Особливості структурно-функціонального стану плазматичних мембран пухлинних клітин, резистентних до доксорубіцину

Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ, OНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ІМ. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

ОСОБЛИВОСТІ СТРУКТУРНО-ФУНКЦІОНАЛЬНОГО СТАНУ ПЛАЗМАТИЧНИХ МЕМБРАН ПУХЛИННИХ КЛІТИН, РЕЗИСТЕНТНИХ ДО ДОКСОРУБІЦИНУ

Спеціальність: Онкологія

Триндяк Володимир Петрович

Київ, 2004 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Аналіз динаміки захворюваності населення України на злоякісні новоутворення свідчить про зростання за останнє десятиріччя рівня цього показника від 307,4 до 325,0 на 100 тис. населення, або на 5,7% а смертність від цієї патології займає друге місце після серцево-судинних хвороб (Федоренко З.П., 2001, Онкологічні захворювання в Україні, Київ, 2004). Тому проблема підвищення ефективності комплексного, в тому числі, хіміотерапевтичного лікування онкологічних хворих є однією з основних проблем теоретичної та клінічної онкології, але, не дивлячись на певні успіхи, вона все ще далека від остаточного вирішення.

За ступенем поширеності використання в різних схемах хіміотерапії одне з провідних місць посідають антрациклінові антибіотики, зокрема доксорубіцин (DOX), який, на жаль, як і деякі інші протипухлинні препарати, має низьку вибірковість дії та високу кардіо- та мієлотоксичність (Булкіна З.П., 1991, Schimmel K.J. et al., 2004). Крім того, пухлини можуть мати природну або набуту в результаті хіміотерапії резистентність до DOX (Курпешев О.К. и др., 2002, Nielsen D. et al., 1996). Зокрема втрата чутливості пухлинних клітин до дії DOX може бути обумовлена не тільки змінами на рівні геному, але й появою чисельних епігеномних реакцій на рівні функціонального протеому, які розвиваються з перших хвилин після взаємодії клітин з цитостатиком (Poulaki V. et al., 2001, Pakunlu R.I. et al., 2003). Дослідження останніх років в області молекулярної біології та теоретичної онкології привели до створення молекулярно-генетичної концепції дії цитостатиків, згідно з якою фармакологічний ефект розглядається як результат складної взаємодії між лікарським засобом і біомакромолекулами. Зміна властивостей клітинної поверхні, зокрема її плазматичної мембрани (ПМ), може значною мірою визначати трансмембранний транспорт та біологічну активність протипухлинних препаратів, в тому числі DOX (Чехун В.Ф., 1994, Cruz Silva M.M. et al., 2001, Konig S.A. et al., 2003). Показано, що виникнення резистентності пухлин до DOX найчастіше обумовлене зменшенням накопичення препарату всередині пухлинних клітин, що корелює з підвищенням експресії або активності трансмембранного енергозалежного транспортного білка Р-глікопротеїну, який здійснює активний транспорт цитостатиків з клітини назовні (Ambudkar S.V. et al., 1999). Необхідною умовою для нормального функціонування Р-глікопротеїну за лікарської резистентності є проникнення цитостатиків всередину ліпідного бішару плазматичної мембрани клітини (Romsicki Y., Sharom F.J., 1999). В свою чергу, активність Р-глікопротеїну та дифузія DOX через мембрану значною мірою залежить від її фізико-хімічного стану (Pallares-Trujillo J. et al., 2000, Gattoni M., Boffi A., 2003). Отже, чутливість пухлинних клітин до DOX значною мірою визначається структурно-функціональним станом плазматичної мембрани клітин.

Однак, існуючих даних щодо визначення мембранних ефектів DOX, механізмів розвитку резистентності пухлинних клітин до нього та окреслення шляхів її подолання на даний час все ще недостатньо. Тому широкий спектр комплексних експериментальних досліджень по вивченню епігеномного механізму дії DOX та розвитку резистентності до нього на рівні плазматичної мембрани є актуальним і має принципове значення для подолання лікарської резистентності пухлин при хіміотерапії онкологічних захворювань.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами інституту. Робота виконана у відповідності до плану науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України в рамках НДР за темами „Моделювання та дослідження процесу виникнення резистентності пухлини з метою пошуку позапухлинних маркерів їх резистентності” (РК0196U008369) та „Вивчення біологічних особливостей пухлинного процесу при формуванні фенотипу лікарської резистентності” (0101U000670). Метою дослідження є встановлення ролі структурно-функціональних змін плазматичної мембрани пухлинних клітин в механізмі резистентності до дії доксорубіцину.

Задачі дослідження:

1. Вивчити кінетику росту карциноми Герена та популяційний склад клітин карциноми Герена при формуванні резистентності до DOX;

2. Встановити фізико-хімічні особливості плазматичних мембран клітин карциноми Герена з різним ступенем чутливості до DOX. Дослідити вплив DOX на параметри зв'язування флуоресцентних зондів з ПМ клітин вихідного та резистентного до DOX штамів карциноми Герена;

3. Вивчити особливості складу ліпідів та вміст поліамінів у ПМ вихідного та резистентного до DOX штамів карциноми Герена;

4. Дослідити трансмембранний транспорт DOX у чутливому та резистентному до DOX штамах карциноми Герена;

5. Дослідити вплив мембраноактивних агентів на чутливість до дії DOX карциноми Герена.

Об'єкт дослідження: щури лінії Вістар з перещепленою карциномою Герена вихідного та резистентного до DOX штамів, суспензія ПМ пухлинних клітин та тканина карциноми Герена, клітини первинної культури карциноми Герена вихідного та резистентного штамів.

Предмет дослідження. Індукована лікарська резистентність до доксорубіцину, структурно-функціональний стан плазматичних мембран клітин карциноми Герена.

