Размещено на http://www.allbest.ru

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІнСтитут експериментальної патології, ОНКОЛОГІЇ І радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

КУЦЕНОК ВАДИМ ВАСИЛЬОВИЧ

УДК:616-006:615.831:547.979.733:616-092.4+.9

ЕФЕКТИВНІСТЬ ФОТОДИНАМІЧНОЇ ТЕРАПІЇ ПУХЛИН З ВИКОРИСТАННЯМ 5-АМІНОЛЕВУЛІНОВОЇ КИСЛОТИ

(експериментальне дослідження)

14.01.07 - онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2005

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України.

Науковий керівник - доктор біологічних наук, професор

Гамалія Микола Федорович,

завідувач відділу клітинної фотобіології та фотомодуляції пухлинного росту Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор

Кулик Галина Іванівна,

провідний науковий співробітник відділу механізмів протипухлинної терапії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;

доктор медичних наук

Баглій Євген Ананійович,

завідувач лабораторії канцерогенезу, тератогенезу та токсикології репродуктивної функції Інституту екогігієни і токсикології ім. Л.І. Медведя МОЗ України.

Провідна установа Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, кафедра онкології, м. Київ.

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради

доктор медичних наук Н.В.Бородай

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність проблеми. Останнім часом інтенсивно розвивається новий метод лікування злоякісних новоутворень - фотодинамічна терапія (ФДТ). Метод ґрунтується на застосуванні фотосенсибілізаторів, які мають властивість вибірково накопичуватись в клітинах злоякісних пухлин та при дії світлового (лазерного) випромінювання в присутності кисню викликати фотохімічні реакції, що призводять до селективого руйнування пухлинних клітин. протипухлинний антиметатстатичний фотодинамічний пухлоносій

Впровадження в клінічну практику методу ФДТ у передових західних країнах дозволило покращити якість надання радикальної і паліативної допомоги онкологічним хворим (Соколов В.В., 2001, Dougherty T.J., 1998, Macdonald L.G., 2001). Безсумнівною перевагою методу ФДТ перед іншими методами лікування злоякісних новоутворень (хіміотерапією, променевою терапією та ін.) є цілеспрямований вплив на пухлину без ушкодження оточуючих тканин. Така селективність у світловому пошкодженні пухлинної тканини ґрунтується на тому, що фотосенсибілізатор після введення в організм затримується більше в злоякісних пухлинах, та на відсутності у методу значних побічних ефектів. Застосування ФДТ дає можливість в певних (зокрема, при ранніх стадіях раку) випадках замінювати широке хірургічне втручання порівняно простою, мало травматичною процедурою лазерного опромінення пухлини безпосередньо, якщо вона розташована зовні, або через ендоскопічний прилад, якщо пухлина знаходиться у порожнинних органах (бронхах, стравоході, шлунку, прямій кишці, сечовому міхурі тощо).

Дослідження останніх років в області ФДТ дозволили сформулювати вимоги до оптимального фотосенсибілізатора: інтенсивне поглинання світла в тій ділянці спектрального діапазону, де біологічні тканини найбільш прозорі для проникнення оптичного випромінювання; високий рівень утворення синглетного кисню; чітко виражена селективність накопичення препарату в пухлинах у порівнянні з навколишніми макроскопічно незміненими тканинами; порівняно швидке виведення його з організму; низька токсичність. Але гематопорфірин-дериват -фотосенсибілізатор, який найбільш часто застосовується нині, лише частково відповідає цим вимогам. Цей препарат порівняно тривало (тижні, іноді місяці) затримується в організмі, спричиняючи у пацієнтів світлову чутливість шкіри (Миронов А.Ф., 1992, Ackroyd R., 2001).

Таким чином, створення та запровадження в клінічну практику оптимальних фотосенсибілізаторів для ФДТ, які б селективно накопичувались у пухлинній тканині, мали високу фотодинамічну протипухлинну активність і швидко виводились з організму, становить актуальну проблему сучасної світової онкології. Незважаючи на те, що метод ФДТ в Україні поки що взагалі відсутній, саме в нашій країні, в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ (ІЕПОР НАНУ) були розпочаті перші у колишньому СРСР досліди щодо розробки лазерної фотодинамічної терапії пухлин (Гамалея Н.Ф., 1988).

Найбільш перспективним напрямом досліджень, що виконуються останнім часом в ІЕПОР НАНУ, слід вважати вивчення ефективності ФДТ з використанням нового фотосенсибілізуючого препарату другого покоління - 5-амінолевулінової кислоти (5-АЛК). Сама по собі 5-АЛК не є фотосенсибілізатором, але приймаючи участь у біосинтезі гема, вона індукує синтез протопорфіринa IX, якому притаманні фотосенсибілізуючі властивості (Fukuda H., 2005). Перевагами 5-АЛК є те, що вона, як водорозчинна сполука, може бути застосована не тільки системно (внутрішньовенно, перорально), але й місцево (аплікаційно, внутрішньопухлинно) у вигляді ін`єкцій, аплікацій або навіть крему. Важливо також, що вона залишається в організмі не тижні і місяці, як гематопорфірин-дериват, а тільки одну добу, і не спричиняє тривалої фоточутливості шкіри у хворого.

Все вище зазначене і обумовлює актуальність розробки в Україні методу ФДТ злоякісних пухлин з використанням вітчизняного фотосенсибілізатора 5-АЛК.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота виконана у відповідності з планами науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за темою: "Створення нових технологій фотодинамічної терапії онкологічних хворих на основі застосування сенсибілізаторів ендогенного походження" (№ держреєстрації - 0103U000788, 2003-2005 р.р.) та темою "Розробка методу застосування фотосенсибілізуючого препарату 5-АЛК у лікуванні хворих на гемобластози: фотодинамічна елімінація пухлинних клітин з кісткового мозку при його аутотрансплантації" (№ держреєстрації - 0104U006133, 2004-2006 р.р.), що входить до складу комплексної програми НАН України "Новітні медико-біологічні проблеми та оточуюче середовище людини", Розділ 2 "Біологічно активні речовини для здоров`я людини".

Мета дослідження: експериментальне вивчення протипухлинної і антиметастатичної ефективності, імунологічних, морфологічних та ангіогенезо-залежних особливостей впливу на організм фотодинамічної терапії із застосуванням нового фотосенсибілізатора другого покоління - 5-амінолевулінової кислоти.

Задачі дослідження:

1. Дослідити токсичність 5-АЛК у порівнянні з препаратом-аналогом „Аласенсом”.

2. Вивчити фотодинамічне пошкодження пухлинних клітин in vitro при використанні 5-АЛК.

