Обмін та зв’язок поліамінів з функціонуванням ядерного фактору транскрипції NF-kB при пухлинах молочної залози
Взаємодія поліамінів з ядерним фактором транскрипції NF-кB. Вплив сперміну і путресцину на зв’язування р50 з NRE. Аналіз здатності сперміну взаємодіяти з р50 субодиницею NF-кB. Вміст білків-продуктів онкогенів в клітинах раку в умовах виснаження ПА.
| Рубрика | Медицина |
| Вид | автореферат |
| Язык | украинский |
| Дата добавления | 29.07.2014 |
| Размер файла | 56,3 K |
Отправить свою хорошую работу в базу знаний просто. Используйте форму, расположенную ниже
Студенты, аспиранты, молодые ученые, использующие базу знаний в своей учебе и работе, будут вам очень благодарны.
Размещено на http://www.allbest.ru/
НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ
ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ ПАТОЛОГІЇ,
ОНКОЛОГІЇ І РАДІОБІОЛОГІЇ ім. Р.Є. КАВЕЦЬКОГО
АЛЕКСАНДРОВА Наталія Олександрівна
УДК: 616-006:618.19:547.415.5:577.214
ОБМІН ТА ЗВ'ЯЗОК ПОЛІАМІНІВ З ФУНКЦІОНУВАННЯМ
ЯДЕРНОГО ФАКТОРУ ТРАНСКРИПЦІЇ NF-B
ПРИ ПУХЛИНАХ МОЛОЧНОЇ ЗАЛОЗИ
14.01.07 - онкологія
АВТОРЕФЕРАТ
дисертації на здобуття наукового ступеня
кандидата біологічних наук
Київ - 2005
Дисертацією є рукопис.
Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, м. Київ.
Науковий керівник
кандидат біологічних наук
Залєток Софія Петрівна,
в.о. завідувача відділу біохімії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Офіційні опоненти:
доктор біологічних наук
Сидоренко Світлана Павлівна,
завідувач лабораторії сигнальних каскадів клітин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України;
кандидат біологічних наук
Гуніна Лариса Михайлівна,
старший науковий співробітник відділу анестезіології та інтенсивної терапії Інституту онкології АМН України.
Провідна установа
Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра онкології та медичної радіології, м. Львів.
Захист відбудеться 20 квітня 2005 р. о 13 годині 30 хвилин на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за адресою: 03022, м. Київ, вул. Васильківська, 45.
З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України.
Автореферат розісланий ”19 ” березня 2005 р.
Вчений секретар спеціалізованої вченої ради,
доктор медичних наук Н.В. Бородай
ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ
поліамін онкоген ядерний фактор
Актуальність теми. Внутрішньоклітинні поліаміни спермін, спермідин і путресцин (небілкові, полікатіонні речовини) - відіграють важливу роль у проліферації як нормальних, так і злоякісних клітин. Поліаміни (ПА) необхідні для росту всіх без винятку клітин еукаріот. Виявлено, що клітини, які швидко ростуть, наприклад злоякісні, мають вищий вміст ПА, порівняно з клітинами, які ростуть повільно або знаходяться у стані спокою (Залєток С.П. та ін., 2000; Cohen S.S. 1998; Bachrach U. et al., 2001). Дослідження ПА при пухлинному рості проводяться в чотирьох головних напрямках: вивчення молекулярних механізмів участі ПА у процесах ініціації, росту і прогресії неоплазій; використання інгібіторів синтезу ПА і аналогів ПА як терапевтичних засобів; визначення рівня ПА і активності ферментів їх біосинтезу для діагностики злоякісних пухлин, оцінки ефективності терапії і прогнозу перебігу захворювання; використання інгібіторів синтезу ПА для профілактики в групах з високим ризиком захворювання.
ПА залучені до численних метаболічних процесів, зокрема, до синтезу нуклеїнових кислот і білків, беруть участь в процесах передачі клітинних сигналів, впливають на функціонування мембран (Бердинських Н.К., Залєток С.П., 1987; Bachrach U. et al., 2001; Gerner E et al., 2004). Але молекулярні механізми участі ПА у виникненні злоякісних новоутворень вивчені недостатньо.
Так, майже нічого не відомо про здатність ПА впливати на функціонування факторів транскрипції онкогенів. Існують лише поодинокі і суперечливі дані про взаємозв'язок ПА з активністю ядерного фактору транскрипції NF-B в пухлинних клітинах (Shah N. et al., 2001; Pfeffer L. et al., 2001), хоча роль самого фактора NF-B в розвитку пухлинних захворювань визнана. Багато робіт присвячено вивченню процесінгу та механізмів активації факторів транскрипції, що належать до REL-родини, дослідженню їх ролі в процесах запалення та імунної відповіді. В той же час, більшість питань стосовно регуляції активності NF-B і його значення в бластогенезі залишаються відкритими.
На сьогодні відомо, що сайт зв'язування з NF-B міститься в промоторних та енхансерних регіонах великої кількості генів, в тому числі тих, що беруть участь в стимуляції клітинної проліферації, запобіганні апоптозу та процесі ангіогенезу (Pahl H., 1999). Показано, що інгібування активності NF-B може призводити до значного підвищення чутливості ракових клітин до апоптозних сигналів (Bargou R. et al., 1997). Є попередні дані, які свідчать, що NF-B бере участь у розвитку раку молочної залози (РМЗ) та показано, що NF-B активується в процесі росту in vitro багатьох ліній пухлинних клітин молочної залози (Dejardin E. et al., 1999).
Про взаємозв'язок ПА і ядерного фактору транскрипції відомі лише такі факти. Дослідження, проведені на культурі клітин раку молочної залози MCF-7, показали, що ПА (найбільшою мірою спермін) сприяють взаємодії NF-B - ДНК (Shah N. et al., 1997; Shah N. et al., 2001). В роботах Li L. et al., 2001; Pfeffer L. et al., 2001 було показано, що при виснаженні ПА в епітеліальних клітинах шлунково-кишкового тракту (ІЕС-6) збільшується базальний рівень білка NF-B, відбувається транслокація NF-B в ядро і активується здатність NF-B зв'язуватись з відповідною послідовністю ДНК. В цих же дослідженнях було показано, що через модуляцію активності фактору NF-B можна ініціювати апоптоз.
Таким чином, все вищесказане свідчить про актуальність дослідження молекулярних механізмів дії ПА, зокрема участі ПА в регуляції активності фактору транскрипції NF-B і експресії деяких контрольованих ним онкогенів.
Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалась в рамках теми „Дослідження ролі ПА в регуляції експресії окремих онкогенів фактором транскрипції NF-kB при пухлинному рості” (шифр 2.2.5.232, номер держреєстрації 0103U000786) відділу біохімії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є.Кавецького НАН України. Частину роботи було виконано за підтримки фонду Цивільних Досліджень і Розвитку США „Role of polyamines in transcriptional regulation of genes involved in neoplastic growth” (UB1-2446-KV-02) та гранту Міністерства освіти і науки України по програмі Фундаментальні дослідження „Роль ПА в регуляції процесів транскрипції онкогенів при неопластичному рості” (№ Ф7/428-2001).
