в сыворотках свиней, так и в случае определения вирусоносительства в цитрированной крови.

Получена перевиваемая клеточная культура ТЯ со стабилизированными ростовыми свойствами и охарактеризованы ее основные биологические свойства, чувствительность к вирусам. Экспериментально обосновано рациональную методику получения достаточно концентрированного вирусного материала ( штамм ЛК-М вируса КЧС ), применимого как для накопления вирусного материала при производстве живых и инактивированных вакцин против классической чумы свиней, так и для получения антигена при производстве диагностикумов, используемых для выявления данного заболевания.

В процессе серийных исследований вакцинного штамма ЛК-М, направленных на получение наиболее высокой его инфекционной активности, отрабатывали несколько параметров, которые, по нашему мнению, и согласно литературным данным, могли бы оказывать влияние на накопление изучаемого штамма в культуре клеток ТЯ и SК-6. Определен факт отсутствия существенного влияния отмывки клеточного монослоя перед инфицированием, а также процедуры адсорбции на титр инфекционной активности штамма ЛК-М при культивировании его в уже упомянутых клеточных культурах. В то же время отмечено положительное влияние присутствия минимальной концентрации трипсина в поддерживающей среде клеточной культуры после ее инфицирования вирусом КЧС, штамм ЛК-М.

Установлено положительное влияние присутствия в поддерживающей среде инфицированной клеточной культуры ТЯ и SК-6 сыворотки крови овцы. Замечено, что отрицательное влияние присутствия сыворотки крови овцы в поддерживающей среде после инфицирования возможно только в случае наличия в ней нейтрализирующих антител к пестивирусам. Причем, чем большее количество таких антител в сыворотке крови, тем ниже урожайность вакцинного штамма ЛК-М вируса КЧС, в клеточных культурах ТЯ и SК-6 - вплоть до полной нейтрализации вируса антителами и отсутствия его репродукции в клеточных культурах.

Доказано положительное влияние культивирования инфицированных клеточных культур вирусом КЧС, штамм ЛК-М, в ролерных условиях на конечный показатель инфекционной активности вируса, полученного в таких условиях.

Исследованы иммуногенные свойства штамма ЛК-М вируса КЧС, репродуцированного в гетерологической клеточной культуре ТЯ как в научных экспериментах, так и в ряде производственных испытаний серийных образцов вакцины против КЧС, изготавливаемой на основе штамма ЛК-М, практически замечена безвредность применения упомянутого вакцинного штамма в дозе, в 100 раз превышающей рекомендуемую дозу при иммунизации. Охарактеризовано влияние вакцинного штамма ЛК-М на некоторые показатели клеточного иммунитета у свиней. Изучено, что введение этого штамма приводит к увеличению абсолютного количества лимфоцитов крови и вызывает состояние четко выраженной сенсибилизации лейкоцитов.

Ряд проведенных испытаний производственных серий вакцины, изготовленной из штамма ЛК-М вируса классической чумы, на подсвинках показал, что введение вакцинного штамма ЛК-М вируса классической чумы свиней обеспечивал полную защиту подсвинков от экспериментального заражения их контрольным штаммом “Ши - Мынь” уже на 14-тые сутки после вакцинации. Причем, защиту наблюдали даже у животных, получивших только 0,001 прививочной дозы живого вакцинного штамма ЛК-М. За весь период контрольных испытаний у вакцинированных животных не было замечено повышения температуры тела относительно физиологических норм, а также клинических изменений и поведения. При вскрытии вакцинированных животных, подверженных контрольному заражению после окончания экспериментов, не обнаруживали изменений в патанатомической картине, характерных при заболевании классической чумой свиней.

Анализируя результаты лабораторных исследований, связанных с оптимизацией культивирования штамма ЛК-М вируса КЧС, исследований факторов клеточного иммунитета и клинических испытаний, можно сделать заключение о неплохих показателях инфекционной активности штамма ЛК-М вируса КЧС, сочетаемых с высокими иммуногенными его свойствами при достаточно высоком уровне безвредности.

Ключевые слова: классическая чума свиней, штамм ЛК-М, вирус КЧС, клеточная культура из тестикул ягнят, гистохимический вариант иммуноферментного анализа.

Belokon' V.I. Development of Laboratory Regulation of Cultivation of the Vaccine Strain LK-М as Infection Agent of Classical Swine Fever.

The thesis in candidacy for a degree of the candidate of veterinary sciences on a speciality 16.00.03. - Veterinary microbiology and virology. - National Agrarian University, Kiev, 2006.

The thesis is devoted to the development of the culture method of the vaccine strain LK-М as infection agent of classical swine fever.

Due to the thesis investigations the main techniques of the primary obtained cell culture from lambs' testiculus were optimized and the hystochemical kind of ELISA for the detection and titration of the CSF virus in cell culture was created. The working seed of the cell culture of lambs' testiculus was obtained and its main biological properties and sensibility to virus were described.

There were scientifically grounded the methodology of the virus material obtaining (strain LK-M of CSF virus), being sufficiently concentrated. The immunogenecity of the strain LK-M of CSF virus was researched, being obtained from heterologic cell culture of lambs' testiculus. There were described its influence to some cell immunity parameters in swine.

Key words: classical swine fever, strain LK-M, CSF virus, cell culture from lambs' testiculus, hystochemical kind of ELISA.

Размещено на Allbest.ru