Фізіологічні реакції еритроцитів людини на дію низько інтенсивного електромагнітного випромінювання надзвичайно високої частоти

Размещено на http://allbest.ru

МІНІСТЕРСТВО ОСВІТИ І НАУКИ УКРАЇНИ

ТАВРІЙСЬКИЙ НАЦІОНАЛЬНИЙ УНІВЕРСИТЕТ

ІМЕНІ В.І. ВЕРНАДСЬКОГО

03.00.13 - Фізіологія людини і тварин

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Фізіологічні реакції еритроцитів людини на дію низько інтенсивного електромагнітного випромінювання надзвичайно високої частоти

Рибалко Сергій Юрійович

Сімферополь - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Кримському державному медичному університеті

ім. С.І. Георгієвського, Міністерство охорони здоров'я України.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор

Русяєв Валентин Федорович,

Кримський державний медичний університет

ім. С.І.Георгієвського, завідувач кафедри біологічної фізики

Офіційні опоненти

доктор біологічних наук, професор

Сидякін В'ячеслав Григорович,

Таврійський національний університет

ім. В.І. Вернадського, Міністерство освіти і науки України, завідувач кафедри фізіології людини та тварин і біофізики

доктор медичних наук, старший науковий співробітник

Овсяннікова Людмила Михайлівна,

Науковий центр радіаційної медицини АМН України, провідний науковий співробітник

Провідна організація

Донецький державний медичний університет

ім. М. Горького, Міністерство охорони здоров'я України, м. Донецьк

Захист відбудеться 21.11.2003 року о 14 годині на засіданні спеціалізованої Вченого Ради К 52.051.04 в Таврійському національному університеті ім. В.І. Вернадського (95007, Україна, Крим, м.Сімферополь, вул. Ялтинська, 4).

З дисертацією можна ознайомиться в бібліотеці Таврійського національного університету ім. В.І. Вернадського (95007, Україна, Крим, м.Сімферополь, вул. Ялтинська, 4).

Автореферат розісланий 17.10.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради К 52.051.04 В.С.Мартинюк

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

еритроцит випромінювання перекисний окислення

Актуальність теми. Вивчення біологічних ефектів при впливі низькоінтенсивних електромагнітних полів є важливою проблемою сучасної фізіології, біофізики, екології, фізіотерапії. Існують численні дані, які свідчать про вплив природних і техногенних низькоінтенсивних електромагнітних випромінювань (ЕМВ) на різні рівні організації біологічних об'єктів. Особливу увагу привертають до себе біотропні ефекти низькоінтенсивного ЕМВ надзвичайно високої частоти (НВЧ) (Repacholi M.H., 1998; Walters T.J. et al., 2000; Logani M.K. et al., 2002).

В даний час дія низкоінтенсивних ЕМВ НВЧ розглядається з позиції екології і можливості клінічного застосування (Геращенко С.І., 1997; Сітько С.П., 2001). В екологічному аспекті досить актуальною стає проблема вивчення біологічних ефектів і наслідків впливу штучних джерел ЕМВ на населення, тому що державні стандарти, які регламентують припустимі рівні ЕМВ, здебільшого не мають фізіологічного обґрунтування (Гічев Ю.В., Гічев Ю.Ю., 1999). Дотепер єдино стійко фіксуємою реакцією при опроміненні був тепловий ефект, і тому існуючі стандарти грунтуються на фізичних принципах без урахування тонких фізіологічних механізмів взаємодії ЕМВ з біологічними системами.

З іншого боку, пильна увага дослідників і клініцистів до розглянутої проблеми пов'язана з можливістю терапевтичного застосування ЕМВ. Особливий інтерес у цьому відношенні представляє ЕМВ НВЧ-діапазону (Сітько С.П., Мкртчан Л.Н., 1994).

Позитивні терапевтичні ефекти ЕМВ НВЧ сприяли широкому впровадженню цього фактору під назвою мікрохвильової (резонансної) НВЧ-терапії у клініку гастроентерології, гінекології, урології, пульмонології, кардіології, нервових хвороб і т.п. (Самосюк І.З. і співавт., 2000; Pakhomov A.G.,1998; Alekseev S.I., Ziskin M.C., 2001). Але, між тим, відомі труднощі формування загальноприйнятих рекомендацій щодо індивідуального вибору фізічних параметрів та лікувальних доз цього фактору (Дев'ятков Н.Д. і співавт.,1991).

У ході проведених експериментальних і клінічних спостережень був відзначений антивірусний, антибактеріальний, радіопротекторний, антистресовий і седативний ефекти мікрохвильового ЕМВ (Темур'янц Н.А., 1994; Лебедєва Н.Н., 1999).

Однак, незважаючи на зусилля вітчизняних і іноземних дослідників, до останнього часу відсутні загальновизнані теоретичні представлення, які дозволяють надійно пояснити фізіологічні механізми НВЧ-терапії на молекулярному, клітинному та органному рівні організації організму (Чуян Е.Н. і співавт., 2003).

У більшості лабораторій дослідження біологічних ефектів і механізмів дії ЕМВ НВЧ виконується на досить складних біологічних об'єктах чи на високих рівнях їх структурної організації. Обмеженість, а іноді і відсутність відомостей про первинні механізми взаємодії ЕМВ НВЧ із відносно простими біологічними об'єктами на молекулярному і клітинному рівні для подальшого розвитку теоретичних уявлень про інтегральні фізіологічні реакції організму, потребує використання більш простих моделей та об'єктів.

