Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ ГІГІЄНИ ТА МЕДИЧНОЇ ЕКОЛОГІЇ ім. О.М. МАРЗЕЄВА АМН УКРАЇНИ

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

ОЦІНКА ІМУНОТОКСИЧНИХ ЕФЕКТІВ ЗА КОМБІНОВАНОЇ ПЕРОРАЛЬНОЇ ДІЇ ПРІОРИТЕТНИХ ЗАБРУДНЕНЬ ВОДНОГО СЕРЕДОВИЩА (експериментальні дослідження)

14.02.01 - Гігієна

ГРИГОРЕНКО ЛЮДМИЛА ЄВГЕНІЇВНА

Київ - 2005

Дисертація є рукописом.

Робота виконана в Інституті гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України

Науковий керівник: доктор медичних наук Винарська Олена Іванівна, Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України, завідуюча лабораторією алергено-небезпечних факторів

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Литвиченко Ольга Миколаївна, Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України, головний науковий співробітник лабораторії канцерогенних факторів

доктор медичних наук Мудрий Іван Васильович, Інститут екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України, провідний науковий співробітник відділу гігієни пестицидів і агрохімікатів

Провідна установа: Інститут медицини праці АМН України, лабораторія промислової токсикології, м. Київ

Захист відбудеться “20” січня 2006 р. о 10 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.604.01 Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України за адресою: 02660, м. Київ-94, вул. Попудренка, 50.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України (м. Київ-94, вул. Попудренка, 50).

Автореферат розісланий 14.12.2005 р.

Учений секретар спеціалізованої вченої ради Б.Ю. Селезньов

АНОТАЦІЇ

Григоренко Л.Є. “Оцінка імунотоксичних ефектів за комбінованої пероральної дії пріоритетних забруднень водного середовища (експериментальні дослідження)” - Рукопис.

Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук зі спеціальності 14.02.01 - “гігієна” (біологічні науки) - Інститут гігієни та медичної екології ім. О.М. Марзеєва АМН України, Київ, 2005.

Дисертація присвячена встановленню ролі комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу у формуванні імунного статусу організму.

В експерименті на білих нелінійних щурах вивчали закономірності впливу комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу на імунну систему організму. Хімічні сполуки потрапляли в організм тварин з питною водою.

На основі проведених досліджень виявлено особливості та характер комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу на імунну систему організму та встановлено їх імунопотенціюючий та імуносупресивний ефекти; визначено залежність імунотоксичних проявів від дози та тривалості експозиції вивчених сполук; проведено оцінку значущості для організму змін в імунній системі за комбінованої пероральної дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу.

Ключові слова: водне середовище, нітрит натрію, нітрат натрію, хлороформ, імунний статус, експериментальні тварини.

Григоренко Л.Е. “Оценка иммунотоксических эффектов при комбинированном пероральном воздействии приоритетных загрязений водной среды (экспериментальные исследования)” - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.02.01 - “гигиена” (биологические науки) - Институт гигиены и медицинской экологии им. А.Н. Марзеева АМН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена установлению роли комбинированного действия нитрита, нитрата натрия и хлороформа в формировании иммунного статуса организма.

В эксперименте на белых беспородных крысах изучали закономерности влияния комбинированного действия нитрита, нитрата натрия и хлороформа на иммунную систему. Химические вещества поступали в организм животных с питьевой водой в различных дозах и комбинациях.

На основе проведенных исследований впервые в Украине выявлены особенности и характер комбинированного воздействия нитрита, нитрата натрия и хлороформа на иммунную систему и установлены их иммунопотенциирующий и иммуносупрессивный эффекты. Определена зависимость иммунотоксических эффектов от дозы и длительности экспозиции изученных ксенобиотиков. Проведена оценка значимости для организма изменений в иммунной системе при комбинированном пероральном воздействии нитрита, нитрата натрия и хлороформа.

Установлено, что при комбинированном воздействии изученных веществ ранними и специфическими эффектами были иммуносупрессия по Т-клеточному типу и развитие гиперчувствительности немедленного типа.

Показано, что комбинированное воздействие нитрита, нитрата натрия и хлороформа в течение 1 месяца приводило к развитию аллергической реакции (по P. Gell и R. Coombs) І типа - реагиновый (ГНТ). При увеличении срока воздействия до 6 месяцев развивался еще и ІІІ тип - иммунокомплексный.

При комбинированном пероральном поступлении в организм нитрита и нитрата натрия иммунологическая картина характеризовалась индукцией вторичного иммунодефицита, который охватывает клеточное, гуморальное звенья иммунной системы и систему неспецифических факторов защиты организма. Выраженность эффектов зависела от дозы и продолжительности экспозиции.

Установлено, что изолированное и комбинированное действие нитрита, нитрата натрия и хлороформа приводит к дозо-временной модуляции иммунного ответа. Оценка изменений в иммунной системе при изолированном действии хлороформа свидетельствует о том, что установленная по токсикологическому признаку вредности ПДК этого вещества являетвся безопасной и с учетом иммунологических критериев вредности.

При комбинированном действии нитрита, нитрата натрия и хлороформа даже на уровнях ПДК (для нитритов - 3,3 мг/л; нитратов - 45 мг/л; хлороформа - 0,06 мг/л), раннее обоснованных по токсикологическому признаку вредности, были выявлены изменения в отдельных звеньях иммунной системы. Поскольку у животных, подвергавшихся влиянию изученных соединений в дозах на уровнях 0,5 ПДК, не были выявлены значимые изменения в иммунной системе, концентрации на уровнях ПДК рекомендуется рассматривать как минимально действующие, а 0,5 ПДК - как максимально недействующие.

В период последействия у животных, подвергавшихся влиянию нитрита, нитрата натрия и хлороформа установлена стимуляция Т-клеточного, угнетение гуморального звеньев иммунитета, аутосенсибилизация на фоне эозинофилии и слабо выраженная сенсибилизация к нитросоединениям. Характер и глубина изменений зависели от доз изученных химических веществ и продолжительности периода последействия.