3. Дослідити на моделях перещеплюваних пухлин (карцинома легенів Льюїс, саркома 180, солідний варіант раку Ерліха) антибластомну ефективність ФДТ-АЛК при різних способах введення фотосенсибілізатора.

4. Вивчити антиметастатичний ефект ФДТ-АЛК на мишах з карциномою Льюїс.

5. Провести морфологічне дослідження перещеплюваних пухлин у тварин, які були піддані ФДТ-АЛК.

6. Дослідити вплив ФДТ-АЛК на рівень фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF) в крові мишей з карциномою Льюїс.

7. Охарактеризувати стан імунологічної реактивності тварин-пухлиноносіїв в процесі ФДТ.

Об'єкт дослідження: Клітини лімфоми мишей NK/Ly, асцитного варіанта раку Ерліха та В-клітинної лінії лімфоцитів людини Namalwa; перещеплювані пухлини - метастазуюча карцинома легенів Льюїс, саркома 180, солідний варіант раку Ерліха.

Предмет дослідження: протипухлинна фотодинамічна активність 5-АЛК у дослідах на мишах з перещеплюваними пухлинами, а також на малігнізованих клітинах in vitro.

Методи дослідження: методи експериментальної онкології - для оцінки протипухлинного та антиметастатичного ефектів лікування; морфологічний метод - для вивчення ознак лікувального патоморфозу в експериментальних пухлинах; імунологічні методи - для визначення показників імунологічної реактивності тварин; імуноферментний метод - для визначення рівня фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF) в сироватці крові експериментальних тварин з пухлинами; статистичні - для обробки та аналізу отриманих даних.

Наукова новизна дослідження:

Вперше експериментально досліджено ефективність фотодинамічної терапії пухлин з використанням фотосенсибілізатора 5-АЛК вітчизняного виробництва. Встановлено значне пригнічення росту пухлин та процесу метастазування після ФДТ-АЛК при внутрішньочеревному, пероральному, внутрішньопухлинному та аплікаційному застосуванні фотосенсибілізатора.

Вивчено динаміку змін деяких показників імунологічної реактивності тварин-пухлиноносіїв в різні строки після проведення ФДТ-АЛК. Показано, що найбільш швидко активуються локальні фактори неспецифічної резистентності, що проявляється ранньою (перші хвилини після опромінення) масивною інфільтрацією пухлини клітинами мієлоцитарної ланки; з часом в імунну відповідь на ФДТ-АЛК залучаються реакції адаптивного імунітету, про що свідчать посилення інфільтрації пухлин лімфоцитами, відновлення функціонального резерву перитонеальних макрофагів, гальмування пухлиноіндукованої інволюції тимусу та стимуляція проліферативної активності циркулюючих Т-лімфоцитів.

Вперше показано, що метод ФДТ-АЛК значно гальмує процес васкуляризації легеневих метастазів у мишей з карциномою Льюїс та призводить до зниження в крові рівня фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF).

Практичне значення одержаних результатів. Результати дисертаційної роботи є експериментальним обґрунтуванням розробки для практичної онкології України нового методу фотодинамічної терапії злоякісних пухлин з використанням вітчизняного фотосенсибілізатора другого покоління 5-АЛК.

Виявлена внаслідок експериментальних досліджень виражена протипухлинна і антиметастатична активність методу ФДТ-АЛК свідчить про те, що вітчизняний фотосенсибілізатор 5-АЛК може бути рекомендований для ФДТ злоякісних новоутворень. Отримані дані увійшли до пакету матеріалів, оформлених для передачі у Державний фармакологічний центр міністерства охорони здоров'я України з метою проведення I фази клінічних випробувань методу ФДТ-АЛК.

Важливим з практичної точки зору є і те, що визначені імунологічні та ангіогенезо-залежні особливості впливу на організм фотодинамічної терапії із застосуванням 5-АЛК.

Отримані теоретичні та практичні дані рекомендовано до включення в педагогічний процес кафедр онкології вищих учбових медичних закладів України.

Особистий внесок здобувача. Внесок автора полягає в постановці мети, формуванні програми, завдань, обсягу та методів дослідження. Автором особисто зібрана та проаналізована сучасна література за темою дисертації. Всі дослідження виконувались при безпосередній участі здобувача. Дисертантом самостійно проведені науковий та статистичний аналіз даних, теоретичне узагальнення результатів роботи, сформульовано основні положення та висновки дисертаційної роботи.

Апробація результатів досліджень. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на: V конференції молодих онкологів України "Сучасні аспекти експериментальної та клінічної онкології" (Київ, 2002); науково-практичній конференції з міжнародною участю „ОНКОЛОГІЯ - ХХІ” (Київ, 2003); IV міжнародному симпозіумі "Актуальные проблемы биофизической медицины" (Київ, 2004); I Всеукраїнській науково-практичній конференції "Вітчизняні протипухлинні препарати: аналіз сьогодення та погляд у майбутнє" (Київ, 2004).

Публікації. Основний зміст дисертаційної роботи викладений у 9 публікаціях, в тому числі в 5 статтях у провідних фахових журналах та 3 тезах у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, розділу „Матеріали та методи досліджень”, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення одержаних результатів, висновків та списку використаної літератури. Основний зміст дисертації викладений на 152 сторінках машинописного тексту, містить 15 таблиць та 34 рисунки. Список використаних джерел включає 217 найменувань, з них 27 російською та українською мовами та 190 англійською мовою.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. У дослідах використовувались клітини лімфоми мишей NK/Ly, асцитного варіанту раку Еріха мишей та В-клітинної лінії малігнізованих лімфоцитів людини Namalwa; метастазуюча карцинома легенів Льюїс, саркома 180, рак Ерліха (солідний варіант), що перещеплювались на мишах ліній С₅₇Bl/6, BALB/c та безпородних розводки віварію ІЕПОР ім. Р.Є.Кавецького НАН України. Утримання мишей та робота з ними здійснювались у відповідності до міжнародно прийнятих правил проведення робіт з експериментальними тваринами.

В якості фотосенсибілізатора застосовували гідрохлорид 5-амінолевулінової кислоти (5-АЛК), який був синтезований в Інституті органічної хімії НАН України. Для порівняння використовували у тих же дозах офіцинальний препарат „Аласенс” (гідрохлорид 5-амінолевулінової кислоти) виробництва ГНЦ "НИОПИК" (Росія).

У дослідах in vitro малігнізовані клітини у кількості 2х10⁶/мл інкубували з 5-АЛК в розчині Хенкса без фенолового червоного на протязі 4 год при 37єС. Потім клітини відмивали від 5-АЛК і переносили в середовище RPMI-1640 з 10% ембріональної сироватки теляти, опромінювали лазерним світлом і залишали інкубуватись при 37єС на протязі 20 год. Використовували випромінювання гелій-неонового лазера ЛГ-111 (довжина хвилі 633 нм) при дозі опромінення 25-150 Дж/см². Кількість загиблих клітин визначали за допомогою тесту з трипановим синім.