Мета дослідження. Метою даної роботи було дослідження показників обміну ПА і їх зв'язку з функціонуванням фактору транскрипції NF-B в пухлинах молочної залози.
Задачі дослідження:
- дослідити здатність ПА взаємодіяти з ядерним фактором транскрипції NF-B;
- дослідити вплив ПА на зв'язування NF-B з відповідними послідовностями ДНК;
- вивчити вплив модуляції метаболізму ПА на транслокацію субодиниць фактору NF-B в ядра пухлинних клітин молочної залози;
- дослідити вплив модуляції метаболізму ПА в пухлинах молочної залози на вміст білків - продуктів онкогенів, транскрипція яких регулюється фактором NF-B;
- вивчити показники обміну ПА у хворих на рак молочної залози.
Об'єкт дослідження: операційний матеріал (пухлинна та макроскопічно незмінена тканина молочної залози) і сеча хворих на РМЗ; ядерні та клітинні екстракти пухлин карциносаркоми Уокер-256 молочної залози щурів, пухлин карциноми Са 755 молочної залози мишей, клітин лінії МCF-7 РМЗ людини; комерційні препарати субодиниці р50 фактора NF-B, синтетичні 19-мірні дволанцюгові олігонуклеотиди з генів, експресія яких регулюється NF-B.
Предмет дослідження: вміст ПА в пухлинній та макроскопічно незміненій тканині молочної залози і в сечі хворих на РМЗ; тривалість життя хворих на РМЗ; вміст субодиниць р50 та р65 фактору NF-B, а також рівень експресії білків с-myc і bcl-XL в пухлинах молочної залози.
Методи дослідження. Вміст ПА визначали методом тонкошарової хроматографії, активність орнітиндекарбоксилази в пухлинній тканині хворих на РМЗ визначали радіометричним методом з використанням 14С-орнітину. Для вивчення впливу ПА на зв'язування NF-B - ДНК застосовано метод флуоресцентного безвипромінювального переносу енергії. Для вивчення впливу ПА на взаємодію NF-B - ДНК методом поверхневого плазмонного резонансу (ППР), на сенсорних чіпах було ковалентно імобілізовано білок р50 з застосуванням способу модифікації поверхні сенсорного чіпа, який включає обробку соєвим інгібітором трипсину з наступною „прошивкою” глутаровим альдегідом. Для вивчення вмісту білків р50, р65, с-myc, bcl-XL застосовано методи ППР і Вестерн-блоттінгу. Для обгрунтування можливості зв'язування ПА з фактором NF-B було застосовано методи комп'ютерного моделювання. Для вивчення кореляції між рівнем ПА і тривалістю життя хворих на РМЗ використано статистичний аналіз.
Наукова новизна одержаних результатів. Вперше в модельних дослідах показана здатність ПА зв'язуватись з ядерним фактором транскрипції NF-B. Показано, що природні ПА, на відміну від інгібітору їх біосинтезу б-дифторметилорнітину (б-ДФМО) та синтетичного полікатіону, впливають на процес зв'язування NF-B з відповідними послідовностями ДНК. Вперше виявлено, що в умовах виснаження ПА збільшується вміст р50 і р65 субодиниць фактору NF-B в ядрах клітин раку молочної залози. Показано, що при виснаженні ПА відбувається зменшення рівня експресії білків - продуктів онкогенів c-myc i bcl-XL. Вперше показана чітка кореляція між ступенем підвищення вмісту ПА у сечі хворих на РМЗ та зменшенням тривалості їх життя.
Практичне значення одержаних результатів. Отримано дані, що свідчать про здатність ПА взаємодіяти з ядерним фактором транскрипції NF-B і показана можливість впливати на функціонування фактору NF-B, змінюючи метаболізм ПА.
За допомогою статистичного методу виділення головних компонент запропоновано сумарний поліамінний показник, який включає дані про вміст ПА (сперміну, спермідину та путресцину) в сечі хворих і значення якого корелює з тривалістю життя хворих на РМЗ. Цей показник може бути одним із критеріїв при виборі оптимальної стратегії лікування конкретного пацієнта.
Розроблено новий метод хімічної модифікації золотої поверхні сенсорних чіпів спектрометра ППР для ковалентної імобілізації білків із використанням cоєвого інгібітора трипсину та глутарового альдегіду, який може бути застосований в різноманітних дослідженнях білків за допомогою методу ППР.
Особистий внесок здобувача. Здобувачем особисто проведені дослідження з використанням методів поверхневого плазмонного резонансу та флуоресцентного безвипромінювального переносу енергії, мічення білка р50 флуоресцентним барвником RB, підібрано оптимальні умови для проведення дослідів ППР і FRET, підготовлено зразки для вивчення вмісту білків р50 і р65 методами ППР та Вестерн-блот аналізу. Автор дисертації розробив метод хімічної модифікації золотої поверхні сенсорних чіпів спектрометра ППР для ковалентної імобілізації білків. При дослідженнях методами комп'ютерного моделювання здобувачем розраховано константи дисоціації комплексу р50ДНК за відсутності та у присутності сперміну. Вивчення вмісту ПА та активності ферментів їх метаболізму проводилось разом з к.б.н., в.о. зав. відділу біохімії пухлин Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України Залєток С.П. Відомості про тривалість життя хворих на РМЗ було зібрано автором за даними архіву Інституту онкології АМН України. Автором самостійно проведено статистичну обробку результатів і сформульовано основні положення дисертаційної роботи.
Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені та обговорені на: школі-семінарі молодих вчених „Биология - наука 21-го века” (Пущино, Росія, травень 2002); 28-му Щорічному з'їзді Федерації європейських біохімічних товариств (Стамбул, Туреччина, жовтень 2002); конференції-конкурсі молодих вчених в ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України (Київ, грудень 2002); ІІІ З'їзді онкологів і радіологів СНД (Мінськ, Беларусь, травень 2004) і Установчому з'їзді Українського товариства клітинної біології (Львів, квітень 2004).
Публікації. За результатами дисертації опубліковано 5 статей у фахових наукових журналах та 6 тез у збірках українських та міжнародних конференцій, видано 1 деклараційний патент на винахід.
Структура та обсяг дисертації. Роботу викладено на 132 сторінках. Вона складається з вступу, огляду літератури, експериментальної частини (4 розділи), заключення, висновків та списку літературних джерел - 206 посилань, в тому числі 190 зарубіжних. Робота ілюстрована 34 рисунками та 13 таблицями.
ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ
Матеріал та методи дослідження. Досліди проводились на 92 статевозрілих мишах-самицях лінії C57Bl/6, вагою 18-22 г, розводки віварію ІЕПОР ім.Р.Є. Кавецького НАН України, керуючись міжнародно прийнятими правилами проведення робіт з експериментальними тваринами. В роботі використано перещеплювальний штам карциноми молочної залози Са 755, отриманий з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Для ведення штаму використано 22 тварини. Для дослідів пухлину перещеплювали внутрішньом'язево, вводячи тварині 5 млн. клітин. В кожному з дослідів, яких було шість, тварин поділяли на 2 групи (по 5-6 тварин в кожній групі): контрольна (нелікована) та тварини, що отримували -ДФМО в дозі 500 мг/кг. Препарат вводили в черевну порожнину.