Использование нагрузочного теста Т-зависимым антигеном показало отсутствие полного восстановления функций иммунной системы. Особенности сдвигов зависели от доз действовавших ксенобиотиков. Наиболее неблагоприятные эффекты были установлены после экспозиции концентраций, превышающих гигиенические нормативы.

Нагрузочный тест позволил определить угнетение фагоцитарной активности нейтрофилов, слабо выраженную аутосенсибилизацию и сенсибилизацию к действующим факторам. При воздействии трёхкомпонентной системы ксенобиотиков у животных выявлены более значимые изменения в отдельных звеньях иммунной системы, чем при пероральном поступлении нитрата и нитирта натрия и изолированном - хлороформа. Оценка выраженности иммунологических эффектов по математическим критериям свидетельствовала, что хлороформ при комбинированном воздействии с нитросоединениями производит адъювантное действие.

При гигиенической регламентации для установления иммунотоксических эффектов комбинованого воздействия химических загрязнений водной среды рекомендуются следующие методические подходы: постановку иммуноаллергологических тестов следует проводить через 1 и 6 месяцев воздействия; информативными методами являются: реакция дегрануляции базофилов (тест Шелли), определение количества Т- и В-лимфоцитов, фагоцитарной активности нейтрофильных гранулоцитов, циркулирующих иммунных комплексов; риск возникновения иммунотоксических эффектов рекомендуется определять по реакции иммунной системы на дополнительную нагрузку Т-зависимым антигеном, позволяющую выявить ее птационно-компенсаторные возможности.

Ключевые слова: водная среда, нитрит натрия, нитрат натрия, хлороформ, иммунный статус, экспериментальные животные.

Grigorenko L. “Evaluation of immune toxic effects under combined per oral exposure of the priority water pollutants (experimental researches)”. - Manuscript.

Dissertation is presented for Biological Candidate's Degree by the specialty 14.02.01 - hygiene (biological sciences). - A.N. Marzeyev Institute of Hygiene and Medical Ecology of AMS of Ukraine, Kyiv, 2005.

Dissertation is devoted to the establishment of the role of combined exposure of sodium nitrate, sodium nitrite and chloroform for the forming of organism immune state.

Conformations of combined exposure of sodium nitrate, sodium nitrite and chloroform for the organism immune system have been studied in the experiments on the white outbreed rats. The chemical substances were entered into organism of the animals with drinking water.

The peculiarities and character of the combined exposure of sodium nitrate, sodium nitrite and chloroform for the organism immune system were revealed on the basis of the conducted research. The immune potential and immune suppresive effects of these xenobiotics have been revealed. Dependence of the immune toxic manifestations on the dose and exposure duration of studied compounds was determined. The estimation of significance of changes in the immune system under combined per oral exposure to sodium nitrate, sodium nitrite and chloroform for organism has been carried out.

Key words: water environment, sodium nitrate, sodium nitrite, chloroform, immune state, experimental animals.

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Проблема забезпечення населення України доброякісною питною водою є однією з найбільш важливих економічних і соціальних задач держави. До цієї проблеми сьогодні привернута увага не тільки тому, що вода є незамінною речовиною для життя людини, але й тому, що забруднення джерел водопостачання та питної води істотно визначає ступінь екологічної та епідеміологічної безпеки цілих регіонів, а вживання недоброякісної питної води безпосередньо впливає на стан здоров'я населення (Б.М. Штабський, М.Р. Гжегоцький, В.І. Федоренко, 2004).

Аналіз стану питного водопостачання більшості міст України показав, що якість питної води та рівень її споживання залишаються незадовільними, а в деяких населених пунктах ця проблема набула кризового характеру (Б.М. Штабський, М.Р. Гжегоцький, В.І. Федоренко, 2004; А.Б. Качинський, 2001). Причому, замість традиційних пріоритетів неблагополуччя за показниками загальної жорсткості, вмісту заліза, фтору, санітарно-індикаторних бактерій на перший план вийшли показники вмісту у воді тригалометанів та інших хлорованих вуглеводнів, важких металів, нітритів, вірусів, збудників паразитарних захворювань, сумарної мутагенної активності води, що визначає більш суттєву загрозу здоров'ю населення (Б.М. Штабський, М.Р. Гжегоцький, В.І. Федоренко, 2004).

Актуальність проблеми. Згідно звіту Мінводгоспу за 2000 рік, середньорічний вміст основних забруднюючих речовин у воді багатьох річок перевищував гігієнічні нормативи від кількох до десятків разів (А.Б. Качинський, 2001). За літературними даними, водні об'єкти забруднені переважно амонійним та нітратним азотом, нафтопродуктами, фенолами, іншими органічними речовинами (А.Б. Качинський, 2001). Високі рівні забруднення спостерігалися в рр. Сіверський Донець, Дністер, річках Приазов'я, басейні Західного Бугу, у Південному Бузі, Київському та Канівському водосховищах (В. Жуков, М. Щербань, Ю. Курськой, 2003; М.И. Караяннис, А.Б. Бланк, Л.П. Экспериандова и др., 2002). Крім того, у долинах Сіверського Донця, річок Західного Донбасу, Кривбасу, Криму, Прикарпаття зафіксовано понад двісті осередків стійкого забруднення водних горизонтів, що спричинило забруднення 6% розвіданих запасів підземних вод, а близько 24% опинилися під загрозою якісного виснаження.