В експериментах на тваринах 5-АЛК вводили системно (перорально, внутрішньочеревно) і місцево (внутрішньопухлинно), а також зовнішньо у складі мазі за 4 години до ФДТ. Перед сеансом ФДТ у зоні росту пухлини видаляли шерсть шляхом депіляції.

Для проведення ФДТ тваринам давали ефірний наркоз і фіксували на розтяжках. ФДТ проводили на 6-й день (для саркоми 180 і солідного варіанту раку Ерліха) або 12-й день (для карциноми Льюїс) після перещеплення пухлини, коли розміри пухлин у діаметрі досягали 0,7±0,1 см.

Досліди з ФДТ проводили з використанням спеціального лазерного пристрою, розробленого у ВП „Фотоніка плюс” (м. Черкаси). Для того, щоб досягти необхідної для опромінювання експериментальних пухлин густини потужності, в пристрої застосовується система кварцових світловодів. Кінець світловоду від кожного гелій-неонового лазера ЛГН-111 заводився у спеціально розроблений пристрій, який дозволяв сконцентрувати випромінювання від декількох лазерів у один світловий пучок. Світловод установлювали з таким розрахунком, щоб діаметр світлової плями перевищував діаметр пухлини в 1,5-2 рази. Світловий вплив здійснювали при довжині хвилі випромінювання 632 нм, густині потужності 150 мВт/см² і експозиції 20 хвилин.

Оцінку ефективності ФДТ з використанням 5-АЛК проводили за гальмуванням росту пухлин (ГРП), яке розраховували по формулі ГРП = (V_к - V_д) / V_к х 100%, де V_к і V_д - середній об'єм пухлин відповідно в контрольній і дослідній групах, а також за відсотком тварин з повною регресією пухлини (ПР).

Ступінь метастазування встановлювали за зміною маси легень, середньою кількістю метастазів у мишей кожної групи, середнім діаметром метастатичних вузлів та частотою метастазування.

Для гістологічних досліджень пухлини, які видаляли через 4 та 20 годин після проведеної ФДТ, фіксували у 10% розчині нейтрального формаліну, обробляли загальноприйнятим методом; серійні зрізи фарбували гематоксиліном і еозином. Морфологічні зміни, які спостерігались у пухлинах після проведеної ФДТ, досліджували при збільшенні мікроскопу від 100 до 400.

Для оцінки реакції імунної системи, використовуючи стандартні методики, визначали абсолютну і відносну масу та клітинність тимусу, селезінки і лімфатичних вузлів; питомий вміст у пухлинній тканині клітин мієлоцитарної ланки (прилипаючих до пластику) і лімфоцитів (відділених центрифугуванням у градієнті густини фікол-верографін, =1,077). Питому кількість таких клітин (відповідно k_m або k₁) розраховували за формулою: k = (кількість отриманих клітин/маса пухлини, мг) х10⁵.

Рівень функціональної активності перитонеальних макрофагів (дихальний вибух) визначали за їхньою здатністю відновлювати нітросиній тетразолій (НСТ) за стандартною методикою (Muller L.R., 1989). Ступінь активації макрофагів оцінювали за різницею між показниками спонтанної та індукованої активності. У дослідних пробах макрофаги вносили в планшет у кількості 1х10⁵ на лунку. В якості екзогенного стимулятора застосовували зимозан в концентрації 3 мг/мл. Результати визначали за допомогою спектрофотометричного методу при довжині хвилі 540 нм. Відсоток стимуляції активності розраховували по формулі: (Ст - Сп) / Сп х 100%, де Сп - показник оптичної щільності спонтанної проби; Ст - показник оптичної щільності стимульованої проби.

Проліферативну активність спленоцитів визначали в реакції бласттрансформації із застосуванням МТТ-тесту за стандартною методикою (Nike M., 1990). Спленоцити мишей у концентрації 5х10⁵ кл/мл культивували у 96-лункових планшетах на протязі 72 год в середовищі RPMI-1640 з 10% сироваткою ембріонів теляти в умовах СО₂ інкубатора. В якості мітогена застосовували конканавалін А (Pharmacia, Switzerland) в концентрації 15 мкг/мл. За 4 год до закінчення строку інкубації у лунки вносили препарат МТТ. Оптичну щільність вимірювали за допомогою спектрофотометричного методу при довжині хвилі 540 нм. Індекс мітоген-індукованої активності клітин розраховували за формулою: [(Д-К)/К]х100%, де Д - середнє значення екстинкції з 3-4 повторів у досліді (в присутності мітогену), К - те ж саме у контролі (у відсутності мітогену).

Рівень фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF) визначали імуноферментним методом за допомогою розроблених тест-систем (Лісняк І.О., 2004), де головними компонентами в процедурі визначення рівня VEGF були поліклональні антитіла до фактора та кон'югати цих антитіл з пероксидазою хрону. Визначення рівня VEGF проводили в сироватці крові тварин контрольної та дослідних груп.

Статистична обробка одержаних результатів проводилась з використанням t-критерію Ст'юдента. Результати аналізу вважали достовірними при р?0,05.

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ

Для вивчення дії лазерного випромінювання, опосередкованої 5-АЛК, на життєздатність пухлинних клітин in vitro визначали оптимальну концентрацію 5-АЛК, дозу лазерного світла і час інкубації клітин, необхідний для реалізації фотодинамічного ефекту після опромінення.

Проведені дослідження показали, що сама 5-АЛК у високій концентрації справляє певний токсичний ефект на інтактні (без впливу світла) клітини пухлин. Але концентрація фотосенсибілізатора 1мМ виявилася оптимальною для вивчення фотодинамічного ефекту без значного токсичного впливу на неопромінені світлом клітини. При обраному оптимальному режимі впливу (концентрація 5-АЛК 1 мМ, доза опромінення 25 - 100 Дж/см²) відсоток мертвих клітин досягав для лімфоми NK/Ly - 96%, для раку Ерліха - 93% і для лінії Namalwa - 76% (рис. 1). Фотодинамічний ефект зростав із збільшенням часу інкубації фотосенсибілізатора (від 1 год до 40 год) та дози світла (від 10 до 150 Дж/см²). У варіантах досліду, де застосовували тільки введення 5-АЛК або тільки лазерне опромінення, достовірного пошкоджуючого впливу на пухлинні клітини не виявлено.