Методи дослідження: експериментальної онкології in vivo, фізико-хімічні, біофізичні, біохімічні, ЯМР- і ІЧ-спектроскопія, електронно-мікроскопічні, статистичні.

Наукова новизна. Вперше in vivo показані зміни ліпідного складу та просторових співвідношень між ліпідами та білками у плазматичних мембранах пухлинних клітин з фенотипом резистентності до DOX. Встановлено, що збільшення мікров'язкості ПМ пухлинних клітин, резистентних до DOX, обумовлено підвищеним вмістом холестеролу та поліамінів, меншим рівнем ненасиченості ліпідів порівняно з ПМ чутливих до дії DOX клітин. Показано, що зміна ліпідного складу ПМ клітин резистентних пухлин призводить до зменшення інтенсивності перебігу процесів перекисного окислення ліпідів під впливом DOX. Вперше доведено, що одним з механізмів виникнення резистентності до дії DOX є збільшення мікров'язкості ПМ пухлинних клітин із одночасним зменшенням пасивної дифузії DOX через мембрану без суттєвих змін активного транспорту даного цитостатика назовні.

Вперше in vivo показано, що застосування мембраноактивних речовин, які збільшують проникність плазматичних мембран пухлинних клітин, підвищує чутливість резистентних пухлин до дії доксорубіцину.

Практичне значення. Застосування комплексного підходу до вивчення біохімічного складу та структурних властивостей плазматичної мембрани клітин при формуванні лікарської резистентності пухлин до дії DOX дозволило встановити причини втрати чутливості до дії цитостатиків антрациклінового ряду.

Встановлені зміни структурно-функціонального стану плазматичних мембран клітин пухлин з індукованою резистентністю визначають можливість застосування мембраноактивних агентів, як специфічних модуляторів резистентності пухлин до DOX з метою покращання результатів лікування онкологічних хворих.

Особистий внесок здобувача. При виконанні дисертаційної роботи здобувачем була зібрана та проаналізована література за темою дисертації, самостійно проведені експерименти in vivo та in vitro, спектрофлуориметричні дослідження ПМ пухлинних клітин, визначення кількісного та якісного ліпідного складу ПМ, виділення ДНК, дослідження чутливості пухлин до дії DOX з визначенням ступеня гальмування росту пухлини, визначення активності окисного фосфорилювання у мітохондріях пухлинних клітин, запис та обробка 31Р-NMR спектрів ліпідів ПМ і визначення їх індексу ненасиченості. Самостійно проведена статистична обробка, теоретичне узагальнення результатів досліджень, формулювання основних положень та висновків роботи.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на: ІV науково-практичній конференції молодих онкологів України (Київ, 2001), XV Міжнародній школі-семінарі „Спектроскопія молекул та кристалів” (Чернігів, 2001), Міжнародному симпозіумі „Внутрішньоклітинні системи сигнальної трансдукції у рослин та тварин” (Київ, 2001), X з'їзді онкологів України (Ялта, 2001), 6 Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих учених (Тернопіль, 2002), VIII Українському біохімічному з'їзді (Чернівці, 2002), V конференції молодих онкологів України (Київ, 2002), 52ND Riga Stradins university's students conference in medicine (Riga, 2003).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 17 наукових робіт, в тому числі, 8 статей у провідних фахових журналах, 9 тез у матеріалах вітчизняних та міжнародних конференцій та з'їздів.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація викладена на 162 сторінках друкованого тексту та складається з вступу, огляду літератури, трьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення досліджень, висновків, списку літератури. Робота ілюстрована 11 таблицями, 29 рисунками. Список літератури містить 258 першоджерел, з них третина за останні 5 років.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведені на 756 щурах-самцях лінії Вістар масою 150-200 г розведення експериментальної бази Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України. При проведенні експериментальних досліджень керувались міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами. В роботі був застосований препарат доксорубіцин („Doxorubicin-Ebewe”, Австрія), дозволений для клінічного застосування. Дослідження були проведені на вихідному (чутливому) і резистентному до DOX варіантах штаму карциноми Герена. Вивчення впливу DOX були проведені на плазматичних мембранах пухлинних клітин карциноми Герена та клітинах первинної культури цього штаму.

Формування резистентності карциноми Герена до DOX проводили шляхом послідовних перещеплень пухлинних клітин, які отримували від щурів після курсового введення DOX. При першому пасажі 20 тваринам перевивали під шкіру стегна по 2х106 клітин карциноми Герена. Ці тварини були розподілені на дві групи: контрольну і дослідну. Щурам дослідної групи на 7-9 добу після перещеплення пухлини 5 разів вводили DOX в дозі 1,5 мг/кг внутрішньоочеревинно (в/о) через день.

Тварин з рецидивами пухлин після закінчення курсу хіміотерапії на 22-25 добу забивали шляхом декапітації під легким ефірним наркозом. З пухлин готували суспензію клітин, яку перещеплювали під шкіру щурам другого пасажу. Тварин ділили на контрольну і дослідну групи. Введення препарату в дослідній групі проводили за описаною вище схемою. Третій пасаж пухлин був аналогічний попередньому. На кожному етапі досліду у тварин визначали об'єм пухлини за трьома лінійними розмірами.