Існуюча екологічна ситуація призвела до того, що в Україні воду, яка не відповідає вимогам Державних стандартних правил і норм, п'є кожний п?ятий її житель (А.Б. Качинський, 2001). Згідно думки провідних вчених галузі: “... проблема загострюється ще й тим, що застарілі технології передбачають широке застосування хлору, внаслідок чого у питній воді утворюється велика кількість токсичних хлорорганічних сполук, які характеризуються кумулятивною та канцерогенною дією... Такий незадовільний стан питної води та питного водопостачання позначається на здоров'ї нації, особливо дітей. Неякісна вода є однією з причин того, що в останні роки в Україні спостерігається поширення таких захворювань, як виразкова хвороба шлунку, жовчокам'яна хвороба, стенокардія та інфаркт міокарду, хвороби органів дихання, реєструються непоодинокі спалахи холери та вірусного гепатиту. Все це створить у перспективі загрозливу ситуацію, наслідки якої можуть бути катастрофічними” (Відкритий лист Президенту України Леоніду Даниловичу Кучмі учасників науково-практичної конференції “Вода України: сучасний стан, проблеми, шляхи вирішення”, 2002).

На гостроту проблеми охорони здоров'я населення від негативних наслідків впливу чинників довкілля, у тому числі й водного середовища, вказують і проведені останніми роками клініко-гігієнічні дослідження, за підсумками яких рівень здоров'я ставиться у пряму залежність від інтенсивності, тривалості дії забруднень навколишнього середовища (И.Р. Веккер, Н.П. Сетко, Б.Н. Антоненко, 2001; А.Л. Максимов, 2004).

Важливе значення імунної системи у збереженні здоров'я людей при адаптації до різних умов оточуючого середовищо встановлене чисельними дослідниками (Р.М. Хаитов, Б.В. Пинегин, Х.И. Истамов, 1995; Е.Д. Савилов, С.Н. Жданова, Е.Е. Савилова, 2002). Однак, при регламентації переважної більшості токсикантів довкілля з широкого кола імунотоксичної дії враховується лише їх сенсибілізуючий ефект, у той час як чинники довкілля можуть впливати подвійно. Зокрема, одним з ефектів є імуносупресія, що супроводжується зниженням здатності організму протистояти інфекційним агентам, розвитком пухлин тощо. Іншим - імунопотенціювання, що проявляється як алергія або аутоімунна патологія.

Проблема ускладнюється ще й низьким рівнем знань щодо комбінованої дії антропогенних чинників, а накопичена до цього часу інформація недостатня для прогнозування наслідків впливу найбільш поширених полютантів на рівні порогових та доз, які визначаються у навколишньому середовищі. Між тим відомо, що дія багатокомпонентних систем, навіть за експозиції низьких рівнів окремих інгредієнтів, може спричинити ефекти, за характером і виразністю суттєво відмінні від таких за ізольованої дії (М.М. Коршун, 2002). До того ж факт повсюдного зростання імуноопосередкованої захворюваності населення, у тому числі і в країнах, які володіють високими екологозберігаючими технологіями, змушує звернути особливу увагу на визначення імунотоксичних ефектів за комбінованої дії убіквітарних ксенобіотиків водного середовища.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана згідно з основними напрямками науково-дослідних робіт ІГМЕ АМНУ і є узагальненням НДР Дослідження комбінованої дії нітратно-нітритного навантаження та інших превалюючих забруднень водного середовища на імунну систему організму (№ д/р 0101U001159), виконаної в лабораторії алергено-небезпечних факторів у 2001-2005 рр., в якій автор брала участь як відповідальний виконавець.

Мета роботи - встановити роль комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу у формуванні імунного статусу організму.

У відповідності до поставленої мети дослідження були спрямовані на вирішення наступних завдань:

Вивчити закономірності імунної відповіді за дії нітриту, нітрату натрію та ізольованої - хлороформу.

Встановити дозо-часові закономірності впливу на імунну систему нітриту, нітрату натрію та хлороформу в умовах комбінованого перорального надходження їх до організму.

3. Встановити закономірності ранніх та специфічних проявів впливу нітритно-нітратного навантаження та хлороформу на окремі ланки імунної системи.

4. Визначити значущість для організму змін в окремих ланках імунної системи за ізольованої та комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу.

Об'єкти дослідження - комбінована дія нітриту, нітрату натрію та хлороформу на імунну систему організму.

Предмет дослідження - пріоритетні забруднення водного середовища: нітрит, нітрат натрію та хлороформ.

Об'єм, об'єкти та методи дослідження. Робота містить результати експериментальних досліджень з вивчення закономірностей ранніх та специфічних проявів впливу нітриту і нітрату натрію та хлороформу за їх перорального надходження в організм.

Експериментальні дослідження проводились на білих нелінійних щурах з початковою масою тіла 180-200 г. Хімічні сполуки в різних дозах і комбінаціях надходили в організм тварин з питною водою (нітрит та нітрат натрію на рівні 0,5 ГДК, ГДК, 5 ГДК і 10 ГДК; хлороформ - 0,5 ГДК, ГДК і 5 ГДК).

При розрахунку дози нітриту, нітрату натрію та хлороформу виходили з діючих норм їх вмісту у воді господарчо-питного водовикористання, встановлених ДСанПіНом “Вода питна. Гігієнічні вимоги до якості води централізованого господарсько-питного водопостачання” МОЗ України. Наказ № 383 від 23.12.1996), згідно яких допустимий рівень нітритів становить 3,3 мг/л; нітратів - 45 мг/л; хлороформу - 0,06 мг/л.