Рис. 1. Кількість загиблих пухлинних клітин через 20 год після фотодинамічного впливу в присутності 5-АЛК: А - контроль (без впливу); В - введення 5-АЛК без лазерного опромінення; С - дія лазерного випромінювання без застосування 5-АЛК; D - 5-АЛК + лазерне опромінення.

Таким чином, було встановлено, що злоякісні клітини (лімфома мишей NK/Ly, асцитний варіант раку Ерліха і В-клітинна лімфома людини Namalwa) виявляють певну чутливість до фотодинамічного впливу при застосуванні 5-АЛК в якості фотосенсибілізатора. При цьому ефективність фотодинамічного впливу залежить від дози фотосенсибілізатора, часу інкубації, дози світла і режимів опромінення, а також від типу пухлинних клітин.

Дослідження токсикологічних властивостей 5-АЛК проводили на мишах лінії С₅₇Bl/6. Визначали максимальну толерантну дозу (МТД) для 5-АЛК виробництва ІОХ НАНУ та проводили його порівняльне дослідження з офіцинальним препаратом „Аласенс” виробництва ГНЦ "НИОПИК", Росія. Розчини фотосенсибілізаторів вводили тваринам per os, Цей спосіб введення вважається основним при практичному застосуванні препарату. Встановлено, що використана в роботі 5-АЛК вітчизняного виробництва та взятий для порівняння офіцинальний препарат „Аласенс” мають низьку і майже однакову гостру токсичність: МТД препаратів складає 4000 ± 0,38 мг/кг та 4100 ± 0,5 мг/кг відповідно. Показано, що терапевтична доза 5-АЛК (500 мг/кг) у 8 разів менша за отриману нами максимальну толерантну дозу фотосенсибілізатора.

В наступних експериментах на моделях карциноми Льюїс, саркоми 180 і солідного варіанту раку Ерліха було проведене вивчення фотодинамічної протипухлинної активності нового вітчизняного фотосенсибілізатора 5-АЛК у порівнянні з референтним препаратом „Аласенсом” при застосуванні різних способів введення фотосенсибілізаторів.

При проведенні ФДT в першу добу після впливу опромінена шкіра над пухлиною темніла і надалі покривалася струпом. На 10-12-у добу після ФДТ утворювалась западина в результаті відторгнення некротичних мас пухлини, з подальшим формуванням на шкірі тварин м'якого гіпертрофічного рубця.

Як видно з результатів, представлених у таблиці 1, ФДТ-АЛК значно пригнічує ріст всіх експериментальних пухлин.

Таблиця 1

Вплив ФДТ з використанням 5-АЛК або „Аласенсу” на ріст експериментальних пухлин

Спосіб введення 5-АЛК	Показ-ники	Експериментальні пухлини
		Карцинома Льюїс	Саркома 180	Пухлина Ерліха
		5-АЛК	„Аласенс”	5-АЛК	„Аласенс”	5-АЛК	„Аласенс”
Пероральний	ГРП ПР	71,6 57,1	68,6 41,7	88,2 85,7	83,5 83,3	100 100	93,6 91,7
Внутрішньо-черевний	ГРП ПР	84,8 77,7	83 75	79,1 80	83,7 83,3	91,8 90	100 100
Внутрішньо-пухлинний	ГРП ПР	82,6 66,7	66,9 44,4	90,1 85,7	63,5 62,5	80,7 71,4	86,3 80
У складі мазі	ГРП ПР	71,3 50	68,4 55,5	72,9 55,5	52,4 37,5	67,8 62,5	71,2 60

ГРП - гальмування росту пухлин (%); ПР - повна регресія пухлин (%).

Найбільш виразне гальмування росту пухлин спостерігалось при ФДТ з пероральним (ГРП - 71,6-100%) і внутрішньочеревним (ГРП - 79,1-91,8%) введенням 5-АЛК. Менш виразна протипухлинна активність виявлялась при ФДТ з внутрішньопухлинним та аплікаційним застосуванням 5-АЛК: 80,7-90,1% і 67,8-72,9%, гальмування росту відповідно. Було встановлено також, що ФДТ з використанням 5-АЛК приводило у 50-100% тварин до повної регресії пухлин, в залежності від типу пухлини та способу введення фотосенсибілізатора.

Слід відзначити, що у всіх дослідних групах, де застосовували 5-АЛК без наступного опромінення або тільки опромінення без попереднього введення фотосенсибілізатора, інгібуюча дія на ріст пухлин не спостерігалась.

В описаних експериментах було також встановлено, що проведена для порівняння ФДТ з використанням референтного препарату „Аласенс” має протипухлинну активність, подібну до ФДТ із застосуванням 5-АЛК вітчизняного виробництва.

Таким чином, на даному етапі дослідження було показано, що ФДТ із застосуванням 5-АЛК мала здатність значно пригнічувати ріст і, в більшості випадків, викликати повну регресію карциноми Льюїс, саркоми-180 та солідного варіанту раку Ерліха. При цьому ефективність ФДТ-АЛК залежала від способу введення та від моделі експериментальних пухлин. Кращі результати спостерігались при системному введенні 5-АЛК (внутрішньочеревному, пероральному) у порівнянні з місцевим (внутрішньопухлинним та аплікаційним). Встановлено також, що протипухлинна активність 5-АЛК відносно перещеплюваних пухлин у мишей вірогідно не відрізнялась від активності препарату порівняння „Аласенс”.

В наступних дослідах на мишах з карциномою Льюїс вивчали вплив ФДТ-АЛК на метастатичну активність пухлин (табл. 2).

Таблиця 2

Вплив ФДТ-АЛК на метастазування карциноми Льюїс

Група	Середня маса легень, мг	Середня кількість метастазів на мишу	Середній об'єм метастазів на мишу, мм3	Частота метастазування, %
Контроль	386 ±20,25	9,83 ±1,17	14,97 ±1,47	100
5-АЛК	312 ±26,66	7,83 ±1,34	12,33 ±2,23	100
Лазерне опромінення	354 ±16,04	8,5 ±0,85	12,73 ±3,96	100
ФДТ-АЛК	205 ±33,3*	1,67 ±1,17*	3,77 ±2,48*	33

* - р< 0,05 в порівнянні з контролем

Показано, що у групі мишей, яким була проведена ФДТ-АЛК, частота метастазування була на 67% нижча, ніж в інших групах (лазерне опромінення, застосування тільки 5-АЛК і контроль), де цей показник склав 100%. Крім того, було встановлено, що середня кількість метастазів у легенях мишей, яким проводилась ФДТ-АЛК, була в 5,1 рази меншою, ніж у тварин, що були піддані лазерному опроміненню без попереднього введення 5-АЛК; в 4,7 разів меншою ніж у групі мишей, яким вводили тільки 5-АЛК і у 5,9 разів меншою, ніж у контролі. При цьому середній об'єм метастазів у групі ФДТ-АЛК був у 4 рази меншим порівняно з контрольною групою. Частково про ступінь метастазування можна було судити також і по вазі легень тварин. Так, у дослідній групі (ФДТ-АЛК) цей показник склав 205±33,3 г, у порівнянні з 354±16,04 г у групі з лазерним опроміненням; 312 ±26,66 г у групі, де застосовували 5-АЛК без наступного опромінення пухлини, і 386,2±20,25 г у контролі.