Для аналізу фізико-хімічних властивостей ПМ пухлинних клітин карциноми Герена тварини були розділені на групи: І група - щури з вихідною карциномою Герена, яким вводили фізіологічний розчин, IІ група - щури з вихідною карциномою Герена, яким вводили DOX в/о у максимально переносимій дозі 9,5 мг/кг, ІІІ група - щури з резистентним варіантом карциноми Герена, яким вводили фізіологічний розчин, ІV група - щури з резистентним варіантом карциноми Герена, яким в/о вводили DOX в дозі 9,5 мг/кг. Оцінку змін стану мембран проводили в динаміці після однократного в/о введення DOX в дозі 9,5 мг/кг маси через 15 хвилин, 1, 4, 24, і 96 годин. Вибір такого періоду досліджень був визначений, з одного боку, тривалістю життя мембранних структур (рециклізація мембранного самовідновлення становить 10-100 годин), а з другого - особливостями фармакокінетики DOX (Губский Ю.И. и соавт., 1998). Після отримання тканин, що досліджувались, всі наступні операції, для яких потрібна низька температура, проводились на холоді. Забір матеріалу у тварин проводився одночасно для всіх методів досліджень, що дозволило отримати порівнянні результати в межах кожної групи. Для дослідження модифікуючого впливу тритону Х-100 („Sigma”, США) та 2,4-динітрофенолу („Sigma”, США) на чутливість карциноми Герена до дії DOX тваринам було перещеплено резистентний до DOX штам карциноми Герена. Щури з перещепленою пухлиною були розподілені на 6 дослідних груп. І групу склали контрольні тварини з інтратуморальним введенням фізіологічного розчину в кількості 0,3 мл., що починали з 9-10 доби після перещеплення. До ІІ групи увійшли щури, котрим вводили лише DOX. Тварини, яким вводили інтратуморально тритон Х-100, склали ІІІ групу. Щурам ІV групи вводили DOX на фоні інтратуморального введення тритону Х-100. До V та VІ груп відповідно увійшли щури з вихідним штамом карциноми Герена та щури з вихідним штамом карциноми Герена, яким вводили DOX. Схема введення препаратів в усіх групах була однаковою: DOX вводили в/о п'ятикратно в дозі 1,5 мг/кг маси тіла, тритон Х-100 - інтратуморально п'ятикратно по 0,3 мл. 0,01% розчину.

Аналіз кінетики пухлинного росту на всіх етапах дослідження проводили за допомогою математичної моделі росту гетерогенних пухлин Вейбула (Weibull W., Sweden S., 1951):

Де:

V0 - початковий об'єм пухлини, що прищеплюється.

Параметр „а” відображає швидкість росту цілісної пухлини в експоненціальній фазі росту і обернено-пропорційний тривалості мітотичного циклу окремих пухлинних клітин. Параметр „в” є просторовим чинником, який характеризує у зворотно-пропорційній залежності швидкість гальмування росту пухлини за рахунок просторової упаковки клітин. в = 1 відповідає експоненціальному збільшенню кількості пухлинних клітин, що асинхронно діляться, у вигляді клітинної суспензії. tlag - латентний період росту перещепленої пухлини, обумовлений часом адаптації пухлинних клітин з подальшим формуванням агрегату цих клітин, здатного до росту в організмі, який визначається часом від моменту перещеплення пухлини до виявлення пальпованого вузла.

Кінетичні параметри росту пухлини а, в, tlag визначали для кожної тварини контрольної групи по кінетичних кривих росту, які розраховували експериментально методом нелінійної регресії за допомогою спеціально розроблених програм.

Протипухлинний ефект DOX визначали за показником гальмування росту пухлини. Для характеристики чутливості пухлини до впливу цитостатика використовували коефіцієнт гальмування росту пухлини (K), який розраховували за формулою:

Де:

Vk - середній об'єм пухлини в контрольній групі;

V? - середній об'єм пухлини в дослідній групі.

Для цього з моменту появи пухлини визначали її об'єм за трьома лінійними розмірами на протязі всього досліду. Об'єм пухлини (V) визначали за формулою:

Де:

I1, I2, I3 - ортогональні розміри пухлини.

Електрокінетичний потенціал (ЕКП) клітин карциноми Герена, як один з опосередкованих показників стану плазматичної мембрани, визначали згідно з методикою (Яніш Ю.В. та ін., 2001). Лінійну швидкість руху клітин в електричному полі вимірювали за допомогою приладу оригінальної конструкції проф. В.О. Шляховенка, що дає змогу використовувати дуже малі об'єми досліджуваних клітинних суспензій та зводить до мінімуму сторонні впливи на електрофоретичну рухомість клітин.

Виділення плазматичних мембран клітин з пухлинних клітин щурів проводили за методом диференційного ультрацентрифугування у градієнті щільності сахарози.

Концентрацію білка в суспензії плазматичних мембран визначали за методом Лоурі.

Чистоту мембранного препарату контролювали за активністю маркерних ферментів Na+, К+-АТФази і 5'-нуклеотидази та аналізували електронно-мікроскопічним методом негативного контрастування (Маtlieb M.A., 1974). Активність Na+, К+-АТФази у препараті ПМ була в 11 разів більшою порівняно з гомогенатом, а 5'-нуклеотидази - в 15 разів. Показники окисного фосфорилювання мітохондрій досліджували полярографічним методом з використанням закритого платинового електрода типу електрода Кларка (Todor I.N., Chekhun V.F., 1995).

Ліпідний склад ПМ пухлинних клітин оцінювали за вмістом фосфоліпідів і холестеролу. Фосфоліпіди з ПМ екстрагували методом двофазної екстракції (Tyagi R.K. et al., 1996). Якісний і кількісний склад фосфоліпідів ПМ визначали за допомогою 31Р-ЯМР-спектроскопії (Merchant T.E. et al., 1993). 31Р-спектри записували на ЯМР-спектрометрі „Mercury-300BB” (Varian, США) на частоті 121,46 МГц.