У зв'язку з тим, що у тварин, які зазнавали ізольованого та комбінованого впливу вивчених сполук у дозах, на рівні 0,5 ГДК, не було виявлено достовірних змін в жодній з ланок імунної системи, ці результати не наводяться. Таким чином, номери груп розподілилися в наступній послідовності:

- 1 група - контроль, інтактні тварини;

в дослідних групах тварини отримували питну воду із вмістом ксенобіотиків:

- 2 група - N_aNO₂ + N_aNO₃ на рівні ГДК (відповідно, 1,24 мг/кг і 16,9 мг/кг);

- 3 група - N_aNO₂ + N_aNO₃ на рівні 5 ГДК (відповідно, 6,20 мг/кг і 84,5 мг/кг);

- 4 група - N_aNO₂ + N_aNO₃ на рівні 10 ГДК (відповідно, 12,4 мг/кг і 169,0 мг/кг);

- 5 група - хлороформ на рівні ГДК (0,0075 мг/кг);

- 6 група - хлороформ на рівні 5 ГДК (0,038 мг/кг);

- 7 група - хлороформ на рівні ГДК (0,0075 мг/кг), N_aNO₂ + N_aNO₃ - ГДК (відповідно, 1,24 мг/кг і 16,9 мг/кг);

- 8 група - хлороформ на рівні 5 ГДК (0,038 мг/кг), N_aNO₂ + N_aNO₃ - ГДК (відповідно, 1,24 мг/кг і 16,9 мг/кг);

- 9 група - хлороформ на рівні 5 ГДК (0,038 мг/кг), N_aNO₂ + N_aNO₃ - 5 ГДК (відповідно, 6,20 мг/кг і 84,5 мг/кг);

- 10 група - хлороформ на рівні 5 ГДК (0,038 мг/кг), N_aNO₂ + N_aNO₃ - 10 ГДК (відповідно, 12,4 мг/кг і 169,0 мг/кг);

Постановку реакцій здійснювали через 1, 2, 6 місяців дії, а також через 1, 2 місяці відновного періоду та після навантажувального тесту.

Для оцінки можливої імунотоксичної дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу була обрана оптимальна схема, яка забезпечує характеристику різних складових імунної системи. Для цього було застосовано комплекс тестів у мікромодифікації, які характеризуються простотою виконання, загальнодоступністю, інформативністю та потребують малих кількостей крові, що дуже важливо з біоетичної точки зору.

В роботі були використані наступні методи: визначення вмісту лейкоцитів у периферичній крові та їх якісного складу; визначення кількості Т- і В-лімфоцитів; визначення природних кілерів; реакція фагоцитозу, гальмування розпластування макрофагів - гіперчутливість сповільненого типу, дегрануляції базофілів (за Шеллі) - гіперчутливість негайного типу (ГНТ); реакція преципітації циркулюючих імунних комплексів (ЦІК) розчином поліетиленгліколю (ПЕГ) 6000. При визначенні гіперчутливості негайного та сповільненого типів як антигени використвовувались власне гаптени і тканинний антиген. В якості останнього застосовували водно-сольовий екстракт тканини печінки щурів.

Для розв'язання задачі з оцінки значущості для організму змін в імунній системі за ізольованої та комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу в період післядії додатково було застосовано антигенне навантаження завісиною баранячих еритроцитів - Т-залежним антигеном. Вибір антигену був обумовлений його здатністю формувати імунну відповідь за участю всіх ланок імунної системи. Антигенне навантаження здійснювали шляхом підшкірного введення 0,7 мл 25% завісини баранячих еритроцитів. Імунологічне тестування тварин проводили на 9 добу після антигенного навантаження, враховуючи, що саме у цей період має оптимально реєструватися напруженість імунної відповіді.

Для обрахунку результатів були використані загальноприйняті методи статистичної обробки даних медико-біологічних досліджень (з визначенням середньоарифметичних величин показників, стандартної похибки, квадратичного відхилення), параметричні методи перевірки статистичних гіпотез (t-критерій Ст'юдента).

Оцінка комбінованого впливу вивчених сполук здійснювалась на підставі порівняння ефектів, що спостерігалися за комбінованої їх дії, з ефектами ізольованої дії (розрахунки проведено за безпосередньої участі завідуючого відділом медичної інформатики, д.б.н., проф. Антомонова М.Ю.).

Таким чином, для досягнення поставленої у роботі мети - встановлення ролі комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу у формуванні зрушень в імунній системі організму - обрано комплекс імунологічних, алергологічних тестів, які дають можливість всебічно характеризувати порушення в імунній системі організму дослідних тварин під впливом речовин, потенційно володіючих імунотоксичними властивостями. Загальна кількість досліджень - 4 830.

Результати досліджень та їх обговорення.

В результаті проведених експериментів були встановлені як імунопотенціююча, так й імуносупресивна дія, що залежало від дози, комбінації та терміну експозиції вивчених ксенобіотиків, а саме: зміни в імунній системі за комбінованого надходження нітриту та нітрату натрію на рівні ГДК (відповідно, 3,3 мг/л і 45,0 мг/л) протягом 1 місяця проявлялися у зниженні кількісного вмісту Т-клітин. При подовженні терміну впливу до 6 місяців визначалося зменшення числа В-лімфоцитів, пригнічення фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів, підвищення рівня циркулюючих імунних комплексів у крові піддослідних тварин.

Збільшення дози нітросполук до рівня 5 ГДК сприяло стимуляції Т-клітинної ланки імунітету через 2 місяці, а на кінець 6-го місяця дії - зниженню кількості Т- і В-лімфоцитів, що свідчить про пригнічення клітинної та гуморальної ланок імунітету.

Аналіз гематологічних та імунологічних показників у тварин, які вживали воду з нітритом і нітратом натрію у концентраціях, відповідних 10 ГДК, показав, що вже через 1 місяць дії відбувалося вірогідне зменшення числа Т-лімфоцитів, яке у 2-місячний термін змінювалося підвищенням відсотку цих клітин. Після 6 місяців спостерігалося пригнічення і клітинної, й гуморальної ланок імунної системи, що супроводжувалося накопиченням циркулюючих імунних комплексів.