Одним з таких об'єктів є еритроцит людини - без'ядерна клітина, фізіологічні реакції якої досить детально вивчені. Крім того відомо, що спектр біотропної дії ЕМВ НВЧ містить частотні піки, з якими пов'язані найбільш виражені біоефекти випромінювання. При дії на клітини крові однієї з ефективних частот є частота 61,22ГГц (Родштат І.В., 1991), для якої також показані виражені клінічні ефекти (Брискін Б.С. і співавт., 1997).

В зв'язку з цим біотропні ефекти частоти 61,22ГГц при дії на еритроцит дають можливість подальшої деталізації первинних механізмів дії ЕМВ НВЧ на біологічні об'єкти.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Робота виконувалася в рамках тем науково-дослідних робіт кафедри медичної і біологічної фізики Кримського державного медичного університету ім.С.І.Георгієвського “Інтегрована біологічна реакція компонентів системи гемостазу, шкірних і слизових покривів людини при УФ опроміненні”(№10120195U020528, 1996-2000р.р.), кафедри медичної інформатики КДМУ “Інформаційно-біотехнологічні підходи і методи модифікації, корекції і керування біологічними явищами в біосистемах”(№0100U002030, 2000-2005р.р.), а також - наукової програми кафедри фізіології людини і тварин та біофізики Таврійського національного університету ім. В.І.Вернадського “Вивчення механізмів підвищення стійкости до дії несприятливих факторів за допомогою електромагнітних випромінювань надзвичайно високої частоти” (№ 0103U001224 ).

Мета і задачі роботи. Метою даного дослідження було експериментальне виявлення морфо-функціональних змін і встановлення закономірностей фізіологічних реакцій еритроцитів людини при дії низькоінтенсивного електромагнітного випромінювання НВЧ.

Для виконання цієї мети були поставлені наступні задачі:

1. Дослідити закономірності седиментації та агрегації еритроцитів венозної крові людини in vitro при різних амплітудно-часових параметрах низькоінтенсивного ЕМВ НВЧ.

2. Вивчити морфометричні зміни еритроцитів людини після опромінення ЕМВ НВЧ.

3. Виявити закономірності зміни механічних властивостей і осмотичної резистентності еритроцитів після впливу ЕМВ НВЧ.

4. Дослідити процеси перекисного окислення в мембранах еритроцитів і стан антиоксидантного захисту при впливі ЕМВ НВЧ.

5.Вивчити зміни електричних властивостей еритроцитарних мембран в зв'язку з процесами утилізації глюкози після впливу ЕМВ НВЧ

6. На підставі результатів проведених експериментів виявити основні взаємозв'язки та умови реалізації біотропної дії ЕМВ НВЧ, які призводять до зміни структурно-функціонального стану еритроцитів людини.

Об'єктом дослідження були морфологічні та електромеханічні властивості еритроцитів людини, сполучені з динамікою міжклітинних взаємодій, пероксидаційними і метаболічними процесами при впливі низькоінтенсивного ЕМВ НВЧ in vitro.

Предметом дослідження були фізіологічні реакції еритроцитів з крові 214 здорових донорів-добровольців у віці 20-40 років, на яких вивчали вплив ЕМП НВЧ шляхом виявлення змін у процесах агрегації та осідання, динаміки цитометричних і електромеханічних властивостей клітин, встановлення закономірностей зміни процесів пероксидації ліпідів еритроцитарних мембран і активності антиоксидантної системи, виявлення змін у процесах активного йонного транспорту та інтенсивності метаболізму еритроцитів після дії ЕМВ НВЧ.

Методи дослідження. Використовували ШОЕ як тест-реакцію для оцінки ефективності дії ЕМВ НВЧ різними параметрами та типами випромінювання. Фотометричні методи для оцінки осмотичної резистентності та агрегації еритроцитів. Мікроскопічні і кондуктометричні способи - для вивчення механічних і електричних властивостей еритроцитів. Біохімічні методи дослідження для вивчення перексидаційного стану та активності компонентів антиоксидантного захисту еритроцитів, метод електодифузійного пробою - для вивчення електричної міцності мембран еритроцитів, глюкозооксидантний метод - для оцінки утилізації глюкози еритроцитами.

Наукова новизна одержаних результатів. У ході виконання роботи були встановлені невідомі раніше закономірності зростання швидкості осідання еритроцитів від параметрів ЕМВ НВЧ (характеру випромінювання, щільності потоку потужності, експозиції). Вперше виявлені та описані закономірності агрегації, зміни форми, розмірів, деформованості і осмотичної резистентності еритроцитів після опромінення ЕМВ НВЧ.

Вперше був установлений взаємозв'язок морфофункціональних змін еритроцитів з електричною міцністю клітинних мембран після опромінення ЕМП НВЧ, а також отримані нові дані про зміну активного транспорту і зв'язаного з ним енергетичного обміну.

Встановлена залежність ефектів прискорення осідання еритроцитів людини при дії ЕМВ НВЧ в залежності від типу генерації, щільності потокупотужності, експозиції опромінення.