Таким чином, отримані дані вказують, що при ФДТ з використанням в якості фотосенсибілізатора 5-АЛК досягається не тільки істотне гальмування росту первинних пухлин, але і значне пригнічення процесу метастазування у мишей з карциномою Льюїс.

В наступних експериментах вивчали характер лікувального патоморфозу, що спостерігався у злоякісних пухлинах під впливом ФДТ з використанням 5-АЛК. Матеріалом для вивчення лікувального патоморфозу були карцинома Льюїс, саркома 180 та аденокарцинома Ерліха. Морфологічні зміни у пухлинах експериментальних тварин досліджували через 4 і 20 годин після проведення ФДT-АЛК. Контролем були пухлини, видалені на тій же фазі росту у тварин без фотодинамічного впливу.

Аналіз морфологічних змін після ФДТ із застосуванням 5-АЛК виявив численні ознаки лікувального патоморфозу, які проявлялись у порушенні структури паренхіми і строми пухлин. Основними рисами фотодинамічного впливу були дистрофія клітин різного ступеню, некробіоз і порушення кровообігу у стромі пухлин. Ці зміни характеризувались етапністю: від менш виражених через 4 год після впливу ФДТ-АЛК до більш виражених через 20 год після лікування. Найбільші виражені зміни порушення кровообігу у досліджених пухлинах були виявлені у периферичних відділах пухлин, тоді як дистрофічні зміни клітин і некроз мали місце як по периферії, так і в центральних зонах. Слід також відзначити більш виражені морфологічні зміни при дії ФДТ-АЛК у карциномах Ерліха і Льюїс (у порівнянні з саркомою 180), в яких спостерігалось більше осередків некрозу і некробіозу, хоча поряд з цим навколо судин у центральних зонах пухлинних тканин виявлялись клітини у стані мітозу.

Отримані результати проведених патоморфологічних досліджень дозволяють заключити, що ФДТ з 5-АЛК спричиняє як пряме пошкодження цитоархітектоніки пухлин, так і опосередкований ефект у вигляді порушень судинної системи пухлин.

Відомо, що в руйнуванні пухлини при ФДТ важливу роль відіграє ушкодження васкулярної строми новоутворення (Kimel S., 1994, Dolmans D.E., 2002). Однак, детальний механізм цього процесу залишається нез'ясованим. Тому завданням наступного етапу роботи було вивчення впливу ФДТ на рівень фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF) в сироватці крові організму-пухлиноносія та аналіз здатності такої терапії пригнічувати неоангіогенез в пухлинах і метастазах.

Досліди проводили на мишах з карциномою Льюїс, у яких на 21 добу після перещеплення пухлини (11 доба після ФДТ-АЛК) проводили забір крові для визначення рівня VEGF. Після забору крові у мишей вилучали легені і визначали ступінь їх метастатичного ураження. В групі тварин, яким проводили ФДТ-АЛК, відмічено гальмування росту пухлин (на 92,9%), суттєве зниження об'єму метастатичного ураження легень (на 96,3%) при зниженні рівня VEGF в сироватці крові (на 51,8%). Крім цього, аналізували вплив ФДТ-АЛК на процес васкуляризації метастазів. Для цього метастази розподіляли за розмірами. Виходячи з даних відносно етапів розвитку процесу ангіогенезу (Folkman J., 1974), ми вважали, що метастази діаметром до 1,0 мм знаходились виключно в ”аваскулярній” фазі розвитку, а метастази більшого розміру - у “васкулярній”.

Оцінка співвідношення метастазів в “аваскулярній” та “васкулярній” фазах розвитку показала, що в групах тварин, які отримували ФДТ-АЛК, кількість метастазів в „аваскулярній” фазі розвитку була в 1,7 рази більшою порівняно з контрольними значеннями (рис. 2). Використання тільки лазерного опромінення практично не впливало на цей показник порівняно з контролем (53,8% та 49,4%, відповідно), та на кількість метастазів, що знаходились у „васкулярній” фазі розвитку (відповідно для лазерного опромінення та контролю - 46,2% та 50,6%). У мишей, що отримували ФДТ-АЛК, середні значення кількості метастазів „васкулярної” фази розвитку, були в 24 рази нижчі за контрольні значення.

Таким чином, за результатами аналізу співвідношення кількості метастазів в „аваскулярній” та „васкулярній” фазах розвитку можна стверджувати, що ФДТ-АЛК значно гальмує процес васкуляризації в легеневих метастазах у дослідних мишей з карциномою Льюїс.



Рис. 2. Баланс „аваскулярної” та „васкулярної” фаз розвитку метастазів карциноми Льюїс.

В останні роки значного розвитку набули дослідження ролі імунної системи в регресії пухлини під впливом ФДТ. Автори цих досліджень підкреслюють, що саме реакція імунної системи хазяїна є критичною для захисту від метастазів і рецидивів пухлини після проведення ФДТ (Cecic I. 2001, Canti G.A. 2002). В зв'язку з цим були досліджені деякі показники імунологічної реактивності у тварин-пухлиноносіїв в процесі застосування ФДТ-АЛК. Для цього були обрані дві модельні системи експериментального пухлинного росту - метастазуюча карцинома Льюїс та саркома 180. Дослідження показників імунологічної реактивності проводилося безпосередньо після проведення сеансу ФДТ, а також через 7 і 14 діб, що відповідає 6-й, 13-й і 20-й добі з моменту перещеплення пухлини для саркоми 180 і 14-й, 21-й і 28-й добі для карциноми Льюїс відповідно.

Вивчення інфільтрації пухлини прилипаючими клітинами мієлоцитарної ланки безпосередньо після ФДТ-АЛК показало значне, майже в 4 рази, збільшення їх кількості в порівнянні з контролем (рис. 3).

Для оцінки впливу ФДТ-АЛК на системну неспецифічну резистентність тварин-пухлиноносіїв ми досліджували спонтанну і стимульовану метаболічну активність перитонеальних макрофагів в НСТ-тесті.