Встановлене накопичення імунних комплексів у 6-місячний термін у щурів, які отримували комбінацію нітриту і нітрату натрію на рівні 1 та 10 ГДК, можна пояснити напруженням гуморальної імунної відповіді, що, можливо, проявляється продукцією імуноглобулінів низької афінності. Не менш важливою причиною накопичення імунних комплексів може бути порушення процесу елімінації ЦІК внаслідок функціональної недостатності клітин, зокрема зниження їх функціональної активності, які несуть Fc-рецептори (насамперед це клітини моноцитарно-макрофагальної системи). З іншого боку, відомо, що ЦІК здатні пригнічувати гуморальну та клітинну імунну реакцію, впливаючи саме на клітини, що несуть Fc-рецептори (крім макрофагів, це Т-супресори, В-лімфоцити).

Експериментальні дослідження свідчать про розвиток сенсибілізації у тварин в усіх вивчених концентраціях. Розвиток аутосенсибілізації, що спостерігався через 1 і 2 місяці комбінованої дії нітросполук, на кінець 6 місяців експозиції зберігався за нітритно-нітратного навантаження на рівні 5 та 10 ГДК і зникав за дії вивчених сполук на рівні гігієнічних нормативів.

Таким чином, представлені вище дані свідчать, що комбінований вплив нітриту і нітрату натрію сприяє розвитку сенсибілізації та аутосенсибілізації, спричиняє імуносупресію клітинної та порушення гуморальної ланок імунної системи, призводить до накопичення циркулюючих імунних комплексів у крові тварин. Причому, слід відмітити, що за комбінованої дії цих сполук в першу чергу спостерігаються зміни з боку популяції Т-лімфоцитів, а вже потім приєднуються порушення В-клітинної ланки імунітету. Виразність і направленість імуномодулюючих ефектів залежали від дози і тривалості впливу.

Результати досліджень після 1 місяця відновного періоду свідчать, що стан імунної системи тварин після перорального надходження нітриту, нітрату натрію на рівні ГДК (відповідно, 3,3 мг/л і 45,0 мг/л) цілком не відновлювався і характеризувався напруженням у Т-клітинній ланці імунітету та сенсибілізацією за негайним типом. Через 2 місяці припинення дії ксенобіотиків в цій групі продовжували визначатися зрушення в системі неспецифічних факторів захисту організму, а також сенсибілізуючий ефект.

У щурів, які зазнавали нітритно-нітратного навантаження на рівні 5 ГДК, через 1 місяць післядії зберігалося пригнічення гуморальної ланки імунітету, а також сенсибілізація та аутосенсибілізація. Через 2 місяці післядії у тварин цієї групи продовжувала спостерігатися імуносупресія за В-клітинним типом.

У щурів, які підлягали комбінованій дії нітрату і нітриту натрію на рівні 10 ГДК, через 1 місяць після закінчення експозиції відмічалось зменшення загальної кількості лімфоцитів, а через 2 місяці - пригнічення В-лімфоцитів.

Для оцінки значення змін, які відбулися в імунній системі за комбінованої дії нітриту і нітрату натрію, було здійснено додаткове навантаження Т-залежним антигеном. Застосування методу дало змогу виявити активацію клітинної ланки імунітету і розвиток сенсибілізації до нітриту і нітрату натрію у тварин, що отримували нітрит і нітрат натрію на рівні гігієнічних нормативів. У тварин, що підлягали дії нітриту і нітрату натрію на рівні 5 ГДК відзначалися імунологічна недостатність за Т-клітинним типом та підвищення рівня циркулюючих імунних комплексів. Зміни в імунній системі щурів, які отримували нітрат і нітрит натрію у дозах, відповідних 10 ГДК, після навантажувального тесту характеризувалися напруженням гуморальної ланки імунітету та розвитком слабкої аутосенсибілізації.

Отримані результати узгоджуються з літературними даними. Так, більшість робіт, присвячених вивченню впливу нітритів та нітратів, вказують на небезпеку проміжних продуктів їх метаболізму канцерогенних нітросполук і свідчать про імуносупресивну дії нітритно-нітратного навантаження з наступним розвитком пухлинного процесу (С.В. Лебедев, В.П. Чехонин, А.В. Прыгун, 1987). Проведені нами дослідження підтвердили розвиток імуносупресії за Т-клітинним типом та накопичення імунних комплексів при комбінованій дії нітриту і нітрату натрію на організм на рівні 110 ГДК через 6 місяців експозиції, що імовірно може сприяти розвитку пухлин.

У ході досліджень було встановлено зниження кількості В-лімфоцитів на кінець експерименту. Крім того, у тварин визначалась наявність ГНТ. Отримані дані співзвучні з результатами досліджень О.Б. Білової (1999), яка, вивчаючи експресію маркерів диференціювання В-лімфоцитів, установила, що в периферичній крові пацієнтів з атопією у період загострення відсутня експресія маркерів, які визначаються за допомогою моноклональних антитіл ІПО-3 та ІПО-10. У них виявляються лише маркери, що визначаються за участю ІПО-24 (маркер активації), кількість котрих в гострому періоді зростає. Це свідчить про відсутність у крові хворих з атопією зрілих форм В-лімфоцитів. В той же час, в препаратах значно збільшувався вміст плазматичних клітин. Автор припускає, що ГНТ супроводжується активацією В-лімфоцитів та збільшенням їх диференціювання у плазматичні клітини. Таким чином, зменшення числа В-клітин у щурів за дії нітритно-нітратного навантаження може відбуватися за рахунок зниження експресії поверхневих маркерів на В-лімфоцитах у зв'язку з їх трансформацією у плазматичні клітини, які продукують антитіла реагінового типу, що відповідають за розвиток ГНТ.