Практичне значення одержаних результатів. Результати проведених спостережень, а також їхні теоретичні трактування можуть бути використані для наукового обґрунтування вибору доз у фізіотерапії, розробки показань і протипоказань для НВЧ-терапії.

Експериментально обґрунтований у даній роботі пріоритетний кондуктометричний метод дослідження седиментації і деформації еритроцитів може використовуватися для дослідження біологічних ефектів і механізмів дії не тільки електромагнітних полів, але і будь-яких інших фізичних факторів, що застосовуються у фізіотерапії.

Експериментальні дані і їхні теоретичні трактування щодо біотропної дії ЕМВ НВЧ на біомембрану були впроваджені в навчальний процес на кафедрах біофізики і медичної інформатики Кримського державного медичного університету.

За результатами роботи були отримані два деклараційних патенти.

Особистий внесок здобувача. Автор самостійно провів формування експериментальних груп і розробляв план експериментальних досліджень. Провів дослідження на 214 зразках донорської крові, самостійно здійснював їхню підготовку та обробку в ході експериментів. Обговорення та аналіз результатів дослідження проведені за участю наукового керівника.

Автор самостійно розробив автоматизовані комплекси для визначення форми еритроцитів при зворотно-поступальному русі, для дослідження електродифузійного пробою мембран еритроцитів і для динамічного методу визначення осмотичної резистентності еритроцитів. Дисертант самостійно провів аналіз літературних джерел, здійснив математичну обробку результатів спостережень і забезпечив їхнє наочне представлення.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації повідомлені на п'яти міжнародних конференція, симпозіумах і з'їздах: міжнародній конференції “Слабкі і надслабкі поля і їхнє використання в біології і медицині”(м.С.-Петербург, 2000); Першому національному конгресі по біоетиці (м.Київ, 17-20 вересня 2001р.); 3 Міжнародному симпозіумі “Актуальні проблеми біофізичної медицини” (м.Київ 13-17 травня 2002 р.); 2 Міжнародному симпозіумі “Мікроциркуляція і її вікові зміни” (м.Київ, 22-24 травня 2002р.); Всеукраїнській науково-практичній конференції, присвяченій 5-річчю Міжнародного дитячого медичного центра “Євпаторія” (м.Євпаторія, 26-27 травня 2002р.), Науково-практичній конференції, присвяченій 105-річчю з дня народження С.І.Георгієвського (м.Сімферополь 21-23 квітня 2003р.).

Публікації. За результатами дослідження опубліковано 12 робіт, з них 6 - у спеціалізованих виданнях, що входять до реєстру ВАК України, та два патенти на винахід.

Обсяг і структура дисертації. Структура дисертаційної роботи відповідає традиційній формі і складається із вступу і чотирьох розділів: огляду літератури, матеріалів і методів дослідження, результатів власних спостережень, обговорення, а також - висновків і практичних рекомендацій. Дисертація викладена на 152 сторінках машинописного тексту, включає 20 таблиць і 19 рисунків. Список використаної літератури містить 226 джерел, з яких 134 опубліковано в країнах СНД і 92 - у закордонних джерелах.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

У вступі обгрунтовується актуальність теми дисертаційної роботи, формулюється мета і задачі дослідження, викладається зв'язок з науковими темами і програмами, що мають гриф державної реєстрації, розкривається наукова новизна, теоретичне і практичне значення роботи, оцінюється особистий внесок здобувача, надається інформація про апробацію результатів досліджень і публікаціях по темі дисертації.

Огляд літератури. У цьому розділі представлений аналіз даних літератури про біологічні ефекти ЕМВ НЧВ, їхніх закономірностях і передбачуваних механізмах дії. Розглянуто сучасні погляди на фізіологію еритроцита на молекулярному, субклітинному та клітинному рівнях.

Матеріали і методи дослідження. Експериментальна частина роботи виконана на зразках крові, отриманої в 214 практично здорових донорів-чоловіків у віці від 20 до 40 років. Для проведення експериментів використовували попередньо приготовлені зразки: 1) венозну кров, стабілізовану “Глюгіціром” - стандартним розчином для консервування крові, співвідношення об'єму крові і консерванту складало 4:1; 2) венозну кров, стабілізовану розчином гепарину, співвідношення крові і стабілізатора складало 9:1; 3) еритроцитарну масу, яку одержували зі стабілізованої крові наступним способом: кров центрифугували при 1000 об/хв протягом 30 хвилин, шар плазми видаляли, формені елементи тричі відмивали ізотонічним розчином NaCl і після остаточного центрифугування, видаляючи надосадову рідину, одержували еритроцитарну масу; 4) суспензію еритроцитів у ізотонічному розчині хлориду натрію, що готували в ході розведення еритроцитарної маси до вихідної концентрації клітин.

Досліджувані зразки ділили на дві порції, одна з яких служила контролем, а другу (дослідна 0,5мл) поміщали у фторопластову кювету і піддавали опроміненню ЕМВ НВЧ. Як джерело ЕМВ НВЧ використовували серійний апарат АМРТ-02 з рупорною антеною. У генераторі ЕМВ НВЧ передбачена можливість зміни частоти випромінювання в діпазоні 57 - 62 ГГц (режим генерації з хитною частотою), а також випромінювання на фіксованій частоті в режимі безупинної генерації. У проведених дослідженняхвикористовували щільність потоку потужності 1 мкВт/см2 - 100 мкВт/см2.