Отримані результати динамічного дослідження показників метаболічної активності фагоцитів у мишей з карциномою Льюїс і саркомою 180 після проведення ФДТ-АЛК в більшості випадків співпадали. Було показано, що безпосередньо після ФДТ-АЛК спостерігалась супресія спонтанної і, особливо, стимульованої активності перитонеальних макрофагів. Це, імовірно, обумовлено, з одного боку, дією факторів агресії самих пухлин, а з іншого - виснаженням функціонального резерву мієлоцитарної клітинної ланки в процесі протипухлинного захисту. Через 7 діб після ФДТ-АЛК спонтанна метаболічна активність перитонеальних макрофагів відновлювалась і майже досягала рівня інтактних тварин. Термін дослідження співпадає з терміном залучення в імунну відповідь реакцій адаптивного імунітету, що, імовірно і пояснює відновлення функцій системи неспецифічної резистентності. Через 14 діб після ФДТ-АЛК у мишей-пухлиноносіїв спостерігалась максимальна системна стимуляція ефекторів неспецифічної резистентності з практично повною мобілізацією їх функціонального резерву.

Крім того, вивчались показники адаптивного імунітету тварин-пухлиноносіїв в динаміці ФДТ-АЛК. Одержані результати показують, що через 4 доби після проведення ФДТ-АЛК у мишей з карциномою Льюїс спостерігалась доволі значна інфільтрація пухлинної тканини лімфоїдними клітинами (рис. 4). Ці дані свідчать про те, що ФДТ-АЛК здатна генерувати запальні реакції, які залучують згодом в процес ефекторні клітини адаптивного імунітету. Підтвердженням тому були проведені паралельно дослідження таких інтегральних показників, як маса і клітинність лімфоїдних органів, які характеризують системну реакцію лімфоїдної тканини.

Встановлено, що в першу добу після проведення ФДТ-АЛК у мишей з карциномою Льюїс і саркомою 180 не було виявлено змін в лімфоїдних органах: органні індекси у тварин всіх груп були приблизно однакові за значенням. В подальшому, дослідження вказаних критеріїв проведені на 7-у та 14-у добу після ФДТ-АЛК. Суттєвих змін маси селезінок мишей з карциномою Льюїс та саркомою 180 в усі строки спостереження не відбувалось. В той же час, у підданих ФДТ-АЛК мишей-пухлиноносіїв обох штамів, з моменту проведення лікування маса тимусу помітно зростала і досягала значень, достовірно вищих у порівнянні з нелікованим пухлинним контролем. К 14-й добі після ФДТ-АЛК маса тимусів відновлювалась і досягала рівня інтактних тварин (без пухлин), що свідчить про поновлення дії Т-клітинної ланки імунної відповіді.

Показники лімфатичних індексів і клітинність лімфатичних вузлів у групі тварин, яким проводилась ФДТ-АЛК, виявились зменшеними порівняно з іншими групами. Однак, незважаючи на відсутність у частини тварин первинної пухлини та метастазів, ці величини так і не досягли рівня інтактних тварин. Це можна пояснити наявністю у мишей даної групи залишкових запальних процесів.

Надалі, для оцінки адаптивної імунної відповіді в динаміці ФДТ-АЛК, ми вивчали проліферативну активність лімфоцитів у реакції мітогеніндукованої бласттрансформації. У дослідженнях виявлено, що в першу добу в групі тварин, яким проводили ФДТ-АЛК, спостерігалась тенденція до зниження системної проліферативної активності лімфоцитів, що, може бути пов'язано з міграцією значної частини активованих клітин в зону запалення, генерованого лікуванням. Але, через 14 діб після проведення ФДТ-АЛК проліферативна активність лімфоцитів у тварин різних дослідних груп відрізнялась. Показано, що в групах тварин, яким застосовували ФДТ-АЛК, через 14 діб після проведеного лікування мітогеніндукована проліферативна активність лімфоцитів суттєво зростала. При цьому у мишей із саркомою 180 вона досягала рівня інтактних тварин, а у мишей з карциномою Льюїс навіть достовірно перевищувала рівень інтактного контролю (рис. 5). Відмінності в рівнях мітогеніндукованої бласттрансформації лімфоцитів у мишей з цими перещеплюваними пухлинами можуть бути наслідком різної швидкості розвитку пухлин.

Рис. 5. Вплив ФДТ-АЛК на мітогеніндуковану проліферативну активність лімфоцитів у мишей з карциномою Льюїс (A - перша доба після проведення ФДТ-АЛК; В - 14 доба після проведення ФДТ-АЛК).

Підсумовуючи аналіз впливу ФДТ-АЛК на реакції імунної системи тварин-пухлиноносіїв, слід зазначити, що означене лікування призводить до активації як локальних, так і системних реакцій імунітету на різних його рівнях. При цьому в першу чергу реагують місцеві фактори неспецифічної резистентності у відповідь на запалення, опосередковане ФДТ. Локальна активація ефекторів неспецифічної резистентності дисемінує і проявляється в генералізованих реакціях природного імунітету. Активована природна резистентність згодом залучає фактори адаптивного імунітету. При цьому у мишей із саркомою 180 вищеописана динаміка є більш стислою в часі, тобто реакції розвиваються швидше. Можливо, це є наслідком локалізованого пухлинного росту при даній моделі, на відміну від карциноми Льюїс, яка є метастазуючою пухлиною.

Таким чином, використаний в експериментах вітчизняний фотосенсибілізатор другого покоління - 5-амінолевулінова кислота має низьку токсичність та високу фотосенсибілізуючу активність, а метод ФДТ-АЛК в цілому здатний істотно гальмувати ріст первинних пухлин та інгібувати процес метастазування. Протипухлинний і антиметастатичний ефекти ФДТ-АЛК реалізуються на фоні активації як локальних, так і системних реакцій імунітету на різних його рівнях, та супроводжуються пригніченням васкуляризації в пухлинах і легеневих метастазах тварин.

ВИСНОВКИ

В експериментах на лабораторних тваринах досліджено протипухлинну ефективність фотодинамічної терапії (ФДТ) із застосуванням нового фотосенсибілізатора другого покоління - 5-амінолевулінової кислоти (5-АЛК).

1. Показано, що злоякісні клітини культуральних ліній та перещеплюваних пухлин проявляють високу чутливість до фотодинамічної дії, опосередкованої 5-АЛК. За прийнятих стандартних умов (1мМ 5-АЛК, доза опромінення 25 Дж/см²), спостерігається загибель 96% клітин лімфоми NK/Ly та 76% клітин лінії Namalwa.