Також проведено п'ять дослідів на 68 безпородних щурах, вагою 130-150 г з карциносаркомою Уокер-256 (W-256). Для ведення штаму використано 14 тварин. Пухлину перещеплювали підшкірно, в розрахунку 5-7106 клітин/тварину в 0,1 мл фізіологічного розчину. Щурів поділяли на дві групи (по 5-6 тварин в кожній групі). Перша група - контрольні тварини (неліковані). Друга - тварини, що отримували інтраперітоніальні ін'єкції -ДФМО в дозі 500 мг/кг маси (в першому досліді), або 1000 мг/кг маси (в наступних дослідах).
Початкову ін'єкцію -ДФМО тваринам робили в день появи першої пальпаторно реєстрованої пухлини, другу та третю - на наступні дві доби. Через добу після останньої ін'єкції тварин присипляли ефіром, пухлину видаляли, зважували та використовували для приготування ядерних і клітинних екстрактів.
Досліди також проводили на клітинній лінії раку молочної залози людини MCF-7, одержаній з Банку клітинних культур ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України. Було проведено 5 експериментів. Клітини культивували на середовищі Dulbecco-ISCOV (“Sigma”, США) з додаванням 10% ембріональної телячої сироватки ("Сяйво”, Львів, Україна) та антибіотика гентаміцину в концентрації 40 мкг/мл при температурі 37оС та при насиченні повітря 5% СО2 в культуральних флаконах об'ємом 150 см3 (“Sigma”), що містили 20 мл середовища. Початкова концентрація клітин становила приблизно 106 клітин на флакон. Через 72 години після пересіву клітин культуральне середовище видаляли і вносили у флакони нову порцію чистого середовища (2 флакона в кожному експерименті), або середовище з додаванням 5мМ -DFMO (2 флакона), або середовища з додаванням 5мМ -DFMO та 510-7M путресцину (2 флакона). З цими агентами клітини культивували протягом 72 годин, механічно збирали, двічи промивали ізотонічним розчином NaCl і використовували для приготування ядерних та клітинних екстрактів.
Дослідження активності ОДК і вмісту ПА в пухлинах проведені на операційному матеріалі, отриманому у 52 хворих з пухлинами молочної залози віком 37-62 роки, які перебували на лікуванні в Інституті онкології АМН України. Із них у 26 пацієнток була виявлена ІІ стадія; у 10 - ІІІ стадія РМЗ. У 16 пацієнток виявлені передпухлинні захворювання: фіброаденоми (9) та локалізований вузловий фіброаденоматоз (7).
Дослідження ПА сечі проведені у 70 хворих з пухлинами молочної залози віком 29-67 років; у 54 пацієнток, згідно даних гістологічного діагнозу, було виявлено рак, у 16 передпухлинні захворювання.
Як матеріал для статистичного дослідження наявності зв'язку між вмістом ПА і тривалістю життя пацієнтів було використано дані про вміст ПА у сечі 57 хворих на РМЗ віком 35-65 років, отримані к.б.н., с.н.с. відділу біохімії пухлин ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України Залєток С.П.
Біохімічні методи дослідження. Вміст ПА визначали методом тонкошарової хроматографії на платівках 2020 см, „Сілуфол” (Чехія) у системі хлороформ - ізопропанол (100 : 4) при кімнатній температурі з подальшим флуориметричним визначенням кількості дансильованих похідних ПА.
Активність орнітиндекарбоксилази (ОДК) визначали радіометричним методом. Ферментативну активність оцінювали за кількістю 14СО2, який утворювався протягом 60 хв. інкубації при 37ОС. Радіоактивність зразків визначали на рідинному сцинтиляційному лічильнику. За одиницю активності ОДК приймали таку кількість ферменту, яка каталізує утворення 1 пмоль 14СО2 протягом 60 хв. інкубації при 37ОС. Питому активність ферменту визначали у одиницях активності на 1 мг білка.
Аналітичний гель-електрофорез (SDS-PAGE) виконували за модифікованою методикою Лемлі. Використовували такі буферні розчини: анодний буфер: 0,2 М трис-НСl, рН 8,9; катодний буфер: 0,1 М трис, 0,1 М трицин, рН 8,25; буфер для концентруючого гелю: 0,71 М трис-НСl, рН 8,45, 0,1% SDS; буфер для розділяючого гелю: 1 М трис-НСl рН 8,45, 0,1% SDS; акриламід та метилен-біс-акриламід - у вигляді “Acryl/Bis 37,5 : 1 Solution 30%” (“Anachem”, США). Смуги білків забарвлювали Кумасі блакитним R-250 (“Sigma”, США). Використовували маркери молекулярної маси “Ultra-low Range Molecular Weight Marker (1,06-26,6)” (“Sigma”, США).
Вестерн-блот аналіз (імуноблотаналіз). Після електрофорезу здійснювали електроперенесення білків з поліакриламідного гелю на нітроцелюлозну мембрану Hybond ECL (Amersham Pharmacia Biotech, Швеція) у наступній буферній системі: 48 мМ трис; 39 мМ гліцин; 0,037% SDS; 20% метанол. Після блокування вільних місць зв'язування за допомогою знежиреного молока, мембрану поміщали на 4 години при 37оС у розчин моноклональних антитіл миші проти досліджуваних білків р50 або р65 (Santa Cruz Biotech., CA, USA), а потім у розчин вторинних IgG кози проти антитіл миші, кон'югованих з пероксидазою хріну (Santa Cruz Biotech., CA, USA). Після цього мембрану інкубували в системі детекції ECL (Santa Cruz Biotech., CA, USA) (0,125 мл кожного реагенту ECL на 1см2 мембрани). Після 2-хвилинної інкубації мембрану прикладали до рентгенівської плівки (“Фотон”, Україна). Експозиція тривала 2 хв. при кімнатній температурі. Дані Вестерн-блотінгу було оброблено за допомогою комп'ютерної програми TotalLab.
Вміст загального білка в ядерних та клітинних екстрактах визначали за методом Бредфорд.
Метод флуоресцентного безвипромінювального переносу енергії (FRET). При вивченні зв'язування р50 з відповідними послідовностями ДНК (NRE) за допомогою методу FRET у якості донора та акцептора використовували флуоресцентні барвники родамін В (RB) і Texas Red (TR), відповідно. Перший був ковалентно приєднаний до білка р50, другий - до 3-кінця одного з ланцюгів штучно синтезованих дволанцюгових олігонуклеотидів NRE. Послідовність одного з комплементанрих ланцюгів: 5-ACGGCAGGGGATTCCCTCT-3. Флуоресценцію збуджували при 530 нм (короткохвильова частина піка поглинання RВ). Ефективність FRET визначали за співвідношенням інтегральних інтенсивностей піків емісії TR (615 нм) та RB (575 нм), які було визначено після розкладання спектрів на компоненти за допомогою програми „Siano”, яка заснована на ітераційному нелінійному методі найменших квадратів, на базі алгоритма Флетчера-Пауелла.