Отримані нами дані узгоджуються з результатами обстеження дітей, які мешкають в районі з підвищеним вмістом нітратів у питній воді (S.K. Gupta, R.C. Gupta, A.B. Gupta et al., 2000). У дітей частіше (у 3-4 рази) реєструвалися захворювання, зумовлені вірусами і хламідіями, тобто внутрішньоклітинними паразитами, які є Т-залежними антигенами. Крім цього, у 26 разів частіше, в порівнянні з мешканцями екологічно ??чистих?? районів, виявлялися інфекційно-запальні захворювання бактеріальної та змішаної бактеріально-вірусної етіології. Імунологічні дослідження встановили диспропорцію імунорегуляторних субпопуляцій лімфоцитів, високий рівень спонтанного бластоутворення Т-лімфоцитів, IgE-гіперімуноглобулінемію. Це свідчить про дисадаптацію імунної системи організму в екологічно несприятливих умовах.

В наступній серії експериментальних досліджень було вивчено розвиток імунологічних ефектів за ізольованої та комбінованої дії нітриту і нітрату натрію та хлороформу.

Отримані результати ізольованого впливу хлороформу на рівні гранично допустимої концентрації (0,06 мг/л) протягом 1 місяця свідчать, що у дослідних тварин спостерігався розвиток сенсибілізації та аутосенсибілізації слабкого ступеня виразності (рис.1).

імунотоксичний натрій хлороформ пероральний

Примітка. Від 10 до 20% - реакція слабко позитивна; від 20 до 30% - реакція позитивна; >30% - реакція різко позитивна

При підвищенні концентрації хлороформу до рівня 5 ГДК разом з розвитком слабковираженої сенсибілізації та аутосенсибілізації реєструвалося пригнічення функціональної активності нейтрофільних гранулоцитів та збільшення числа Т-лімфоцитів.

Дослідження комбінованого впливу суміші ксенобіотиків на рівні гігієнічних нормативів кожного з інгредієнтів через 1 місяць експозиції виявило підвищення кількості нейтрофільних гранулоцитів, пригнічення гуморальної ланки імунної системи, розвиток сенсибілізації та аутосенсибілізації. Слід відмітити, що комбінована дія нітриту, нітрату натрію та хлороформу викликала більш виразні зрушення в імунній системі, ніж комбінована - дія тільки нітросполук або ізольована - хлороформу (рис.2).

Зрушення, які відбувалися в організмі тварин через 1 місяць споживання питної води із вмістом нітриту, нітрату натрію на рівні ГДК і хлороформу на рівні 5 ГДК, характеризувалися розвитком лейко- та лімфопенії, збільшенням вмісту Т- і зменшенням - В-лімфоцитів, пригніченням фагоцитарної активності нейтрофілів, розвитком ГНТ до діючих чинників.

Комбінована дія вивчених сполук на рівні 5 ГДК сприяла розвиткові лейкопенії, лімфоцитозу, нейтропенії, яка супроводжувалась зниженням функціональної активності фагоцитів, розвитком ГНТ.

За дії максимальної концентрації нітриту і нітрату натрію на рівні 10 ГДК та хлороформу на рівні 5 ГДК, у тварин визначалося пригнічення фагоцитарної активності нейтрофілів. Крім того, до вираженого сенсибілізуючого ефекту преєднувалась ще й аутосенсибілізація.

Сумуючи отримані дані, можна відмітити більший спектр і глибину зрушень в усіх ланках імунної системи за комбінованого надходження в організм хлороформу та нітрату і нітриту натрію, чим за ізольованого впливу хлороформу.

Результати дослідження при подовженні впливу ксенобіотиків до 2 місяців свідчать про наростання ефектів саме за комбінованої дії хімічних речовин. Так, якщо в групі тварин, що зазнавали ізольованого впливу хлороформу на рівні 5 ГДК, на кінець 2 місяця було зафіксовано вірогідне підвищення лише відсотку активно фагоцитуючих клітин крові, то в усіх дослідних групах тварин, які зазнавали комбінованого впливу трьохкомпонентної системи ксенобіотиків, було встановлено більш широкий спектр відхилень в різних ланках імунної системи та неспецифічних факторів захисту.

У щурів, що отримували хлороформ на рівні 5 ГДК та нітрит і нітрат натрію - ГДК, виявлялася лейко- та лімфопенія, збільшення числа нейтрофільних гранулоцитів та В-лімфоцитів. Збільшення доз усіх сполук до рівня 5 ГДК призводила до зростання лише відсотку нейтрофілів. У групі тварин, які отримували максимальні дози досліджених речовин (хлороформ на рівні 5 ГДК, нітрит і нітрат натрію - 10 ГДК), збільшення кількості нейтрофільних гранулоцитів супроводжувалось зниженням їх фагоцитарної активності та підвищенням відсотку В-клітин.

Крім того, у тварин за комбінованої дії хлороформу й нітросполук у дозах, що відповідають 5 ГДК кожного з інгредієнтів, відбувалося наростання сенсибілізуючого ефекту до нітросполук та аутосенсибілізації, тоді як за найбільшого навантаження нітросполуками (10 ГДК), навпаки, сила реакції ГНТ до хлороформу та тканинного антигену змінювалась з позитивної в 1-му місяці до слабкопозитивної, що може свідчити про початок розвитку високодозної толерантності.

Таким чином, через 2 місяці комбінованої дії хлороформу та нітриту, нітрату натрію виявлено зміни в різних ланках імунної системи, спектр і виразність яких залежали від дози ксенобіотиків та їх співвідношення в комбінації.

Визначення показників імунного статусу тварин через 6 місяців ізольованої дії хлороформу показало зниження в крові відносного й абсолютного числа В-лімфоцитів, абсолютної кількості нейтрофілів та пригнічення їх фагоцитарної активності, розвиток слабко вираженої ГНТ до хлороформу (рис.3).

Введення у комбінацію з хлороформом нітриту та нітрату натрію виявило, що навіть на рівні ГДК розширювався спектр зрушень в імуній системі та посилювався імуносупресивний ефект. Це проявлялося у зниженні абсолютного вмісту лімфоцитів, кількості як В-, так і Т-клітин, нейтрофільних гранулоцитів та пригніченні їх фагоцитарної активності (рис.4).