Вимір швидкості осідання еритроцитів (ШОЕ) здійснювали за стандартною методикою в капілярах Панченкова (Меньшіков В.В., Делекторська Л.Н., Золотницька Р.П.,1987). Концентрацію еритроцитів (КЕ) і процес їхньої агрегації досліджували в камері Горяєва за допомогою відомих методів (Лєвтов В.А., Левкович Ю.І., Потапова І.В., Ашкіназі І.Я.,1978). У цих же зразках за допомогою окуляра-мікрометра вимірювали діаметр еритроцитів при загальному збільшенні мікроскопа 600х (об'єктив 40х, окуляр 15х), а потім будували еритроцитометричну криву Прай-Джонса й обчислювали середній діаметр еритроцитів (СДЕ) (Гольдберг Д.І., Гольдберг Е.Д.,1980). Гематокрит вимірювали за допомогою градуйованого капіляра після центрифугування в спеціалізованій мікроцентрифузі (Меньшіков В.В., Делекторська Л.Н., Золотницька Р.П.,1987), а потім отримані дані використовували для розрахунку середнього еритроцитарного об'єму (СОЕ) (Тодоров Й.,1963).

Дослідження форми та електричних властивостей еритроцитів проводили за допомогою кондуктометричного методу (Русяєв В.Ф.,1987), який дозволяє використовувати динаміку електричного імпедансу при зворотно-поступальному русі стабілізованої крові чи еритроцитарної суспензії для оцінки орієнтації, зміни щільності іонної атмосфери і деформації еритроцитів.

За допомогою кондуктометричного методу вивчали процеси осідання і деформацію еритроцитів при їхньому осадженні інерційними силами в центрифузі (Русяєв В.Ф., Чернов А.І., 1989).

Інтенсивність процесів перекисного окислювання ліпідів (ПОЛ) в еритроцитах включало в собі: визначення дієнових кон'югатів і дієнкетонів модифікованим методом Плацера (Плацер З., Відлакова М., Кужена Л., 1970), визначення вмісту ТБК-активних продуктів в еритроцитах крові (Камишніков В.С.,2000). Стан антиоксидантної системи (АОС) визначалася по загальній антиокислювальній активності (ЗОА) (Семенов В.Л., Ярош А.М., 1985), рівню активності супероксиддизмутази (СОД) у мембранах еритроцитів (Чеварі С.,Чаба И., Секей П.,1985) і каталазоподібної активності еритроцитів (Королюк М.А., Іванова Л.І., Майорова І.Г., Токарєв В.Е.,1988).

Осмотичну резистентність еритроцитів визначали модифікованим динамічним методом (Подрабінек П.А.,1964; Шабаєв В.П., 1982), яка основується на зміні об'єму і форми мембрани еритроцитів, поміщених у гіпотонічний розчин NaCl. Електричну міцність мембран еритроцитів оцінювали по зміні електодифузійного потенціалу (Путвинський А.В. Попов С.А. Пучкова Т.В., Данилов Ю.А., Володимиров Ю.А.,1983). Динаміку зниження концентрації глюкози в еритроцитарній суспензії реєстрували глюкозооксидазним методом (Меньшиков В.В., Делекторська Л.Н., Золотницька Р.П.,1987).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ ТА ЇХНЄ ОБГОВОРЕННЯ

В першій серії експериментів були досліджені закономірності впливу ЕМВ НВЧ біологічно-активної частоти 61,22ГГц на ШОЕ в залежності від типу генерації (хитна - ГХЧ та безперебійна - БГ), щільноті потоку потужності (ЩПП) та експозиції. Було встановлено, що здатність підвищувати ШОЕ більш виражена для безперебійного типу генерації (рис.1). ШОЕ була досліджена в інтервалі ЩПП від 1 до 100 мкВт/см2. Було виявлено плато ефекту для інтервалу 10-100 мкВт/см2, а мінімальна ефективна експозиція склала 30 хвилин. Таким чином, для наступних серій спостережень були обрані найбільш ефективні параметри з мінімальною тепловою дією на об'єкт: безперебійний режим генерації при ЩПП 10мкВт/см2 з експозицією 30 хвилин.

ШОЕ, як відомо, пов'язана зі змінами поверхневих властивостей, заряду мембран, здатності клітин формувати агрегати, в зв'яку з чим далі вивчали дію НВЧ випромінювання з означеними параметрами на агрегаційну здатність еритроцитів, розчинених в аутологічній плазмі. Для цього стабілізовану венозну кров розподіляли на чотири порції: одна з них служила контролем, друга піддавалася опроміненню ЕМВ НВЧ. Кров третьої порції піддавали центрифугуванню (1000 об/хв, 30хв.), плазму відбирали й опромінювали ЕМВ НВЧ, у четвертій групі після центрифугування відбирали, а далі опромінювали еритромасу. Потім у контрольному та експериментальному субстратах визначали параметри, що характеризують агрегацію еритроцитів. Дані, отримані в цій серії спостережень, представлені в табл. 1.

Рис.1. ШОЕ крові людини в контролі і при опроміненні ЕМВ НВЧ (n=30).