Метод поверхневого плазмонного резонансу (ППР). Використовували спектрометр ППР “Biosuplar-5” і супутнє обладнання (сенсорні чіпи, проточні кювети), розроблені в Інституті фізики напівпровідників НАН України під керівництвом проф. Ю.М. Ширшова. При інтерпретації даних, одержаних методом ППР, вважали, що зміна кута ППР (“відгук ППР”) прямо пропорційна масовій поверхневій концентрації білка.
Для вивчення впливу ПА на процес зв'язування р50 субодиниці фактора транскрипції NF-B з відповідними послідовностями ДНК (NRE) була застосована наступна процедура: 1) на проміжний шар імобілізували р50 субодиницю у 0,01 М натрій-ацетатному буфері, рН 5,5, протягом 30 хв.; 2) для блокування залишкових альдегідних груп до кювети ППР вводили 0,1 М розчин етаноламіну в 0,05 М натрій-фосфатному буфері, рН 7,3, протягом 30 хв.; 3) послідовності ДНК вводили до кювети ППР в буфері Дігнама (20 мМ HEPES; 0,1 M KCl; 0,2 мМ ЕДТА; 0,5 мМ феніл-метил-сульфоніл-фторид; 0,5 мМ дитітреітол).
Для вивчення вмісту білків р50, р65, c-myc, bcl-XL в екстрактах клітин за методом ППР була застосована наступна процедура: 1) на проміжний шар імобілізували моноклональні антитіла мишей проти досліджуваного білка (Santa Cruz Biotech., CA, USA) в концентрації 2 мкг/мл у 0,01 М натрій-ацетатному буфері, рН 5,5, протягом 30 хв. з наступним промиванням кювети цим же буфером протягом 10 хв.; 2) для блокування залишкових альдегідних груп до кювети ППР вводили 0,1М розчин етаноламіну в 0,05 М натрій-фосфатному буфері, рН 7,3 протягом 30 хв; 3) в кювету вводили ядерний (або клітинний) екстракт, який містив 10-100 мкг загального білка (оптимальною виявилася кількість загального білка 25-50 мкг) в буфері 10 мМ HEPES, 150 мМ NaCl, 0,1% Tween-20.
Методи комп'ютерного моделювання. Пошук потенційних сайтів зв'язування NF-В з ПА проводили методом гнучкого молекулярного докінгу за допомогою програми “Autodock v3.5” та ригідного докінгу (програма НЕХ 2.4). Просторові структури ПА побудували за допомогою програми AgrusLab 1.0. Структуру NF-kB одержали із брукхевенської білкової бази даних (Protein Data Bank). Моделювання механізму впливу ПА на функціонування NF-B проводили згідно програми MOIL2000. На всіх етапах як допоміжна програма для оптимізації геометрії та для виправлення грубих помилок, згенерованих іншими методами, використовувалась програма АgrusLab.
Для вивчення кореляції між рівнем ПА у сечі хворих на РМЗ і тривалістю їх життя було проведено статистичний аналіз (застосовано метод виділення головних компонент; метод імовірнісного прогнозування, що базується на теоремі Баєса; критерій Колмогорова та стандартні статистичні методи).
Результати досліджень та їх обговорення. При вивченні обміну ПА у хворих з пухлинами молочної залози було виявлено, що вміст ПА в злоякісних пухлинах в декілька разів перевищує їх вміст у макроскопічно незміненій тканині і значно вищий, ніж в прилеглій до пухлини тканині. Так, вміст путресцину в злоякісних пухлинах перевищував такий у макроскопічно незміненій тканині молочної залози у 3,56 рази, спермідину у 4,02 рази, сперміну у 4,82 рази. Слід зазначити, що концентрація ПА в тканині передпухлинних новоутворень також вища, ніж в незміненій тканині в 1,5 рази. Проте сумарна концентрація ПА і вміст їх окремих фракцій значно менші від такого в злоякісних пухлинах.
Активність ОДК в тканині злоякісних пухлин виявилась в 5,5 рази вища, ніж в макроскопічно незміненій тканині молочної залози. В передпухлинних новоутвореннях активність ОДК в 3,7 рази нижча, ніж у злоякісних пухлинах.
Було показано, що рівень екскреції ПА у хворих на РМЗ, незалежно від стадії, підвищений в 2,6 рази у порівнянні з показниками пацієнток з передпухлинними захворюваннями та в 4,8 рази, порівняно з фізіологічною нормою. Дослідження залежності вмісту ПА сечі хворих від наявності у них метастазів виявило вірогідне збільшення екскреції ПА у хворих з метастазами, порівняно з даними у хворих без виявлених метастазів.
Статистичний аналіз показав існування чіткої кореляції між ступенем підвищення рівня поліамінів в сечі та зменшенням тривалості життя хворих на РМЗ. За вмістом трьох поліамінів (сперміну, спермідину та путресцину) статистичним методом виділення головних компонент запропоновано сумарний поліамінний показник (ПП), який може бути застосований як додатковий фактор прогнозу перебігу злоякісного процесу.
Отримані результати, а також дані численних публікацій, свідчать, що ПА відіграють важливу роль у злоякісному рості. Але молекулярні механізми, які лежать в основі впливу поліамінів, залишаються нез'ясованими.
Одиничні роботи останніх років вказують на те, що ПА здатні регулювати експресію ряду генів, важливих для росту і проліферації пухлинних клітин, впливаючи на функціонування фактору транскрипції NF-B (Shah N. et al., 2001; Li L. et al., 2001; Pfeffer L. et al., 2001). Механізм цього впливу на сьогодні залишається невідомим.
Дослідження взаємодії ПА з ядерним фактором транскрипції NF-B методами комп'ютерного моделювання. Для вивчення можливого впливу ПА на функціонування ядерного фактору NF-B було проведено серію модельних дослідів, зокрема, застосовано методи комп'ютерного моделювання. В роботі вони використовувались, щоб одержати вихідні „пілотні” дані про можливість та характер впливу поліамінів на взаємодію NF-B із специфічними послідовностями ДНК. При моделюванні впливу ПА на функціональну активність NF-B було поставлено дві задачі: по-перше, знайти потенціальний сайт зв'язування та приблизно оцінити константи дисоціації для комплексів сперміну, спермідину та путресцину з NF-B; по-друге, визначити механізм можливого впливу поліамінів на функціональну активність NF-B.
Глобальне сканування всієї поверхні білка NF-B і поліаміну на наявність оптимальної суперпозиції силових полів показало, що найбільш вірогідний сайт зв'язування розташований в зоні міждоменного інтерфейсу білка р50. Дослідження області взаємодії ліганда (поліамін) і амінокислот сайту зв'язування показало, що такий комплекс може виникати за рахунок утворення водневих зв'язків ПА з Ser297, Asp298, Ser170, Arg295 і Ван-дер-Ваальсових взаємодій з Тyr200.