2. Встановлено, що використана в роботі 5-АЛК, синтезована в ІОХ НАНУ, та взятий для порівняння офіцинальний препарат „Аласенс” виробництва ГНЦ "НИОПИК" (Росія) мають низьку і майже однакову гостру токсичність: МТД фотосенсибілізаторів складає 4000 ± 0,38 мг/кг та 4100 ± 0,5 мг/кг, відповідно.

3. В експериментах з ФДТ-АЛК перещеплюваних пухлин - карциноми Льюїс, саркоми 180 і солідного варіанту раку Ерліха із застосуванням різних способів введення фотосенсибілізатора гальмування росту пухлин складає від 68% до 100% при повній регресії пухлин у 50-100% тварин, в залежності від типу пухлини та способу введення фотосенсибілізатора. Кращі результати спостерігаються при системному введенні 5-АЛК (внутрішньочеревному, пероральному) у порівнянні з місцевим (внутрішньопухлинним та аплікаційним).

4. ФДТ карциноми Льюїс з використанням 5-АЛК приводить до пригнічення процесу метастазування в легенях, про що свідчить зменшення частоти метастазування в 3 рази, кількості метастазів на тварину в 6 разів і об'єму метастазів у 4 рази. Антиметастатичний ефект ФДТ-АЛК супроводжується гальмуванням процесу васкуляризації легеневих метастазів.

5. На підставі патоморфологічних досліджень пухлин встановлено, що ФДТ з 5-АЛК викликає як пряме пошкодження цитоархітектоніки пухлинної тканини, так і опосередкований ефект у вигляді порушень судинної системи пухлин.

6. У тварин з карциномою Льюїс, що були піддані ФДТ-АЛК, встановлено зменшення в крові концентрації фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF).

7. Протипухлинний і антиметастатичний ефекти ФДТ з використанням 5-АЛК супроводжуються зміною показників імунологічної реактивності тварин-пухлиноносіїв. При цьому найбільш швидко активуються локальні фактори неспецифічної резистентності, що проявляється ранньою (перші хвилини після опромінення) масивною інфільтрацією пухлини клітинами мієлоцитарної ланки.

8. Встановлена участь в імунній відповіді на ФДТ-АЛК реакцій адаптивного імунітету, про що свідчать посилення інфільтрації пухлин лімфоцитами, відновлення функціонального резерву перитонеальних макрофагів, гальмування пухлиноіндукованої інволюції тимусу та стимуляція проліферативної активності циркулюючих Т-лімфоцитів.

9. Результати проведених досліджень включені в пакет матеріалів, підготовлених для представлення в МОЗ України з метою отримання дозволу на клінічні випробування методу ФДТ злоякісних пухлин із застосуванням нового фотосенсибілізатора 5-АЛК вітчизняного виробництва.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Куценок В.В., Горобец О.Б., Лозинский М.О., Борисевич А.Н., Холин В.В., Гамалея Н.Ф. Использование 5-аминолевулиновой кислоты в качестве фотосенсибилизатора для фотодинамической терапии опухолей (доклинические исследования) // Онкология. - 2004. -Т. 6, № 3. - С. 225-230. (Особистий внесок здобувача: виконав експериментальні дослідження, зробив аналіз наукових результатів, приймав участь у написанні і оформленні статті).

Skivka L.M., Gorobets O.B., Kutsenok V.V., Lozinsky M.O., Borisevich A.N., Fedorchuk A.G., Kholin V.V., Gamaleya N.F. 5-aminolevulinic acid mediated photodynamic therapy of Lewis lung carcinoma: a role of tumor infiltration with different cells of immune system. // Experimental Oncology.- 2004.- Vol. 26, №4.- Р. 312-315. (Особистий внесок здобувача: приймав участь у проведенні експериментальних досліджень, обробці і оформленні наукових результатів).

Куценок В.В., Поліщук Л.З., Горобець О.Б., Гамалія М.Ф. Гістологічна характеристика експериментальних пухлин при їх фотодинамічній терапії із застосуванням 5-амінолевулінової кислоти // Актуальные проблемы медицины и биологии. -2004. -№1. -С. 170-181. (Здобувач приймав участь у проведенні експериментальних досліджень, написанні та оформленні статті).

Гамалея Н.Ф., Куценок В.В., Чехун В.Ф. Применение 5-аминолевулиновой кислоты в фотодинамической терапии и диагностике опухолей // Онкология. - 2003. -Т. 5, № 3. - С. 239-244. (Особистий внесок здобувача: підготував огляд літератури та приймав участь у написанні та оформленні статті).

Куценок В.В., Гамалея Н.Ф. Фотодинамическая терапия злокачественных опухолей // Онкология. - 2003. - Т. 5, № 1. - С. 69-73. (Особистий внесок здобувача: підготував огляд літератури та приймав участь у написанні та оформленні статті).

Куценок В.В.. Первый опыт экспериментальной фотодинамической терапии опухолей с применением 5-аминолевулиновой кислоты. // Тези V конференції молодих онкологів України "Сучасні аспекти експериментальної та клінічної онкології". - Київ, 2002.- С. 8-9.

Гамалея Н.Ф., Куценок В.В., А.Н Борисевич. Экспериментальная фотодинамическая терапия опухолей с применением 5-аминолевулиновой кислоты // Тези науково-практичної конференції з міжнародною участю „ ОНКОЛОГІЯ - ХХІ”. - Київ, 2003.- С. 259-260.

Горобец О.Б., Куценок В.В. Фотодинамическое разрушение опухолевых клеток in vitro с использованием 5-аминолевулиновой кислоты. // Тези VI конференції молодих онкологів України "Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології". - Київ, 2003.- С. 13.

Гамалея Н.Ф., Куценок В.В. Фотодинамическая терапия - эффективный метод лечения больных со злокачественными опухолями. // Doctor - 2003. - № 4. - С. 28-32. (Особистий внесок здобувача: приймав участь в оформленні статті).

АНОТАЦІЯ

Куценок В.В. Ефективність фотодинамічної терапії пухлин з використанням 5-амінолевулінової кислоти (експериментальне дослідження). - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2005.

Дисертацію присвячено експериментальному вивченню протипухлинної і антиметастатичної ефективності, імунологічних, морфологічних та ангіогенезо-залежних особливостей впливу на організм фотодинамічної терапії із застосуванням вітчизняного фотосенсибілізатора другого покоління - 5-амінолевулінової кислоти.

В роботі показано, що в дослідах in vitro малігнізовані клітини виявляють високу чутливість до фотодинамічного впливу при застосуванні в якості фотосенсибілізатора 5-АЛК. Чутливість пухлинних клітин до фотодинамічного впливу в присутності 5-АЛК знаходиться в залежності від концентрації фотосенсибілізатора, часу інкубації, дози лазерного опромінення, а також від типу клітин. В експериментах по ФДТ з 5-АЛК пухлин на лабораторних тваринах встановлено істотне гальмування росту первинних пухлин як при системному введенні фотосенсибілізатора (внутрішньочеревному, пероральному), так і місцевому (внутрішньопухлинному та аплікаційному), а також значне пригнічення процесу метастазування у мишей з карциномою Льюїс.