Таблиця 1

Показники агрегації еритроцитів при дії ЕМВ НВЧ (n=30, M±m)

Примітка: КЕ - концентрація еритроцитів, КНЕ - концентрація неагрегованих еритроцитів, КАЕ - концентрація агрегованнх еритроцитів, КА - коефіцієнт агрегації (дорівнює відношенню числа агрегованих еритроцитів до загального числа еритроцитів); вірогідність розходження за критерієм Ст'юдента між доcлідною і контрольною групами - *- P<0,05, ** - P<0,01.

Як випливає з аналізу результатів, приведених у табл. 1, ЕМВ НВЧ стимулює агрегацію еритроцитів. Цей висновок підтверджується збільшенням коефіцієнту агрегації КА та зростанням кількості агрегованих еритроцитів КАЕ. Відповідно зменшується концентрація неагрегованих клітин КНЕ. Максимальні зміни досліджуваних параметрів спостерігалися у четвертій групі, що дозволяє розглядати червонокрівці у якості мішеней дії ЕМВ НВЧ.

Така цілеспрямована дія електромагнітного фактору повинна призводити до зміни морфологічних показників, які далі були вивчені у наступній серії цитометричних досліджень. Вимірювали гематокритну величину (ГВ), концентрацію (КЕ), середній діаметр (СДЕ), а далі - обчислювали середній об'єм (СОЕ), товщину (ТЕ) та сфероцитарний індекс (СІЕ) еритроцитів. Об'єктами дослідження служили: контрольна інтактна кров (1) і еритроцитарна маса (3), ресуспензована до вихідної концентрації еритроцитів у ізотонічному розчині NaCl, а також - піддані опроміненню ЕМВ кров (2) і еритроцитарна маса (4). Отримані в цій серії спостережень експериментальні та розрахункові дані приведені в табл. 2.

Таблиця 2

Морфологічні показники еритроцитів при дії ЕМВ НВЧ

(n=40, M±m)

Примітка: вірогідність розходження за критерієм Ст'юдента між дослідною і контрольною групами - *- P<0,05; ** - P<0,01.

Викликані ЕМВ НВЧ зниження СОЕ, товщини, та зростання СДЕ були більш виражені та вирогідні у 4-й групі. При опроміненні еритромаси ці зміни можна загально означити феноменом зростання планоцитозу. Ймовірно, що цей факт зв'язаний з поглинанням ЕМВ НВЧ водою, що входить у плазму крові (Дев'ятков Н.Д., Голант М.Б., Бецький О.В., 1991).

Виявлена зміна форми клітин повинна пов'язуватись з динамікою еластичності, жорсткості та взагалі - електрохімічних показників. Для розрахунків деяких показників нами для еритроцитів у еритромасі по обчислювальній таблиці (Рабінович Ф.М., 1970) був визначений фактор форми спочиваючих еритроцитів Fсп, для контролю він склав - 1,52, а для 4-ї групи - 1,90.

Далі у наступній серії спостережень за допомогою кондуктометричних методів досліджували зміну електричних і механічних властивостей опромінених еритроцитів при зворотно-поступальному русі суспензії і при прискореній седиментації. Перед експериментом визначали ГВ у стабілізованій крові, і потім у ході центрифугування (1000 об/хв, 30 хв) одержували еритроцитарну масу. Цей субстрат ділили на дві порції, одна з яких служила контролем, а друга (дослідна) піддавалася опроміненню ЕМВ НВЧ. Потім контрольну та експериментальну порції ресуспензували в ізотонічному розчині NaCl так, щоб кінцева концентрація еритроцитів була такою ж, як і у вихіднійінтактній крові. За допомогою автоматизованого кондуктометричного комплексу визначали коефіцієнт форми Кформ і фактор руху Fрух, зміну імпедансу при центрифугуванні dR, розраховували значення імпедансу при повній седиментації Rсед, а також - коефіцієнт деформації Kдеф і час седиментації tсед еритроцитів. Результати проведених спостережень і теоретичних розрахунків наведені в табл. 3.

Таблиця 3

Зміна електромеханічних властивостей суспензії еритроцитів при опроміненні ЕМВ НВЧ(n=36, M±m)

Примітка: - вірогідність розходження за критерієм Ст'юдента між дослідною і контрольною групою - *P<0,05; ** - P<0,01.

Як свідчать ці дані, Кформ у дослідній групі вірогідно зростає, що може бути обумовлено зниженням ГВ. Відповідно збільшується фактор руху еритроцитів Fрух, що варто пояснити не тільки деформацією еритроцитів, але й модифікацією глікокаліксу клітин (Іл'їна С.А., 1989). Крім того, зміна імпедансу dR опромінених еритроцитів вірогідно перевищує аналогічний показник контролю. Час досягнення рівня опіру Rсед у контролі більше, ніж в дослідній групі.

Результати цієї серії спостережень дозволяють стверджувати, що в ході центрифугування відбувається більш швидке і щільне упакування опромінених еритроцитів у міжелектродному просторі кондуктометричної кювети в порівнянні з контролем. Цими фактами можна пояснити виявлене раніше прискорення ШОЕ та зміну коефіцієнта деформації Кдеф опромінених еритроцитів. Таким чином, ЕМВ НВЧ значно модифікує електромеханічні властивості еритроцитів.