Розрахунок співвідношення констант дисоціації комплексу р50ДНК за відсутності та у присутності сперміну показав, що афінність р50 до ДНК у присутності сперміну зростає в 2,6 рази. Наявність поліаміну сприяє стабілізації міждоменного інтерфейсу білка р50 і зменшує вірогідність спонтанної дисоціації комплексу р50ДНК.
Дослідження впливу сперміну і путресцину на зв'язування р50 з NRE методом флуоресцентного безвипромінювального переносу енергії. Для експериментальної перевірки моделі регуляції транскрипції ПА, запропонованої на основі результатів комп'ютерного моделювання, застосовано метод FRET. Було виявлено, що ефективність переносу енергії між двома флуорофорами, якими мітили послідовності ДНК та р50 субодиницю фактору NF-B, зростає зі збільшенням концентрації сперміну в розчині в інтервалі від 1 до 150 мкМ і при подальшому підвищенні концентрації сперміну до 500 мкМ виходить на плато. У випадку преінкубації сперміну (150 мкМ) з NRE перед додаванням p50, позитивний ефект сперміну на утворення комплексу NREр50, хоча і незначно, але більш виражений, ніж при додаванні сперміну в тій же концентрації до суміші NRE + p50.
Путресцин в інтервалі концентрацій до 150 мкМ спричиняє збільшення ефективності переносу енергії, а отже, сприяє зв'язуванню NRE з р50. Збільшення концентрацій путресцину не спричиняє подальшого зростання зв'язування NRE - р50.
Дослідження впливу сперміну, синтетичного аналога сперміну і -ДФМО на зв'язування р50 з NRE методом ППР. Здатність сперміну сприяти зв'язуванню р50 - NRE була підтверджена методом ППР. При введенні в кювету спектрометра ППР 1 мМ розчину сперміну спостерігалось збільшення зв'язування р50NRE в 2,6 рази.
В експериментах in vivo для виснаження в клітинах пулу ПА використовували інгібітор їх біосинтезу -ДФМО. Тому було доцільним перевірити здатність -ДФМО безпосередньо впливати на зв'язування р50 - ДНК. Викликає інтерес і потенційна здатність синтетичного полікатіону впливати на цей процес. На сьогодні в світі активно займаються пошуком аналогів поліамінів, які б мали подібну до природних поліамінів структуру, або, як і поліаміни, несли полікатіонний заряд. Такі синтетичні речовини конкурують з природніми поліамінами за сайти зв'язування, але не мають їх функціональних властивостей і можуть бути використані в терапії злоякісних новоутворень.
Наступна серія дослідів показала, що обидві сполуки, на відміну від природного сперміну, не здатні сприяти взаємодії р50NRE в умовах in vitro. Отриманий результат свідчить про специфічну дію сперміну на процес зв'язування фактора транскрипції з відповідними послідовностями ДНК.
Аналіз здатності сперміну взаємодіяти з р50 субодиницею фактору NF-B. Для встановлення здатності ПА взаємодіяти з білком р50, було проведено наступні експерименти. На платівку ППР було імобілізовано спермін (концентрація в розчині під час імобілізації 1 мМ); далі в кювету вводили розчин р50 в 0,05 М натрій-фосфатному буфері, рН 7,3. Контролем був сенсорний чіп, на який замість сперміну було нанесено етаноламін.
Отримані результати стали першим експериментальним доказом того, що спермін дійсно здатний зв'язуватись не лише з послідовностями ДНК (що само по собі може змінювати конформацію ДНК і впливати на процес транскрипції), але й з білком р50.
Дослідження вмісту білків р50 і р65 в клітинах раку молочної залози в умовах виснаження/акумуляції ПА. В цих дослідах було використано експериментальні моделі пухлин молочної залози (карциному молочної залози мишей Са 755 та карциносаркому молочної залози щурів Уокер-256), а також культуру клітин пухлин молочної залози людини MCF-7. Для інгібування біосинтезу поліамінів було використано б-ДФМО, який у використаних дозах призводив до суттєвого зменшення концентрації путресцину і до зменшення концентрацій спермідину і сперміну в ядрах клітин карциноми Са 755 та карциносаркоми Уокер-256. Виснаження ПА в пухлинах, індуковане введенням -ДФМО, супроводжувалося затримкою росту пухлинних клітин. Для карциноми Са 755 коефіцієнт гальмування росту складав 22%.
Було встановлено, що введення мишам з карциномою молочної залози Ca 755 -ДФМО в дозі 500 мг/кг супроводжувалось збільшенням вмісту білка р50 в ядрах досліджуваних клітин приблизно в 2 рази. При цьому вміст субодиниці р65 в ядрах клітин Са 755 не змінювався (табл.1).
Аналогічні дослідження були проведені також на іншому об'єкті - щурах з карциносаркомою молочної залози Уокер. Було показано, що введення щурам -ДФМО в дозі 500 мг/кг не призводить до помітної затримки росту пухлин. Тому в наступних дослідах доза -ДФМО була збільшена до 1000 мг/кг. За таких умов коефіцієнт гальмування пухлинного росту складав 58%.
Таблиця 1. Вміст білків р50 і р65 в ядерних екстрактах клітин карциноми Са 755 і карциносаркоми Уокер в умовах введення б-ДФМО
|
Тип пухлини: |
Поверхневі концентрації білків що зв'язались зі специфічними антитілами, імобілізованими на сенсорних чіпах, нг/мм2 |
||||
|
Білок р50 |
Білок р65 |
||||
|
Контроль |
+-ДФМО (5 мM) |
Контроль |
+ -ДФМО (5 мM) |
||
|
Карцинома Са 755 |
0,300,05 |
0,530,06* |
0,420,06 |
0,430,03 |
|
|
Карциносаркома Уокер-256 |
0,330,05 |
0,570,08* |
0,500,08 |
0,690,09 |
Примітка: * - Р<0,05 порівняно з даними в контролі
Введення -ДФМО в такій дозі призвело не лише до збільшення вмісту білка р50 в ядрах клітин карциносаркоми Уокер-256 на 72,85,3%, але й до збільшення вмісту білка р65 на 37,22,8% (табл.1). Отже, вміст білка р65 також зростав, але приблизно в два рази менше, ніж білка р50. Одержані результати були підтверджені і за допомогою Вестерн-блот аналізу.
В наступній серії експериментів, які проводили на культурі клітин раку молочної залози MCF-7, було вивчено як впливає на вміст субодиниць р50 і р65 фактора транскрипції NF-B і стан виснаження ПА і їх акумуляція. Для цього в першому випадку в середовище росту клітин додавали лише -ДФМО, а в другому -ДФМО разом з путресцином. Додавання в культуральне середовище лише -ДФМО викликало зменшення вмісту поліамінів. Додавання путресцину разом з -ДФМО нівелювало стан виснаження ПА і призводило до відновлення і навіть підвищення їх рівнів.