Як відомо, в реалізації імуносупресивного ефекту ксенобіотиків важливу роль відіграє порушення процесів імунорегуляції. Так, на думку деяких вчених (P. Schalte, L.F. Mazzuckelli, 1991), в основі встановленого дозо-залежного імуносупресивного ефекту нітрозамінів лежить порушення взаємодії між Т- і В-лімфоцитами. Однак, розглядаючи імунодепресивну дію токсикантів, необхідно пам'ятати, що ефект залежить від багатьох факторів, зокрема концентрації хімічних сполук та тривалості дії. В залежності від цього ксенобіотики можуть впливати на мітоген-індуковану проліферацію Т- і В-клітин, порушувати реакцію на алоантигени, Т-залежну та Т-незалежну диференціацію, здатність попередників В-клітин продукувати антитіла.

Збільшення дози нітриту, нітрату натрію до рівня 5 ГДК в комбінації з хлороформом на фоні імуносупресії за Т- і В-клітинним типами сприяло розвитку сенсибілізації та аутосенсибілізації організму. Підвищення дозування нітриту, нітрату натрію до рівня 10 ГДК в суміші призводило до посилення виразності ефекту ГНТ.

Слід також відмітити, що за нітратно-нітритного навантаження на рівні ГДК та 10 ГДК було встановлено зростання рівнів імунних комплексів.

Таким чином, можна дійти висновку, що розвиток більш глибоких зрушень як в системі імунологічного нагляду, так і неспецифічних факторів захисту організму виявлявся у тварин, які зазнавали комбінованої дії суміші ксенобіотиків. Причому, на кінець 6-го місяця експозиції нітриту, нітрату натрію та хлороформу в різних дозах і комбінаціях виявлені зміни мали односпрямований характер - спостерігалося зниження кількості імунокомпетентних клітин та пригнічення їх функціональної активності, що може свідчити про розвиток імунологічної недостатності.

Використання математичних критеріїв оцінки комбінованого впливу нітриту, нітрату натрію та хлороформу на імунну систему тварин дозволило встановити виразність імунотоксичних ефектів за дії вивчених ксенобіотиків. Результати такої оцінки представлені у таблицях А.1-А.15 додатку А. Оцінка комбінованої дії вивчених сполук за математичними критеріями підтвердила результати, отримані при оцінці біологічних ефектів і може свідчити, що хлороформ за комбінованої дії з нітросполуками спричиняє ад'ювантну дію в аспекті імунотоксичності.

Застосування методу антигенного навантаження у період післядії дозволило встановити стійкість зрушень в імунній системі. У тварин визначалося пригнічення неспецифічних факторів захисту організму за комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу на рівні 5 ГДК, та розвиток сенсибілізації й аутосенсибілізації за комбінації нітросполук на рівні ГДК та 10 ГДК і 5 ГДК - хлороформу.

Отримані нами дані відповідають сучасним уявленням щодо негативних наслідків хронічної дії убіквітарних забруднень навколишнього середовища на організм і підтверджують результати епідеміологічних досліджень стосовно імунотоксичного впливу низки ксенобіотиків, зокрема розвитку імуносупресивних, сенсибілізуючих та аутоімунних ефектів (S.K. Gupta, R.C. Gupta, A.B. Gupta et al., 2000; К.В. Пікуль, 2002; О.В. Горішна, О.І. Цебержинський, В.М. Горішний, 2001; А.П. Ильницкий, В.А. Юрченко, Г.Ф. Жукова и др., 1989).

Обговорюючи можливі механізми токсичної дії широко розповсюджених полютантів довкілля, у тому числі забруднень водного середовища, слід зазначити, що на сьогоднішній день відомо, що порушення гомеостазу, які виникають внаслідок впливу зовнішніх чинників різного походження, через вищі регуляторні механізми активують системи, відповідальні за адаптацію та формування гомеостатичної реакції організму. Остання передбачає як обов'язковий елемент гомеостатичні механізми детоксикації. Екзогенні та ендогенні чинники хімічного походження, втручаючись у молекулярні механізми функціонування біохімічних систем, змінюють фізіологічні механізми підтримання гуморального, клітинного і тканинного гомеостазу, що проявляється певними порушеннями на відповідних рівнях ієрархічної структурної організації. Першою стадією метаболізму ксенобіотиків є їх біохімічна трансформація за участю цитохромів Р-450, внаслідок якої можуть утворюватися реактивні метаболіти, які, з'єднуючись з молекулою того ізоферменту, що каталізує їх перетворення, утворюють аутоантигенний комплекс, на який імунна система реагує аутоімунною відповіддю. Хоча перша стадія метаболізму ксенобіотиків відбувається переважно в печінці, важливе значення має і позапечінкове їх окислення, в якому велику роль відіграють резидентні фагоцити. Мішенню для хімічних речовин можуть бути клітинні елементи імунної системи - тучні клітини, базофіли, еозинофіли, лімфоцити, макрофаги, тромбоцити та деякі фізіологічні процеси в ній, зокрема, фагоцитоз, що лежить в основі розвитку алергічних та аутоімунних реакцій. Алергічні ефекти, як правило, проявляються при дії хімічних речовин в концентраціях і дозах нижче порогів токсичної дії. Окрім того відомо, що лише незначна кількість ксенобіотиків здатна сенсибілізувати організм безпосередньо і бути імуногенами в нативному стані. Більшість же трансформується в антигени та алергени в процесі метаболічної активації. Саме такі хімічні алергени зумовлюють помітне зростання гіперчутливості населення (О.Б. Леоненко, В.А. Стежка, 2004).