Електромеханічні властивості еритроцитів визначаються морфо-функціональними параметрами мембран, які, у свою чергу, залежать від складу та структурної організації мембранних ліпідів. Оскільки стан ліпідного кістяка мембран значною мірою визначається сполученням перекисного окислювання ліпідів (ПОЛ) і реакцій антиоксидантного захисту (АОЗ), у наступній серії спостережень була поставлена задача дослідити пероксидаційні процеси до і після опромінення ЕМВ НВЧ.

Експерименти були проведені на стабілізованій глюгіциром крові, отриманої в 20 практично здорових донорів-чоловіків у віці 20-40 років. Кров поділяли на дві порції: 1) контрольну, 2) дослідну, яку піддавали опроміненню ЕМВ НВЧ (10мкВт/см2, 61,22ГГц, 30 хв). Інтенсивність ПОЛ в еритроцитах оцінювали по вмісту дієнових кон'югатів, дієнкетонів у гемолізаті, а також - по концентрації вторинних ТБК-активних продуктів у мембранах еритроцитів. Крім того, у контрольних і експериментальних субстратах визначали стан антиоксидантного захисту еритроцита по зміні загальної антиокислювальної здібності, рівню активності супероксидисмутази (СОД), і каталазоподобній активності крові. Результати, отримані в цій серії спостережень, наведені в табл. 4.

Таблиця 4

Показники ПОЛ і АОЗ в еритроцитах при впливі ЕМВ НВЧ

(n=20, M±m)

Примітка: - вірогідність розходження за критерієм Стьюдента між дослідною і контрольною групами - *P<0,05; ** P<0,01.

Аналіз даних, наведених у табл. 4, свідчить про вірогідне збільшення концентрації дієнових кон'югатів і ТБК-активних продуктів в експериментальних субстратах, що безсумнівно свідчить про активацію ПОЛ. Разом з тим, виявляється пригнічення загальної антиокислювальної активності крові, у першу чергу - за рахунок різкого інгібування каталазоподібної активності на тлі зростання активності СОД. Отримані факти дають підставу заключити, що ЕМВ НВЧ стимулює утворення вільних радикалів; дія ЕМВ НВЧ на АОЗ неоднозначна, але загальній ефект носить пригнічуючий характер.

Пероксидаційні процеси змінюють сітку кооперативнихміжмолекулярних зв'язків у матриці мембрани та призводять до зміни активності ферментних та транспортних систем. У наступній серії експериментів вивчали зміну проникності мембран, активний і пасивний іонний мембранний транспорт еритроцитів до і після опромінення ЕМВ НВЧ. Для проведення експериментів еритроцитарну масу, отриману з донорської стабілізованої крові, поділяли на дві порції, одна з яких служила контролем, а друга піддавали опроміненню ЕМВ НВЧ. Поміщаючи еритроцити в гіпотонічне середовище, оцінювали зміну осмотичної резистентності і, штучно створюючи електродифузійний мембранний потенціал, визначали електричну міцність еритроцитарних мембран. У якості кількісних параметрів для оцінки осмотичної резистентності служили: tmax - час гальмування осмотичного гемолізу, Кгем - коефіцієнт гемолізу, який дорівнює відношенню оптичної щільності субстратів до і після закінчення гемолізу. Для характеристики електричної міцності мембрани еритроцитів використовували максимальне значення електродифузійного потенціалу (потенціал пробою) Uпр. Результати цієї серії спостережень наведені в табл. 5.

Таблиця 5

Осмотична резистентність і електро-дифузійний потенціал еритроцитів при дії ЕМВ НВЧ(n=30, M±m)

Примітка: *- вірогідність розходження за критерієм Ст'юдента між дослідною і контрольною групами P<0,05.

Зростання параметру tmax на тлі зниження коефіцієнту гемолізу, а також - підвищеня потенціалу пробою свідчать про вірогидне уповільнення осмотичного гемолізу та зростання електричної міцності мембран еритроцитів, підданих впливу ЕМВ НВЧ.

Ці експериментальні дані узгоджуються з результатами, отриманими іншими дослідниками (Корягін А.С. та співавт., 2000). Відомо, що ці феномени обумовлені стимуляцією мембранного транспорту іонів, який має енергозалежний характер (Іл'їна С.А., 1989).

В зв'язку з цим в останній серії експериментів досліджували динаміку зміни транспорту глюкози через мембрани еритроцитів, опромінених ЕМВ НВЧ. Для цього отриману центрифугуванням еритромасу поділяли на три порції: 1) контроль, в якому еритромасу ресуспензували нормотонічним розчином глюкози; 2) еритромасу, ресуспензовану опроміненим ЕМВ НВЧ розчином глюкози; 3) опромінену ЕМВ НВЧ еритромасу ресуспензували розчином глюкози. За допомогою глюкозооксидазного методу визначали зміну концентрації глюкози в розчині щогодинно протягом 5 годин. Сумарну зміну концентрації глюкози в кожній з експериментальних груп наведено на рис.2.

Рис.2. Динаміка зміни концентрації глюкози в еритроцитарних суспензіях при опроміненні ЕМВ НВЧ; W - швидкість утілізації глюкози (n=28).