Додавання в культуральне середовище лише -ДФМО супроводжувалось збільшенням вмісту субодиниці р50 в ядрах клітин MCF-7 на 75,06,9%. Тобто результати цих досліджень подібні до даних експерименту на тваринах. У випадку сумісного додавання -ДФМО з путресцином вміст білка р50 виявився дещо нижчим, ніж в ядрах контрольних клітин.
Подібні результати були отримані і для субодиниці р65. У випадку введення лише -ДФМО в культуральне середовище, вміст р65 в ядерному екстракті збільшився на 32,42,8%, при додаванні -ДФМО разом з путресцином, рівень р65 став також нижчим за контрольне значення.
Таким чином, результати досліджень показали, що в умовах дії б-ДФМО, вміст р50 і, значно меншою мірою, р65 субодиниці ядерного фактору транскрипції NF-B збільшується в ядрах клітин карциноми молочної залози мишей Са 755, карциносаркоми молочної залози щурів Уокер-256 та лінії раку молочної залози людини MCF-7. Додавання путресцину разом з -ДФМО нівелює стан виснаження ПА та вплив деплеції ПА на білки р50 і р65.
Дослідження вмісту білків-продуктів онкогенів с-myc і bcl-XL в клітинах раку молочної залози в умовах виснаження поліамінів. З даних літератури відомо, що активація фактору транскрипції NF-B може призводити як до апоптозу, так і захищати від нього, стимулювати або гальмувати проліферацію клітин. Тому важливо було визначити, як впливає виснаження ПА на вміст білків, транскрипція генів яких регулюється фактором NF-B. Серед численних генів, регуляція експресії яких опосередкована фактором NF-B, для дослідження було обрано гени с-myc та bcl-XL, оскільки, по-перше, ці гени досить добре вивчені, по-друге, їхні білкові продукти відіграють важливу роль у злоякісному рості.
Вміст білків с-myc i bcl-XL було досліджено в клітинних екстрактах карциноми молочної залози мишей Са 755, карциносаркоми молочної залози щурів Уокер-256 та лінії раку молочної залози людини MCF-7. На всіх трьох моделях показано, що при введенні б-ДФМО вміст білків с-myc i bcl-XL в пухлинних клітинах зменшується.
Рівень білка bcl-XL в клітинах MCF-7 достовірно відрізнявся від такого в контрольних клітинах (на 34,2%). В клітинах Са 755 і Уокер-256 ця різниця склала 30% і 22% відповідно. Щодо білка c-myc, то спостерігалася лише тенденція до зменшення його вмісту в клітинах, оброблених б-ДФМО, на 16% (для клітин Са 755 і MCF-7) і на 21% для клітин Уокер-256.
Отже, в умовах б-ДФМО-індукованого виснаження пулу поліамінів фактор транскрипції NF-B не здатний повноцінно виконувати функцію транскрипції по відношенню до досліджуваних генів.
Отримані дані свідчать, що однією з молекулярно-біологічних мішеней дії ПА може бути ядерний фактор транскрипції NF-B. Впливаючи на функціонування фактору NF-B, поліаміни виявляються залученими до регуляції транскрипції таких важливих онкогенів, як с-myc i bcl-XL.
Нами виявлено, що природні ПА здатні не лише безпосередньо взаємодіяти з субодиницею р50 фактору NF-B, але й сприяють (на відміну від -ДФМО та синтетичного полікатіону) утворенню комплексу р50 зі специфічними послідовностями ДНК. В ядрах клітин раку молочної залози в умовах б-ДФМО-індукованого виснаження ПА спостерігалось збільшення вмісту субодиниць р50 і р65. Слід зазначити, що вміст субодиниці р50 зростав в значно більшій мірі, ніж р65. При компенсації -ДФМО-індукованого виснаження ПА шляхом додавання путресцину цей ефект нівелювався. Незважаючи на підвищення вмісту р50 і р65 в ядрах, експресія білків с-myc i bcl-XL в умовах виснаження ПА зменшувалась.
Модельні досліди показали, що в присутності поліамінів комплекс р50 - ДНК є більш стабільним. Відповідно, деплеція ПА, викликана введенням -ДФМО, дестабілізує комплекс NF-B - ДНК, що, ймовірно, заважає транскрипції NF-B-залежних генів, зокрема с-myc i bcl-XL.
Крім зменшення стабільності комплексу NF-B - ДНК, обумовленого -ДФМО-індукованим виснаження ПА, іншою причиною зниження експресії генів с-myc i bcl-XL, контрольованих NF-B, є значний надлишок в ядрі субодиниці р50 порівняно з р65, який ми спостерігали при введенні -ДФМО. Надлишок р50 міг сприяти зсуву динамічної рівноваги в бік утворення гомодимерів р50/р50. Відомо, що спорідненість гомодимера р50/р50 та гетеродимера р50/р65 до різних олігонуклеотидів значно відрізняється (до 1000 разів). Не зважаючи на те, що гомодимер р50/р50, за деякими даними літератури, здатний “запускати” транскрипцію певних генів (Kurland J. et al., 2001), його спорідненість до різних послідовностей ДНК ніколи не буває вищою, ніж спорідненість гетеродимера р50/р65 до цих самих олігонуклеотидів (Udalova I.A. et al., 2002). Більш того, існують дані, що комплекс р50/р65 для свого функціонування потребує наявності ПА меншою мірою, ніж комплекс р50/р50 (Urban M.B. et al, 1991). Отже, в умовах деплеції поліамінів, зсув рівноваги в бік утворення малостабільного, схильного до дисоціації комплексу р50/р50-ДНК, який саме і потребує ПА, призводить до зниження транскрипції генів-мішеней.
Зважаючи на складність сигнальних шляхів, слід також розглянути можливість опосередкованого впливу змін метаболізму ПА на функціонування фактору NF-B.
В даній роботі представлені дані, які свідчать, що при виснаженні ПА за допомогою введення в клітини -ДФМО, певний чинник (або чинники) заважають функціонуванню NF-B на етапі, коли він вже надійшов у ядро. Якщо раніше вважалось, що активація NF-B залежить виключно від фосфорилювання його інгібіторного білка в цитоплазмі (Baeuerle P. et al., 1996; Ghosh S., 1999), то зараз доведено, що існує і інший рівень регуляції вже після надходження NF-B в ядро - фосфорилювання власне субодиниць NF-B (Schmitz M. et al., 2001).
Згідно даних літератури, деплеція ПА, індукована -ДФМО, гальмує процес фосфорилювання мітоген-активованих протеїнкіназ (МАPК). Інгібування сигнальних каскадів МАPК, в свою чергу, призводить до зменшення рівня фосфорилювання субодиниць NF-B, які вже надійшли у ядро, і до гальмування його транс-активаційної та ДНК-зв'язуючої функцій. Наслідком цього є зниження рівня експресії генів, контрольованих NF-B (Tantini B. et al., 2004; Stefanelli C. et al., 2002).