В наш час широко обговорюється участь метаболічних, зокрема вільнорадикальних процесів у імунорегуляції. Показано, що ініціація вільнорадикального окислення необхідна як додатковий сигнал для утворення ІЛ-2 та ІЛ-3. Але за надмірного їх накопичення в організмі може порушуватись стан ліпідного комплексу та антиоксидантна резистентність мембран імунокомпетентних клітин, що, вірогідно, взаємозв'язано із синтезом ДНК та РНК у Т- і В-лімфоцитах (Г.Б. Афонина, Е.В. Русин, А.В. Павлович, 1999), а звідси й змінюватись їх функціональна активність. Встановлено, що біологічний ефект токсикантів на імунну систему може виражатися в супресії чи стимуляції імунобіологічної реактивності організму та її модифікації. Але безпосередні та віддалені наслідки взаємодії ксенобіотиків з клітинними елементами імунної системи часто непередбачувані, і розподіл хімічних сполук на імуностимулятори чи імунодепресанти має досить умовний характер. Одні й ті ж сполуки, в залежності від дози, тривалості дії та функціонального стану імунної системи, можуть викликати як стимулюючий, так і супресивний ефекти (Г.Б. Афонина, Е.В. Русин, А.В. Павлович, 1999).

Враховуючи, що більшість чинників хімічного походження, які справляють сенсибілізуючу та/або імуносупресивну дію на імунну систему людини, здатні викликати подібні ефекти й у тварин в експерименті, отримані дані при проведенні імунотоксикологічних досліджень є важливим компонентом в оцінці ризику розвитку екологічно зумовлених імуноопосередкованих захворювань.

Таким чином, проведені дослідження з вивчення пероральної комбінованої дії низки хімічних забруднень водного середовища свідчать, що наявність сенсибілізуючих та імуномодулюючих ефектів є одним з важливих критеріїв оцінки біологічної дії хімічних факторів на організм. Причому, ефект імунотоксичності може спостерігатися у дозах нижчих, ніж проявляється загальнотоксична дія. Саме тому, імунотоксична дія хімічних сполук повинна обов'язково враховуватися при оцінці шкідливості ксенобіотиків навколишнього середовища.

ВИСНОВКИ

2. За комбінованої дії нітриту, нітрату натрія та хлороформу після 1 місяця надходження до організму спостерігався розвиток алергічної реакції (за P.Gell та R.Coombs) І типу - реагіновий (ГНТ). За подовження терміну впливу до 6 місяців визначався ще й ІІІ тип - імунокомплексний.

3. Імунологічна картина, яка розвивалася за комбінованої дії нітриту, нітрату натрія, характеризувалася індукцією вторинного імунодефіциту, що охоплює клітинну, гуморальну ланки імунної системи та систему неспецифічних факторів захисту організму. Характер проявів залежав від дози та тривалості експозиції.

Використання у відновний період антигенного навантаження Т-залежним антигеном дозволило встановити відсутність повного відновлення функцій імунної системи. Особливості зрушень залежали від доз діючих ксенобіотиків, а за характером та глибиною найнесприятливішими були за впливу концентрацій, що перевищували гігієнічні нормативи.

4. Встановлено, що ізольована і комбінована дія нітриту і нітрату натрія та хлороформу призводила до дозо-часової модуляції імунної відповіді. Оцінка змін в імунній системі за ізольованої дії хлороформу показала, що встановлена за токсикологічною ознакою шкідливості ГДК цієї сполуки є безпечною і з урахуванням імунологічних критеріїв шкідливості.

Показано, що за комбінованої дії нітриту, нітрату натрію та хлороформу навіть на рівнях ГДК (для нітритів - 3,3 мг/л; нітратів - 45 мг/л; хлороформу - 0,06 мг/л), які раніше були обґрунтовані за токсикологічною ознакою шкідливості, виявлялися зміни в окремих ланках імунної системи. Оскільки у тварин, що зазнавали впливу вивчених сполук у дозах на рівнях 0,5 ГДК, не було виявлено значущих змін в імунній системі, концентрації на рівнях ГДК рекомендується розглядати як мінімально діючі, а 0,5 ГДК - як максимально недіючі.

5. Встановлено, що у відновний період після комбінованої дії нітрату, нітриту натрія та хлороформу у тварин спостерігалися стимуляція Т-клітинної, пригнічення гуморальної ланки імунітету, слабко виражена ГНТ до нітросполук та аутосенсибілізація на тлі еозинофілії. Характер і глибина зрушень залежали від доз хімічних речовин та тривалості періоду післядії. Використання антигенного навантаження дозволило встановити пригнічення фагоцитарної активності нейтрофілів, слабко виражену сенсибілізацію до хлороформу, нітросполук та аутосенсибілізацію.

В організмі тварин, які зазнавали дії трьохкомпонентної системи ксенобіотиків, було виявлено більш значущі зрушення, ніж за комбінованої дії лише нітрату і нітирту натрія або ізольованої - хлороформу.

6. Для виявлення імунотоксичних ефектів за перорального комбінованого надходження в організм хімічних забруднень при гігієнічній регламентації рекомендуються слідуючі методичні підходи: постановку комплексу імуноалергологічних тестів необхідно проводити через 1 та 6 місяців впливу; найбільш інформативними методами є - реакція дегрануляції базофілів (тест Шеллі), визначення вмісту Т- і В-лімфоцитів, фагоцитарної активності нейтрофільних гранулоцитів, циркулюючих імунних комплексів; ризик виникнення імунотоксичних ефектів визначається реакцією імунної системи на додаткове навантаження Т-залежним антигеном, яке дозволяє оцінити її компенсаторно-пристосовчі можливості.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗДОБУВАЧА ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Вплив комбінованої дії нітритно-нітратного навантаження на імунну систему організму лабораторних тварин / О.І. Винарська, Н.О. Ніконова, Л.Є. Григоренко, І.В. Кононко // Гігієна населених місць: Збірник наукових праць. - К., 2002. - Вип. 39. - С.133-138. Дисертантом виконано аналіз літератури, всі експериментальні дослідження та проаналізовано представлений матеріал, підготовлено матеріал до опублікування.