Аналіз вмісту загального холестеролу у ПМ проводили методом газо-рідинної хроматографії на хроматографі „Carlo Erba” (Італія), на скляних колонках (0,5 м.) з носієм 1,5% OV-1 на фазі Chimalite W (80-100 меш) („Shimadzu seikashu”, Японія) при 250 ОC. Дослідження інфрачервоних (ІЧ) спектрів фосфоліпідів проводили на серійному спектрометрі IFS-48 („Bruker”, Німеччина) з використанням приставки на відбивання. В якості підкладки були використані скляні пластинки з напиленим шаром золота товщиною 200-500 Е (Кейтс М., 1973, Chekhun V.F. et al., 2002). Загальний вміст та склад поліамінів (ПА) в ПМ пухлинних клітин визначали методом тонкошарової хроматографії з використанням флуориметрії (Abdel-Monem M.M., Ohno K., 1973). Активність орнітиндекарбоксилази (ОДК) в гомогенаті тканини пухлин визначали радіометричним методом (Russell D.H., Snyder S., 1968), диаміноксидази (ДАО) - за (Larsen P.M., Kemp A., 1964).

Індекс ненасиченості ліпідів ПМ пухлинних клітин визначали в екстракті ліпідів ПМ на аналізаторі подвійних зв'язків („AMMO”, Росія) із розрахунком кількості озону, яка витрачається при окисленні подвійних зв'язків поліненасичених жирних кислот за методом УФ-спектроскопії при довжині хвилі 250-310 нм (Тітов В.Н. та ін., 2002).

Хемілюмінесцентні показники перебігу процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) в пухлині вихідного та резистентного штамів карциноми Герена визначали у динаміці через 0,25, 1, 4, 24 та 48 год після введення тваринам препарату (Владимиров Ю.А., Арчаков А.И., 1972). Активність каталази у гомогенаті тканини пухлин визначали спектрофотометричним методом (Королюк М.А. та ін., 1988).

Флуоресцентне визначення інтегральних показників структурно-функціонального стану плазматичних мембран пухлинних клітин (зміна в'язкості, структурних перебудов, поверхневого заряду, трансмембранного потенціалу, концентрації води і т. п.) проводили за допомогою зондів - магнієвої солі 1-аніліно-8-нафталін сульфонату (АНС) та пірену („Sigma”, США). (Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е., 1980). Визначали константу зв'язування АНС, концентрацію місць зв'язування АНС на мембрані, індекс полярності та ступінь ексимеризації пірену в мембрані. Зміни цих величин обумовлені змінами величини заряду і ступеня упорядкованості ділянок мембрани, в які вбудовуються молекули зонду. При аналізі структурних змін в ПМ використовували також параметри власної білкової флуоресценції, індукованої при довжині хвилі 280 нм та 296 нм (Бурштейн Э.А., 1977), і ефективності індуктивно-резонансного переносу енергії (ІРПЕ) між донорно-акцепторними парами (ДАП). Ультраструктуру пухлинних клітин та їх плазматичних мембран досліджували за допомогою загальноприйнятих методів електронної мікроскопії.

Дифузію DOX та його накопичення всередині пухлинних клітин вивчали на первинній культурі карциноми Герена вихідного та резистентного до DOX штамів, яку отримували за (Stampfer, M.R., 1985). Активність дифузії DOX та його накопичення всередині пухлинних клітин визначали за зміною величини флуоресценції DOX в інкубаційному середовищі, яку визначали на спектрофлуриметрі „LS-3B” („Perkin Elmer”, Англія).

Математичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Стьюдента за допомогою пакету прикладних програм. Результати аналізу вважали достовірними при Р < 0,05.

Результати досліджень та їх обговорення. Відсоток гальмування росту пухлини вихідного штаму при курсовому лікуванні тварин препаратом у максимально переносимій дозі складав 60-65%, тоді як резистентного штаму, отриманого шляхом послідовних перещеплень карциноми Герена від тварин, що отримували курс ін'єкцій DOX - 7-9%. В процесі розвитку резистентності до DOX спостерігалась затримка виходу пухлин, зменшення кількості тварин з „повільним” типом росту карциноми Герена і збільшення кількості тварин з „швидким” типом росту пухлини. Ці монотонні зміни достовірно (R = 0,98) корелюють із змінами чутливості пухлини до дії DOX. „Швидкий” тип росту карциноми Герена виступає як маркер резистентності пухлини до DOX, тоді як „повільний” тип росту пов'язаний з більшою чутливістю карциноми до цього препарату. Субпопуляція клітин із „швидким” типом росту, на відміну від „повільного”, характеризувалась меншою тривалістю клітинного циклу та більшим ступенем пригнічення проліферації на пізніх стадіях росту пухлини за рахунок щільної просторової упаковки клітин. Відомо, що гальмування росту як нормальних, так і пухлинних клітинних популяцій, обумовлено існуванням саме клітинних механізмів інгібування проліферації за рахунок більш щільної упаковки клітин (Durand R.E., 1990). Найважливішу роль в цьому механізмі відіграє структура плазматичної мембрани, яка значною мірою залежить від складу ліпідів, білків, глікопротеїдів, гліколіпідів, мікрофіламентів і мікротрубочок (Лебедь О.І. та ін., 1997, Narita T. et al., 1998, Damiano J.S. et al., 1999).

Результати кінетичних досліджень щодо гетерогенності популяційного складу карциноми Герена підтверджуються даними електрокінетичних досліджень та морфології пухлини. Вихідний та резистентний до дії DOX штами карциноми Герена мають якісно відмінний характер розподілу клітин за значенням їх потенціалу. Клітини чутливого штаму мають тримодальний розподіл з медіанами мод, що дорівнюють 17, 25 та 31 мВ, тоді як клітини резистентного штаму мають бімодальний розподіл з максимумами, що дорівнюють 24 та 31 мВ.