Отримані експериментальні дані дозволяють зробити висновок про збільшення кінетики транспорту глюкози в еритроцитах людини, опромінених ЕМВ НВЧ, яке в значній мірі визначає швидкість метаболічних процесів в еритроциті (Черницький Е.В., Горобець А.В., 1981). Це свідчить про активацію біоенергетичних процесів в клітинах при дії ЕМВ НВЧ. Зроблене припущення збігається з повідомленнями інших дослідників (Лук'янов В.Ф. та співавт. 1988).

На заключному етапі дослідження для з'ясування ключових механізмів впливу ЕМВ НВЧ на фізіологічні реакції еритроцитів людини був проведений кореляційний аналіз отриманих експериментальних даних. Статистичний аналіз дозволив виявити високий позитивний зв'язок парної кореляції між показниками ШОЕ і сфероцитарним індексом еритроцитів (r=0,821; p<0,05), швидкістю утилізації глюкози та електричною міцністю еритроцитарної мембрани (r=0,724; p<0,01), агрегацією і проникністю (r=0,786; p<0,05) і помітний позитивний зв'язок між основним показником процесів ПОЛ - концентрацією ТБК-активних продуктів і деформованістю (r=0,560; p<0,05), електричною міцністю еритроцитарної мембрани і ШОЕ (r=0,615; p<0,05), швидкістю утилізації глюкози і середнім діаметром еритроцитів (r=0,587; p<0,05).

Отримані статистичні параметри відображають взаємозв'язок вивчаємих властивостей еритроцитів людини і разом з наявними в літературі даними дозволяють нам запропонувати загальну схему біотропної дії ЕМВ НВЧ на еритроцит людини in vitro (рис.3).

Рис. 3. Схема біотропної дії ЕМВ НВЧ на морфо-функціональний стан ерироцитів людини in vitro. Суцільні стрілки - статистично встановлений взаємозв'язок; пунктир - взаємозв'язок, відомий з літературних джерел.

Опромінення низькоінтенсивним ЕМВ НВЧ еритроцитів людини in vitro призводить до змін морфо-функціонального стану мембран, які полягають в прискоренні процесів метаболізму, посиленні активного транспорту та інтенсивності процесів пероксидації ліпідів. Зміни функціональних властивостей еритроцитарних мембран викликають модифікацію форми, підвищення електричної міцності, деформованості та осмотичної резистентності клітин. Цитологічні зміни визначають характер фізіологічних реакцій еритроцитів, що виражається в прискоренні ШОЕ і підвищенні агрегаційної здатності еритроцитів людини при пливі ЕМВ НВЧ.

ВИСНОВКИ

1. Низькоінтенсивне ЕМВ НВЧ викликає зміну фізіологічного стану еритроциту людини, що проявляється стимуляцією пероксидаційних процесів, пригніченням загальної антиоксидантної активності, зміною форми, електро-механічних властивостей клітин, мембранного транспорту, зростанням агрегаційної здатності та прискоренням седиментації.

2. ЕМВ НВЧ викликає прискорення осідання еритроцитів з 6,0±0,5 мм/год (контроль) до 13,0±0,5 мм/год і збільшення коефіцієнту агрегації еритроцитів, розчинених в аутологичній плазмі, на 25,05%.

3. Вираженість біотропної дії на кров залежить від часу експозиції і щільності потоку потужності ЕМВ НВЧ. Максимальний ефект впливу спостерігається в режимі безупинної генерації з частотою 61,22ГГц, щільності потужності 10 мкВт/см2 та експозиції не менш 30 хвилин. При подальшому збільшенні часу опромінення біологічний ефект не зростає.

4. ЕМВ НВЧ викликає зміну морфометричних властивостей еритроцитів, що проявляється в збільшенні середнього діаметру еритроцитів на 13,7%, зміні форми клітин від сфероциту до дискоциту (сфероцитарний індекс зростає в 1,65 рази в порівнянні з контролем) збільшенні фактора форми еритроцитів на 25,2%.

5. ЕМВ НВЧ уповільнює осмотичний гемоліз еритроцитів людини, що виражається в гальмуванні часу гемолізу на 14,6%, і збільшує деформованість клітин на 37,6%.

6. ЕМВ НВЧ викликає накопичення продуктів пероксидації: дієнових кон'югатів і ТБК-активних продуктів та пригнічуює загальну антиокислювальну активність за рахунок суттєвого пригнічення каталазоподібної активності на тлі підвищеня активності СОД.

7. ЕМВ НВЧ підвищує електричну міцность мембрани еритроцитів, збільшуючи потенціал пробою з 127,2±6,84мВ у контролі до 141,4±6,95мВ у дослідній групі, та прискорює активний транспорт глюкози на 25,4% в порівнянні з контролем. Потенціал пробою зв'язаний прямим кореляційним зв'язком зі швидкістю утилізації глюкози (r=0,724; р‹0,01).

8. Біологічні ефекти ЕМВ НВЧ більш виражені при опроміненні еритроцитарної маси в порівнянні з кров'ю, що дозволяє розглядати червонокрівці як безпосередній об'єкт дії випромінювання НВЧ-діапазону.

СПИСОК ПУБЛІКАЦІЙ З ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Рыбалко С.Ю. Кондуктометрическое исследование эритроцитов в динамическом потоке //Проблемы, достижения и перспективы развития мед.-биол. наук и практического здравоохранения. - 1998. - Т.134,ч.1. - С.209-215.