Показано, що метод ФДТ з використанням 5-АЛК значно гальмує процес васкуляризації легеневих метастазів у мишей з карциномою Льюїс та призводить до зниження в крові рівня фактора росту ендотеліальних клітин (VEGF).

В роботі представлені експериментальні дослідження впливу ФДТ із застосуванням 5-АЛК на імунологічну реактивність тварин-пухлиноносіїв: показано, що в першу чергу активуються локальні фактори неспецифічної резистентності, а з часом в імунну відповідь на ФДТ-АЛК залучаються реакції адаптивного імунітету.

Проведені експериментальні дослідження показують, що новий вітчизняний фотосенсибілізатор 5-АЛК має специфічну активність, подібну до офіцинального препарату на основі 5-АЛК - „Аласенсу”, що випускається ГНЦ "НИОПИК" (Росія), і може бути рекомендований для ФДТ злоякісних новоутворень.

Ключові слова: фотодинамічна терапія, 5-амінолевулінова кислота, перещеплювані пухлини тварин, метастазування, фактор росту ендотеліальних клітин (VEGF), імунологічна реактивність.

АННОТАЦИЯ

Куценок В.В. Эффективность фотодинамической терапии опухолей с использованием 5-аминолевулиновой кислоты (экспериментальное исследование). - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецького НАН Украины, Киев, 2005.

Диссертация посвящена экспериментальному изучению противоопухолевой и антиметастатической эффективности, иммунологических, морфологических и ангиогенезо-зависимых особенностей влияния на организм фотодинамической терапии с использованием отечественного фотосенсибилизатора второго поколения - 5-аминолевулиновой кислоты.

Задачи исследования: 1. Определить токсичность 5-АЛК в сравнении с препаратом „Аласенс”. 2. Изучить фотодинамическое повреждение опухолевых клеток in vitro при использовании 5-АЛК. 3. Определить на моделях перевитых опухолей (карцинома легких Льюис, саркома 180, солидный вариант рака Эрлиха) антибластомную эффективность ФДТ-АЛК при разных способах введения фотосенсибилизатора. 4. Изучить антиметастатический эффект ФДТ-АЛК на мышах с карциномой Льюис. 5. Провести морфологическое исследование перевитых опухолей у животных, которым проводили ФДТ-АЛК. 6. Определить влияние ФДТ-АЛК на уровень фактора роста эндотелиальных клеток (VEGF) в крови мышей с карциномой Льюис. 7. Охарактеризовать состояние иммунологической реактивности животных с опухолями в процессе ФДТ.

В диссертационной работе применены методы экспериментальной онкологи, морфологические, иммунологические, иммуноферментные, статистические.

В работе проведено экспериментальное исследование фотодинамической терапии опухолей с использованием 5-АЛК. В опытах in vitro малигнизированые клетки (NK/Ly, Namalwa и асцитный вариант рака Эрлиха) проявляют высокую чувствительность к фотодинамическому воздействию при использовании 5-АЛК. Чувствительность опухолевых клеток к фотодинамическому воздействию в присутствии 5-АЛК находится в зависимости от концентрации фотосенсибилизатора, времени инкубации, дозы лазерного облучения, а также от типа клеток. Установлено, что отечественный фотосенсибилизатор 5-АЛК и официнальный препарат сравнения - „Аласенс” имеют низкую и практически одинаковую острую токсичность. В экспериментах по ФДТ с 5-АЛК на животных установлено значительное торможение роста опухолей как при системном (внутрибрюшинном, пероральном), так и при местном (внутриопухолевом, аппликационном) применении фотосенсибилизатора, а также существенное угнетение процесса метастазирования у мышей с карциномой Льюис. Патоморфологические исследования опухолей после ФДТ с 5-АЛК, показали как прямое повреждение цитоархитектоники опухолей, так и опосредованный эффект в виде нарушений в сосудистой системе опухоли.

Показано, что метод ФДТ з использованием 5-АЛК значительно тормозит процесс васкуляризации легочных метастазов у мышей с карциномой Льюис и приводит к снижению в крови уровня фактора роста эндотелиальных клеток (VEGF).

Прослежена динамика показателей иммунологической реактивности животных-опухоленосителей в разные сроки после проведения ФДТ-АЛК. Установлено, что наиболее быстро активируются локальные факторы неспецифической резистентности, что проявляется ранней (первые минуты после облучения) массивной инфильтрацией опухоли клетками миелоцитарного ряда. Показано вовлечение в иммунный ответ на ФДТ-АЛК реакций адаптивного иммунитета, о чем свидетельствует усиление инфильтрации первичных опухолей лимфоцитами, восстановление функционального резерва перитонеальных макрофагов, торможение опухоль-индуцированной инволюции тимуса и стимуляция пролиферативной активности циркулирующих Т-лимфоцитов.

Проведенные экспериментальные исследования показали, что новый отечественный фотосенсибилизатор 5-АЛК проявляет аналогичную официнальному препарату сравнения „Аласенсу” (Россия) специфическую активность и может быть рекомендован для фотодинамической терапии злокачественных новообразований.

Ключевые слова: фотодинамическая терапия, 5-аминолевулиновая кислота, перевивные опухоли животных, метастазирование, фактор роста эндотелиальных клеток (VEGF), иммунологическая реактивность.

SUMMARY

Kutsenok V.V. Effectiveness of 5-aminolevulinic acid as a photosensitizer in photodynamic therapy of tumors (experimental research). - Manuscript.

Thesis for a Degree of Candidate of Medical Sciences on Speciality 14.01.07 - Oncology. - R.E.Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology NAS of Ukraine, Kyiv, 2005.

The dissertation is devoted to the study of antitumor, antimetastatic, morphological, immunological and angiogen-dependent effects of photodynamic therapy (PDT) with the second-generation photosensitizer, 5-aminolevulinic acid (5-ALA).

It was shown in vitro that malignant cells display a high sensitivity to photodynamic action by application of 5-ALA. Sensitivity of tumor cells to ALA-PDT is displayed by dose-dependent manner (5-ALA concentration, duration of incubation, dose of laser irradiation). The value of ALA-PDT effect is depended on type of tumor cells. In vivo experiments have shown the significant inhibition of primary tumor growth both by systemic and local application of 5-ALA. The significant inhibition of metastasis in experiment with Lewis lung carcinoma it was shown also.