Отримані результати дають підставу апроксимувати отриману варіабельність кінетики росту карциноми Герена з гетерогенністю самої пухлини і припустити існування в ній принаймні двох клітинних субпопуляцій, які відрізняються як за розподілом рівня потенціалу та показниками кінетики росту пухлини, так і чутливістю до дії DOX. Цей висновок добре узгоджується з даними літератури щодо структури клітинних популяцій карциноми Герена, які відрізнялися за кінетичними характеристиками росту і різною чутливістю до дії цисплатину, тіофосфаміду і опромінення (Казьмин С.Д., Колосов Е.В., 1980, Соляник Г.И. и др., 1992, Зінченко В.А. та ін., 1995).

При морфологічному дослідженні нами було встановлено, що клітини пухлини вихідного штаму специфічних міжклітинних контактів не утворювали. Проте, поодинокі високодиференційовані клітини вихідної пухлини, які зустрічались між основними масами низькодиференційованих клітин, поєднувалися у групи з 3-6 клітин, що контактували між собою лише незначною частиною своєї поверхні, утворюючи щільні контакти. Субстрат пухлин резистентного штаму карциноми Герена представлений більш високоорганізованими клітинами, в цитоплазмі яких міститься велика кількість внутрішньоклітинних органел. Клітини резистентної пухлини Герена розташовані не дуже щільно, з утворенням проміжків, де плазматичні мембрани клітин не контактують між собою. Але в місцях з'єднання мембран сусідніх клітин спостерігаються щільні міжклітинні контакти з утворенням складок на поверхні суміжних клітин. Такі специфічні утворення можуть виникати в результаті кластеризації мембранних глікопротеїнів за участю холестеролу та/або сфінголіпідів. Отримані дані вказують на високу гетерогенність популяційного складу клітин вихідного штаму карциноми Герена, в якому зустрічаються популяції клітин з властивостями, характерними для клітин резистентного до DOX штаму. Це свідчить про наявність селективного механізму формування резистентності карциноми Герена (Bradford R. et al., 1997, Richardson M.E., Siemann D.W., 1997).

Таким чином, в процесі виникнення резистентності до дії DOX співвідношення між двома клітинними субпопуляціями змінюється у напрямку зменшення чутливої до DOX субпопуляції і збільшення резистентної. Ці зміни носять монотонний характер і знаходяться в прямій кореляції із зниженням загальної чутливості пухлини, що узгоджується з клонально-селективною концепцією резистентності (Bradford R. et al., 1997).

Отримані нами феноменологічні зміни у резистентному штамі карциноми Герена обумовлені змінами структурно-функціонального стану плазматичних мембран клітин цього штаму. За допомогою спектрально-флуоресцентних методів досліджень нами були показані відмінності фізико-хімічних властивостей між плазматичними мембранами клітин вихідного та резистентного до DOX штамів карциноми Герена. Зокрема, у ПМ клітин резистентного до дії DOX штаму карциноми Герена відмічається достовірне зниження ступеня ексимеризації пірену на 29% та ефективності ІРПЕ між люмінофорами білків та піреном на 19-14% порівняно з ПМ клітин вихідного штаму. Ймовірність ексимеризації знижувалась внаслідок зменшення рухомості жирно-кислотних ланцюгів ліпідів, тобто збільшення мікров'язкості гідрофобних зон ліпідного матриксу. Отже гідрофобні ділянки ліпідного матриксу мембран резистентних клітин мають більшу мікров'язкість, що може призводити до зменшення дифузії цитостатиків, через мембрану. Нижча ефективність ІРПЕ між люмінофорами білків та піреном у ПМ клітин резистентного штаму свідчить про менший, порівняно з ПМ вихідного штаму, рівень занурення білків у ліпідний матрикс. Було показано зменшення ІРПЕ між люмінофорами білків та АНС у ПМ резистентних клітин на 24% і збільшення кількості місць зв'язування АНС у 1,9 рази порівняно з ПМ клітин вихідного штаму. Ці дані вказують на те, що АНС на поверхні мембран резистентного штаму зв'язується з іншими, не білковими групами молекул.

Табл. - Зміни структурної організації плазматичних мембран клітин карциноми Герена з фенотипом резистенності до доксорубіцину:

При вивченні впливу DOX на структуру ПМ пухлинних клітин in vivo було встановлено достовірне збільшення мікров'язкості гідрофобних ділянок ліпідного матриксу ПМ клітин вихідної карциноми Герена після одноразового введення препарату. Отже вже після однієї ін'єкції DOX клітини карциноми Герена можуть формувати резистентність до нього. Таке припущення підтверджується і тим, що через 15 хв. після введення DOX структурні характеристики ПМ клітин вихідної пухлини дуже схожі на показники структурних властивостей ПМ резистентних клітин. Однак у більш віддалені терміни досліджень такі особливості структури ПМ, як конформація мембранних білків, побудова ліпід-білкових комплексів та заряд мембранної поверхні, змінювались навіть у протилежному напрямку, по відношенню до тих, які реєструвалися до введення препарату. З тих же позицій можна інтерпретувати підвищення після дії препарату мікров'язкості ліпідного бішару ПМ резистентних до DOX клітин та відмінності між характером впливу DOX на побудову ліпід-білкових комплексів у ПМ чутливих та резистентних клітин.

Таким чином, отримані дані дають підстави вважати, що в механізмі феномену резистентності пухлинних клітин до DOX, крім добре вивченого шляху, пов'язаного з гіперекспресією транспортного білка Р-глікопротеїну, суттєва роль належить змінам структурних властивостей ПМ.

Методом ЯМР-спектроскопії були показані відмінності у ПМ за вмістом холестеролу та деяких фосфоліпідів між клітинами чутливої та резистентної до DOX карциноми Герена.