На основі проведених досліджень і з урахуванням відомих фактів, можна запропонувати гіпотетичну схему впливу змін метаболізму ПА на функціонування ядерного фактора NF-B:
1 - в умовах деплеції ПА комплекс NF-B - NRE є менш стабільним;
2 - в умовах деплеції ПА зростає імовірність утворення гомодимера р50/р50 (а не класичного NF-B), який не здатний повноцінно виконувати функцію транскрипції, але конкурує з NF-B за сайти зв'язування;
3- виснаження ПА гальмує процес фосфорилювання МАРК, що, в свою чергу, перешкоджає утворенню фосфорильованого NF-B і знижує його ДНК-зв'язуючу активність.
Одержані дані сприяють розумінню молекулярних механізмів функціонування ПА та фактору NF-B в пухлинах молочної залози. Слушно припустити, що виявлені ефекти впливу ПА на функціонування фактору NF-B лежать в основі одного з молекулярних механізмів проканцерогенної дії ПА.
ВИСНОВКИ
Робота присвячена дослідженню показників обміну поліамінів в пухлинах молочної залози і вивченню взаємозв'язку між метаболізмом поліамінів в пухлинах і функціонуванням фактора транскрипції NF-B.
1. Показано, що вміст поліамінів і активність орнітиндекарбоксилази в пухлинній тканині молочної залози значно вищі, ніж в макроскопічно нормальній тканині.
2. Виявлена негативна кореляція між вмістом поліамінів у сечі хворих, прооперованих з приводу РМЗ та тривалістю їх життя; запропоновано нову кількісну характеристику (поліамінний показник), яка може бути застосована як додатковий фактор прогнозу перебігу захворювання у хворих на РМЗ.
3. Методами комп'ютерного моделювання та поверхневого плазмонного резонансу показано, що ПА здатні зв'язуватись з субодиницею р50 фактора транскрипції NF-B; виявлено, що ПА сприяють утворенню комплексу NRE - NF-B.
4. Виснаження поліамінів за допомогою -дифторметилорнітину призводить до значного збільшення вмісту субодиниці р50 і помірного субодиниці р65 фактора транскрипції NF-B у ядрах клітин експериментальних пухлин молочної залози.
5. При компенсації -ДФМО-індукованого виснаження ПА шляхом додавання путресцину, ефект деплеції ПА на NF-B нівелюється.
6. Виснаження ПА за допомогою -дифторметилорнітину в пухлинних клітинах молочної залози призводить до зниження вмісту білків-продуктів онкогенів с-myc і bcl-XL. Найбільш імовірно це є наслідком зменшення транскрипційної активності ядерного фактору транскрипції NF-B.
СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ
Залєток С.П., Бердинських Н.К., Лялюшко Н.М., Тарутінов В.І., Скляр С.Ю., Александрова Н.О. Показники метаболізму поліамінів в пухлинних тканинах та в сечі хворих з новоутвореннями молочної залози//Онкологія. - 2000. - Т.2, № 4. - С.250-252. (Автором визначено вміст поліамінів у підготовлених зразках спектрофлуориметричним методом, брала участь у обговоренні результатів та написанні статті).
Залєток С.П., Яковенко О.Я., Александрова Н.О., Голуб А.Г., Чехун В.Ф. Дослідження взаємодії поліамінів з ядерним фактором транскрипції NF-kappaB методами комп'ютерного моделювання//Український біохімічний журнал. - 2002. - Т.74, № 5. - С. 133-138. (Автор сформулював задачі для комп'ютерних програм, розрахував константи дисоціації комплексу р50ДНК за відсутності та у присутності сперміну, брав участь у написанні статті).
Zaletok S., Aleхandrova N., Berdynskykh N., Ignatenko N., Gogol S., Orlovsky О., Tregubova N., Gerner E., Chekhun V. Role of polyamines in the function of nuclear transcription factor NF-B in breast cancer cells//Experimental Oncology.- 2004. - Vol.26, N3. - P.221-225. (Автором виконано досліди методом ППР, приготовлено ядерні та клітинні екстракти для дослідів, підготовлено частину рукопису).
Александрова Н.О., Авілов С.В., Залєток С.П. Вплив сперміну та путресцину на зв'язування фактора транскрипції NF-kappaB зі специфічними послідовностями ДНК//Український біохімічний журнал. - 2004 .- Т.76, № 6. - С. 76-82. (Автор виконав всі досліди, брав участь в обговоренні результатів та підготував більшу частину рукопису статті).
Александрова Н.О., Залєток С.П., Скляр С.Ю., Тарутінов В.І. Застосування статистичного аналізу для визначення цінності поліамінного тесту в прогнозуванні тривалості життя хворих раком молочної залози // Вісник проблем біології і медицини. - 2004. - Вип. 4. - С. 108-114. (Автором проаналізовані дані про тривалість життя хворих, виконано математичний аналіз даних, підготовлено рукопис статті).
Александрова Н.О., Авілов С.В., Веревка С.В., Костюкевич К.В., Залєток С.П., Ширшов Ю.М. Спосіб модифікації поверхні золота для імобілізації біологічних молекул. Деклараційний патент на винахід № 48537 А, 15.08.2002, Бюл. № 8. (Автор виконав досліди методом ППР, брав участь у обговоренні результатів, підготував основну частину рукопису заявки на патент).
Залєток С.П., Бердинських Н.К., Лялюшко Н.М., Александрова Н.О., Скляр С.Ю., Носа П.П. Вміст поліамінів та активність орнітиндекарбоксилази в пухлинних тканинах та фізіологічних рідинах хворих на новоутворення молочної залози//Матеріали Х З'їзду онкологів України. - Ялта, 2001. - С.39.
Александрова Н.А., Яковенко А.Я., Залеток С.П. Исследование взаимодействия полиаминов с ядерным фактором транскрипции NF-kappaB методами компьютерного моделирования // Сборник тезисов 6-й Пущинской школы-конференции молодых ученых “Биология - наука 21-го века”. - Пущино, 2002. - C. 208.
Aleхandrova N.A., Zaletok S.P. Nuclear transcriptional factor NF-kappaB - DNA interaction: influence of polyamines // Abstr. 28th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies. - Стамбул, 2002 // The FEBS Journal. - 2002. - Vol. 269, № 1. - P. 108.
Александрова Н.О. Дослідження впливу поліамінів, їх аналогів та інгібіторів на зв'язування ядерного фактору транскрипції NF-kappaB з ДНК // Тези V конференції молодих онкологів України. - Київ, 2002. - С.3.
Александрова Н.А., Залеток С.П., Бердинских Н.К.,. Гоголь С.В, Чехун В.Ф. Исследование роли полиаминов в регуляции экспресии онкогенов фактором транскрипции NF-kappaB при опухолевом росте // Материалы III Съезда онкологов и радиологов СНГ. - Минск, 2004. - С.326.
Александрова Н.О., Залєток С.П. Вміст поліамінів у сечі хворих, прооперованих з приводу раку молочної залози, та їх виживання//Матеріали Міжнародної науково-практичної конференції „Сучасний стан і проблеми експериментальної та клінічної медицини”. - Тернопіль, 2004//Медична хімія. - 2004. - Т.6, № 3. - С.156.