Рівень фосфатидилсерину на 25%, а сфінгомієліну - на 26,1% більшим у ПМ резистентних клітин порівняно з ПМ вихідного штаму, а відзначене збільшення вмісту сфінгомієліну обумовлює вірогідне зменшення відношення фосфатидилхолін/сфінгомієлін у ПМ резистентних клітин. Зменшення на 24,4% індексу ненасиченості загальних ліпідів ПМ клітин резистентної до DOX карциноми Герена, збільшення вмісту холестеролу, зменшення відношення фосфатидилхолін/сфінгомієлін та індексу ненасиченості ліпідів, зокрема ненасичених жирних кислот, призводить до збільшення мікров'язкості ПМ резистентних клітин. Це супроводжується уповільненням пасивної дифузії цитостатика через мембрану та зменшенням його накопичення всередині пухлинних клітин. Крім того, зафіксоване збільшення вмісту фосфатидилсерину у ПМ клітин резистентного штаму карциноми Герена може опосередковано свідчити про активацію Р-глікопротеїну в результаті фосфорилювання цього білка фосфатидилсерин-залежною протеїнкіназою С (Pajeva I.K. et al., 1996).

Рис. 1. - Кількість холестеролу (a) та індекс ненасиченості ліпідів (б) у ПМ клітин вихідного та резистентного до доксорубіцину штамів карциноми Герена (ПМ клітин вихідного штаму, - ПМ клітин резистентного штаму):

Утворення специфічних ущільнених ділянок на поверхні клітин резистентного штаму карциноми Герена та збільшення вмісту сфінголіпідів і холестеролу може вказувати на появу так званих кавеол, які, за даними літератури, утворюються в резистентних пухлинних лініях клітин у відповідь на дію цитостатиків та чітко відмежовуються від інших фосфоліпідів ПМ з утворенням мікродоменів (Masserini M., Ravasi D., 2001).

Припускається, що саме кавеоли беруть участь у транспорті мембранних ліпідів та у системі сигнальної трансдукції клітини (Ikonen E., 2001). Також вважається, що білки, які приймають участь у механізмах резистентності, зокрема, Р-глікопротеїн, переважно локалізуються у кавеолах (Bandorowicz-Pikula J., 2000).

Ініціація вільнорадикального окислення ліпідів DOX розглядається як опосередкований мембранозв'язаний механізм цитотоксичної дії цього цитостатика (Tritton T.R., 1991). В наших дослідженнях під впливом DOX спостерігалось вірогідне, порівняно з контролем, збільшення на 62% світлосуми хемілюмінесценції ПМ клітин вихідного штаму з максимумом на 4 год. після введення препарату. На відміну від вихідного, у пухлині резистентного штаму протягом усього терміну спостереження не було зафіксовано достовірних змін світлосуми хемілюмінесценції пухлини під впливом DOX. Крім того, активність каталази була на 31% більшою порівняно з вихідним штамом, що вказує на активацію антиоксидантного захисту у клітинах резистентного штаму карциноми Герена. Відсутність ініціації процесів вільно-радикального окислення в клітинах резистентного штаму карциноми Герена під впливом DOX обумовлена більшою захищеністю мембран від негативної дії активних радикалів, тобто збільшенням мікров'язкості мембран, зменшенням індексу ненасиченості ліпідів та вищою активністю каталази.

Відомо, що поліаміни є необхідною структурною одиницею ПМ клітин та беруть участь в процесах регуляції проліферації клітин (Thomas T.J., 2003, Wallace H.M., 2003). Було показано, що в плазматичних мембранах вихідного і резистентного до DOX штамах карциноми Герена вміст зв'язаних форм ПА значно перевищував концентрацію їх вільних форм (в ПМ клітин вихідного штаму - у 8,5 рази, а в ПМ резистентних клітин - у 4,4 рази). Крім того, в мембранах резистентного штаму вміст обох форм ПА перевищував такий в чутливих пухлинах. Зокрема, у ПМ клітин резистентного штаму вміст вільної форми спермідину у 4 рази та сумарних поліамінів у 2,7 рази, а зв'язаних форм путресцину - у 2,3 рази та сумарних поліамінів - у 1,4 рази більший порівняно з ПМ клітин вихідного штаму. Збільшення вмісту зв'язаних форм поліамінів вказує на підвищення впорядкованості структури ПМ резистентних клітин, що, в свою чергу, може впливати на проникність мембран, зокрема, для цитостатиків (Залеток С.П., Бердинских Н.К., 1987, Casero R.A. et al., 2003). В резистентному до DOX штамі карциноми Герена має місце збільшення активності орнітиндекарбоксилази на 56% та зниження активності диамінооксидази на 41% порівняно з чутливим до цього препарату штамом. Отже, в результаті дослідження ПМ карциноми Герена нами було показано збільшення мікров'язкості та впорядкованості її структури при виникненні резистентності до дії DOX, що може призводити до порушення проникнення цитостатиків всередину пухлинних клітин. Дослідження клітинної фармакокінетики DOX у вихідному та резистентному штамах карциноми Герена підтвердили гіпотетичний висновок досліджень структури МП та показали зменшення проникнення DOX всередину клітин резистентного штаму порівняно з вихідним. При вивченні внеску пасивної дифузії DOX в клітини та активного транспорту цього цитостатика з клітин вихідного та резистентного штамів карциноми Герена було встановлено, що за 1,5 год інкубації при 4оС (за таких умов активний транспорт цитостатиків з клітини назовні зводиться до мінімуму, а DOX потрапляє в клітину виключно за рахунок пасивної дифузії) в клітинах резистентного штаму накопичується в 2 рази менше DOX порівняно з вихідним.

Після інкубації цих клітин при 37оС (за таких умов забезпечується нормальне функціонування мембранозв'язаних транспортних білків) не було достовірних змін у кількості препарату в інкубаційному середовищі клітин вихідного та резистентного до DOX штамів, що вказує на однакову інтенсивність активного транспорту DOX в клітинах обох штамів. Таким чином, показано, що зменшення накопичення DOX в клітинах резистентного штаму карциноми Герена обумовлено зниженням пасивної дифузії препарату через ПМ, а не елімінацією з клітини за рахунок активного транспорту. На користь даного твердження свідчить також відсутність вірогідних змін енергопродуктивності окислювального фосфорилювання в мітохондріях резистентного штаму карциноми Герена порівняно з вихідним, оскільки саме окислювальне фосфорилювання є потужним енергопродуктивним механізмом в клітинах, які потребують великої кількості АТФ для повноцінного функціонування системи активного транспорту цитостатиків через ПМ. Отже, зміни стану ПМ клітин карциноми Герена при виникненні резистентності до DOX обумовлюють зменшення накопичення DOX всередині клітин та зниження цитостатичної дії препарату за рахунок зменшення пасивної дифузії DOX через мембрану, що може розглядатися як один з механізмів розвитку резистентності пухлин до DOX. Доказом такого висновку є вірогідне підвищення чутливості резистентного штаму карциноми Герена до DOX під впливом тритону Х-100. Тритон Х-100 є неіонним детергентом, який збільшує проникність ПМ клітин за рахунок зменшення мікров'язкості та впорядкованості ліпідного бішару мембран. Нами було показано, що при одночасному застосуванні DOX і тритону Х-100 спостерігається вірогідне гальмування росту пухлин резистентного штаму на 53% порівняно з тваринами, яким вводили лише DOX (рис. 2.).

Рис. 2. - Гальмування росту карциноми Герена під впливом доксорубіцину (1), тритону Х-100 (2) та їх сумісної дії (3) через 23 доби після перещеплення тваринам пухлини:

При цьому тритон Х-100 не викликав гальмування росту резистентної карциноми Герена. Отже отримані нами дані підтверджують формування резистентності пухлин до DOX за механізмом, який пов'язаний саме із зменшенням проникності ПМ пухлинних клітин для цього цитостатика.

Таким чином, нами доведено, що зміни структурно-функціонального стану плазматичної мембрани пухлинних клітин, зокрема її проникності, відіграють ключову роль у формуванні резистентності пухлин до дії DOX.

Крім того, застосування речовин або інших факторів, які здатні змінювати властивості ПМ пухлинних клітин, збільшуючи їх проникність, може бути перспективним напрямком у пошуку модифікаторів лікарської резистентності при хіміотерапії злоякісних новоутворень.

ВИСНОВКИ

В роботі за допомогою широкого спектру комплексних експериментальних досліджень показано, що зміни структурно-функціонального стану плазматичної мембрани пухлинних клітин відіграють суттєву роль у феномені резистентності пухлин до дії доксорубіцину:

1. Пухлини резистентного штаму карциноми Герена до доксорубіцину характеризуються більшою швидкістю росту в експоненціальній фазі, уповільненням темпів росту у термінальній фазі, більшою гомогенністю популяційного складу пухлини порівняно з вихідним. Для клітин резистентних пухлин характерним є наявність незначних ділянок плазматичних мембран сусідніх клітин, які утворюють щільні міжклітинні контакти;

2. Плазматичні мембрани клітин резистентної до доксорубіцину карциноми Герена за структурним станом відрізняються від плазматичних мембран вихідної пухлини більш поверхневим розташуванням триптофанових та тирозинових залишків амінокислот білків, меншим рівнем занурення білків у ліпідний матрикс та його більшою мікров'язкістю;

3. Встановлено, що зміна структурного стану плазматичних мембран клітин резистентної пухлини обумовлена високим вмістом холестеролу, зменшенням відношення фосфатидилхолін/сфінгомієлін, меншим рівнем ненасиченості ліпідів мембран та більшим вмістом зв'язаних форм поліамінів у мембрані клітин;

4. Ступінь пошкодження плазматичних мембран пухлинних клітин доксорубіцином, що мають різну чутливість до дії цього препарату, залежить від стану текучості їх ліпідної компоненти, яка обумовлює швидкість перебігу процесів перекисного окислення ліпідів;

5. Суттєвим механізмом зменшення накопичення доксорубіцину всередині клітин резистентного штаму карциноми Герена є уповільнення пасивної дифузії цитостатиків в клітину через мембрану за рахунок підвищення мікров'язкості та впорядкованості ліпідного бішару плазматичної мембрани;

6. Доведено, що речовини, які впливають на фізико-хімічні властивості плазматичних мембран, підвищуючи їх проникність, збільшують чутливість резистентних пухлин до дії доксорубіцину.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Чехун В.Ф., Тодор И.Н., Соляник Г.И., Кулик Г.И., Триндяк В.П. Особенности окислительного фосфорилирования и энергетического статуса чувствительной и резистентной к доксорубицину карциномы Герена // Экспериментальная онкология. - 2000. - Т. 22, №4. - С. 195-199 (автором було виділено мітохондрії з пухлинних клітин, визначено показники окисного фосфорилювання у мітохондріях, проведено статистичну обробку результатів).

2. Тодор И.Н., Трындяк В.П., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Окислительное фосфорилирование в чувствительных и резистентных к доксорубицину и цисплатине подштаммах карциномы Герена // Актуальні проблеми медицини і біології: збірник наукових праць. - Київ, 2001. - №1. - С. 312-317 (автором визначено активність окисного фосфорилювання у мітохондріях пухлинних клітин, проведено статистичну обробку результатів).

3. Триндяк В.П., Тодор І.М., Михайленко П.М., Кулик Г.І., Чехун В.Ф. Вплив доксорубіцину на фізико-хімічні параметри плазматичних мембран вихідного та резистентного до доксорубіцину штаму карциноми Герена // Актуальні проблеми медицини і біології: збірник наукових праць. - Київ, 2002. - №1. - С. 396-400 (автором проведено експерименти in vivo, спектрофлуориметричне дослідження плазматичних мембран пухлинних клітин, здійснено статистичну обробку результатів).