АНОТАЦІЯ
Александрова Н.О. Обмін та зв'язок поліамінів з функціонуванням ядерного фактору транскрипції NF-B при пухлинах молочної залози. - Рукопис.
Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2005.
Дисертацію присвячено вивченню взаємозв'язку між метаболізмом поліамінів (ПА) і функціонуванням ядерного фактору транскрипції NF-B.
Досліджено показники обміну ПА у хворих з новоутвореннями молочної залози.
За допомогою методів комп'ютерного моделювання теоретично обґрунтовано здатність ПА зв'язуватись зі субодиницею р50 ядерного фактору транскрипції NF-B і зменшувати імовірність спонтанної дисоціації комплексу р50 - ДНК.
В модельних експериментах за допомогою біосенсорних та флуориметричних методів показано, що природні ПА (в інтервалі концентрацій 1 мкМ - 1 мМ), на відміну від синтетичного аналога ПА та інгібітора їх біосинтезу -ДФМО, сприяють утворенню комплексу р50 зі специфічними послідовностями ДНК.
Показано, що в клітинах карциноми молочної залози мишей Са 755, карциносаркоми молочної залози щурів Уокер-256 та раку молочної залози людини MCF-7 виснаження ПА за допомогою -ДФМО призводить до збільшення вмісту р50 і, в значно меншій мірі, р65 субодиниць фактору NF-B в ядрах. При компенсації -ДФМО-індукованого виснаження ПА шляхом додавання путресцину вплив деплеції ПА на вміст білків р50 та р65 нівелюється. Виявлено, що виснаження ПА призводить до зменшення вмісту білків - продуктів онкогенів c-myc i bcl-XL, що свідчить про нездатність фактору NF-B виконувати функцію транскрипції по відношенню до досліджуваних генів в умовах б-ДФМО-індукованого виснаження ПА.
Ключові слова: поліаміни, ядерний фактор транскрипції NF-B, рак молочної залози, онкогени.
АННОТАЦИЯ
Александрова Н.А. Обмен и связь полиаминов с функционированием ядерного фактора транскрипции NF-B при опухолях молочной железы. - Рукопись.
Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07 - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украина, Киев, 2005.
Диссертация посвящена изучению взаимосвязи между метаболизмом полиаминов (ПА) и функционированием ядерного фактора транскрипции NF-B.
Задачи исследования: изучить способность ПА взаимодействовать с ядерным фактором транскрипции NF-B; изучить влияние ПА на связывание NF-B с соответствующими последовательностями ДНК; исследовать влияние модуляции метаболизма ПА на транслокацию субъединиц фактора NF-B в ядра опухолевых клеток молочной железы; исследовать влияние модуляции метаболизма ПА в опухолях молочной железы на содержание белков - продуктов онкогенов, транскрипция которых регулируется фактором NF-B; изучить показатели обмена ПА у больных раком молочной железы.
В работе применены методы экспериментальной онкологи, биохимические, флуоресцентные, биосенсорные и статистические методы, компьютерное моделирование.
Установлено, что в злокачественных опухолях молочной железы активность ОДК и содержание ПА значительно выше, чем в макроскопически неизмененной ткани. Показано, что уровень экскреции ПА с мочей у пациентов со злокачественными опухолями в активной фазе заболевания значительно выше, чем в состоянии ремиссии. Показана четкая корреляция между степенью повышения содержания ПА в моче больных раком молочной железы и уменьшением продолжительности их жизни.
Проведено компьютерное моделирование взаимодействия ПА с ядерным фактором NF-B и с комплексом р50 - ДНК. Обнаружен потенциальный сайт связывания ПА с субъединицей р50, смоделирован процесс диссоциации ПА от комплекса р50 - ДНК, рассчитаны константы диссоциации для спермина, спермидина, путресцина. Показано, что образование дополнительных электростатических взаимодействий и водородных связей с участием связанного ПА способствует стабилизации комплекса р50 - ДНК.
Подобные документы
Визначення можливостей використання мутацій в генах та мітохондріальній ДНК у якості молекулярно-генетичних маркерів ризику виникнення раку молочної залози у осіб різних вікових груп з Ірану і України, аналогічні рівні зростання частоти захворюваності.
автореферат [43,0 K], добавлен 29.03.2009Характеристика захворювання раку молочної залози. Реабілітація, корекція психосоматичних розладів в процесі комплексного лікування захворювання. Розподіл хворих на рак молочної залози за віком. Результати дослідження та їх обговорення. Самооцінка хворого.
автореферат [141,2 K], добавлен 13.02.2009Структурно-функціональні зміни щитовидної залози в дитячому віці. Клітини Ашкиназі-Гюртля або Б-клітини. Водний і електролітний обмін. Вплив гормонів на ЦНС. Роль білків, жирів, вуглеводів в організмі. Особливості щитовидної залози у людей літнього віку.
курсовая работа [3,0 M], добавлен 25.04.2015Ультразвукова анатомія молочної залози, порядок та умови проведення. Променева семіотика захворювань молочної залози. Дисгормональні захворювання та формування схеми їх лікування. Пухлини молочної залози, їх різновиди і порядок діагностування, лікування.
реферат [22,7 K], добавлен 22.10.2010Променеві методики основних променевих методів для дослідження молочної залози. Алгоритм променевого обстеження хворих із патологією молочної залози. Проекції при мамографії, ультразвуковий метод дослідження. Моніторинг хіміотерапевтичного лікування.
реферат [611,3 K], добавлен 11.10.2010Показники захворюваності та результати лікування раку щитоподібної залози. Удосконалення техніки виконання екстрафасціальної тиреоїдектомії у хворих. Морфологічні особливості різних форм раку щитоподібної залози. Удосконалених методів лікування хвороби.
автореферат [58,1 K], добавлен 12.03.2009Щитовидна залоза - ключова ланка в організмі людини. Вплив гормонів щитоподібної залози на органи і обмін речовин організму. Основні функції щитоподібної залози. Патології щитоподібної залози та причини, що викликають їх. Дефіцит йоду і його наслідки.
реферат [33,5 K], добавлен 23.01.2011Рак молочної залози як найпоширеніший вид пухлин серед жіночого населення Європи, Америки й деяких країн Азії. Генетичні та інші фактори виникнення пухлин. Мамографія та інші методи виявлення перших ознак. Комплексний підхід у сполученні з хірургією.
реферат [29,8 K], добавлен 16.02.2010Радіофармацевтичне забезпечення радіонуклідних досліджень щитоподібної залози. Визначення її йоднакопичувальної здатності. Особливості динамічної та статичної тиреосцинтиграфії, радіоімунний аналіз. Променева анатомія щитоподібної залози, її пухлини.
реферат [178,8 K], добавлен 25.12.2010Рак молочної залози – найпоширеніше онкологічне захворювання у жінок. Сучасна тактика лікування хворих і використання комплексного впливу: хірургічне втручання, променева терапія, хіміотерапія та гормонотерапія. Проведення неоад'ювантної хіміотерапії.
автореферат [34,2 K], добавлен 12.03.2009