4. Чехун В.Ф., Кулик Г.І., Триндяк В.П., Тодор І.М. Молекулярно-біологічні аспекти структурно-функціонального стану клітинної поверхні як основа розвитку нової стратегії терапії раку // Онкологія. - 2002. - Т. 4, №1. - С. 4-8 (автор здійснив пошук наукової літератури за темою статті, брав участь у аналізі літератури та написанні статті).

5. Чехун В.Ф., Триндяк В.П., Лебедь О.І., Маковецький В.П., Тодор І.М., Кулик Г.І. Характер змін структурних властивостей плазматичних мембран клітин карциноми Герена при формуванні резистентності до доксорубіцину // Доп. НАН України. - 2002. - №.10. - С. 182-186 (автор проводив постановку експерименту, спектрофлуориметричне дослідження плазматичних мембран пухлинних клітин, статистичну обробку результатів, брав участь у написанні статті).

6. Chekhun V.F., Lebed O.I., Tryndyak V.P., Makovetskiy V.P., Todor I.N., Kulik G.I. Structural alterations of plasma membranes of Guerin's carcinoma cells upon the development of resistance to doxorubicine // Exp. Oncology. - 2002. - Vol. 24, №4. - P. 279-283 (автор проводив постановку експериментів, спектрофлуориметричне дослідження плазматичних мембран пухлинних клітин, статистичну обробку результатів, брав участь у написанні статті).

7. Chekhun V.F., Solyanik G.I., Kulik G.I., Tryndiak V.P., Todor I.N., Dovbeshko G.I., Repnytska O.P. The SEIRA Spectroscopy data of nucleic acids and phospholipids from sensitive- and drug-resistant rat tumours // J. Exp. Clin. Cancer Res. - 2002. - Vol. 21, №4. - P. 599-607 (автор проводив постановку експериментів, виділяв ДНК та фосфоліпіди з плазматичних мембран пухлинних клітин, здійснював статистичну обробку результатів).

8. Чехун В.Ф., Триндяк В.П., Тодор І.М., Михайленко В.М., Кондричин І.Г., Довбешко Г.І., Репницька О.П., Кулик Г.І. Вміст фосфоліпідів та холестеролу у плазматичних мембранах пухлинних клітин з різною чутливістю до доксорубіцину // Укр. біохім. журн. - 2003. - Т. 75, №4. - С. 120-125 (автор проводив постановку експериментів, виділяв ліпіди з ПМ пухлинних клітин, записував та обчислював 31Р-NMR спектри ліпідів ПМ, визначав індекс ненасиченості ліпідів, проводив статистичну обробку результатів).

9. Чехун В.Ф., Триндяк В.П., Михайленко П.М. Вплив доксорубіцину на фізико-хімічні параметри плазматичних мембран вихідного та резистентного до доксорубіцину підштаму карциноми Герена // Тези доповідей IV Республіканської науково-практичної конференції молодих онкологів України. - Київ, 2001. - С. 23.

10 Dovbeshko G.I., Repnytska O.P., Tryndiak V.P., Todor I.M., Solyanik G.I. Spectroscopic studies structural peculiarities of DNA and lipids from resistant and sensitive cancer tissues // Mater. XV Int. school-seminar “Spectroscopy of molecules and crystals”. - Chernihiv, 2001. - P. 199.

11. Chekhun V.F., Tryndiak V.P., Mikhailenko P.M., Mikhailenko V.M. The changes of functioning conditions of Guerin carcinoma cells signal transduction system at the development of resistance to doxorubicin // Mater. Int. symp.“Intracellular signalling in plant and animal systems”. - Kyiv, 2001. - P. 56.

12. Соляник Г.И., Юрченко О.В., Трындяк В.П., Кулик Г.И., Чехун В.Ф. Передача фенотипа лекарственной резистентности как форма опухолевой прогрессии // Тези доповідей X з'їзду онкологів України. - Ялта, 2001. - С. 59.

13. Триндяк В.П., Тодор І.Н., Кондричин І.Г., Репницька О.П., Чехун В.Ф. Особливості якісного та кількісного складу фосфоліпідів плазматичних мембран карциноми Герена при формуванні резистентності до доксорубіцину // Тези доповідей 6 Міжнар. медичного конгресу студентів і молодих учених. - Тернопіль, 2002. - С. 250.

14. Залеток С.П., Бердинских Н.К. Лялюшко Н.М., Александрова Н.О., Триндяк В.П. Особливості метаболізму поліамінів у пухлинних клітинах, резистентних до хіміотерапевтичних препаратів // Матеріали VIII Українського біохімічного з'їзду. - Біохім. журн. - 2002. - Т. 74, №4а. - С. 39.

15. Тодор І.Н., Триндяк В.П., Ковтонюк О.В., Кулик Г.І., Чехун В.Ф. Деякі метаболічні особливості карциноми Герена на ранньому та пізньому етапах формування її резистентності до доксорубіцину // Матеріали VIII Українського біохімічного з'їзду. - Укр. біохім. журн. - 2002. - Т. 74, №4а. - С. 184. онкологічний мембрана кров

16. Триндяк В.П., Шпильова С.І., Кулик Г.І., Чехун В.Ф. Транспорт доксорубіцину через плазматичну мембрану чутливих та резистентних до його дії пухлинних клітин // Тези доповідей V конф. молодих онкологів України „Сучасні аспекти експериментальної та клінічної онкології”. - Київ, 2002. - С. 16.

17. Tryndiak V.P., Shpyleva S.I., Todor I.N., Kulik G.I., Chekhun V.F. Structural alterations of plasma membranes and transport of drug in doxorubicine sensitive and resistant Guerin's carcinoma cells // Mater. 52ND Riga Stradins university's students conference in medicine. - Riga, 2003. - Р. 58.

Размещено на Allbest.ru