2. Рыбалко С.Ю., Горлов А.А., Харченко В.З., Семенец П.Ф., Бисюк Ю.А., Ященко С.Г. Изменение показателей системы ПОЛ-АОС в эритроцитах человека под действием электромагнитных факторов //Таврический медико-биологический вестник. - 2001. - Т.4,№1-2. - С.144-146.

3.Рыбалко С.Ю. Изменение электромеханических свойств эритроцитов человека под действием электромагнитных факторов малой интенсивности. //Таврический медико-биологический вестник. - 2002. - Т.5,№1. - С.69-70.

4. Рыбалко С.Ю., Кацев А.М., Горлов А.А Исследование электрической прочности мембран эритроцитов человека при действии электромагнитных факторов нетепловой интенсивности //Ученые записки Таврического национального Университета. -2002. - Т.15(54),№1. - С.65-67.

5. Рыбалко С.Ю., Кацев А.М., Бисюк Ю.А., Горлов А.А., Чирский Н.В. Низкоинтенсивное электромагнитное излучение КВЧ диапазона ускоряет СОЭ и изменяет агрегацию эритроцитов человека //Таврический медико-биологический вестник. - 2002. - Т.5,№2. - С.124-127.

6. Рыбалко С.Ю. Изменение свойств эритроцитов человека при действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокочастотного диапазона //Таврический медико-биологический вестник. - 2003. - Т.6,№1. - С.106-110.

7. Пат. 98062962 України, МКИ A61B 5/05, G01N 27/02. Спосiб визначення фiзiологiчного стану бiологiчних тканин : Пат. 98062962 України, МКИ A61B 5/05, G01N 27/02/ Русяєв Валентин Федорович, Рибалко Сергiй Юрiйович (Україна); Кримський державний медичний університет ім. С.І.Георгієвського; Заявл. 08.06.1998; Опубл. 15.12.2000. Бюл. №7-II.

8. Пат. 2002075652 України, МКИ A61B 5/05. Пристрiй для кондуктометричного дослiдження еритроцитiв: Пат. 2002075652 України, МКИ A61B 5/05/ Горлов Олександр Олександрович, Чирський Микола Вiкторович, Русяєв Валентин Федорович, Рибалко Сергiй Юрiйович (Україна); Кримський державний медичний університет ім.С.І.Георгієвського; Заявл. 09.07.2002; Опубл. 17.03.2003. Бюл. №3.

9. Рыбалко С.Ю., Горлов А.А. Реакции крови человека на воздействие магнитного поля //Материалы II Международного конгресса “Слабые и сверхслабые поля и излучения в биологии и медицине”. - С.-Петербург, - 2000. - С.191.

10. Рыбалко С.Ю. Электромагнитная экология и современная медицина //Перший нацiональний конгресс з Бiоетики. - Тез.доп. - Київ. - 2001. - С.127.

11.Рыбалко С.Ю., Кацев А.М., Бисюк Ю.А. Деформируемость и поддержание формы эритроцита // Мiкроциркуляцiя та iї вiковi змiни: Матерiали 2-ої мiжнародної конференцiї - Київ: IВЦ “Алкон”, 2002. - С.66.

12. Рыбалко С.Ю. Мембранотропный характер кислородозависимых реакций эритроцитов человека in vitro при действии низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты // Научно-практическая конференция, посвященная 105-летию со дня роджения С.И.Георгиевского: Сб.тез. - Сімферополь.- 2003. - С.32-33.

АНОТАЦІЯ

Рибалко С.Ю. Фізіологічні реакції еритроцитів людини на дію низькоінтенсивного електромагнітного випромінювання надзвичайно високої частоти. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за фахом 03.00.13 - фізіологія людини і тварин. -Таврійський національний університет ім. В.І. Вернадского, Сімферополь, 2003.

У дисертації вивчено вплив низькоінтенсивного електромагнітного випромінювання надзвичайно високої частоти (ЕМВ НВЧ) на характер фізіологічних реакцій еритроцитів in vitro 214 здорових донорів-добровольців у віці 20-40 років. Морфо-функціональний стан клітин досліджено фотометричними, біохімічними, цитометричними та кондуктометричними методами.

Показано, що ЕМВ НВЧ викликає вірогідне збільшення швидкості осідання еритроцитів не залежно від типу генерації. Але при цьому режим хитної генерації викликає значно менший ефект, ніж при використанні безперебійного режиму. Вираженість біологічного впливу на кров залежить від часу експозиції і щільності потоку потужності ЕМВ НВЧ. Максимальний ефект впливу спостерігається в режимі безперебійної генерації з частотою 61,22ГГц, щільністю потужності 10 мкВт/см2, з експозицією 30 хвилин. При подальшому збільшенні часу опромінення біологічний ефект не наростає.

ЕМВ НВЧ вірогідно підвищує концентрацію проагрегованих та знижує кількість неагрегованих еритроцитів, що свідчить про зростання агрегаційних властивостей червонокрівців, розведених в аутологічній плазмі. Цей ефект найбільш виражений у разі НВЧ-опромінення еритроцитарної маси в порівнянні з суцільною кров'ю.

Виявлено зростання середнього обсягу, діаметру, фактору форми та зменшення товщини клітин, що можна загально охарактеризувати як феномен підвищеня планоцитозу клітин. Цей феномен менш виражений при опроміненні суцільної крові і вірогідно спостерігається лише в умовах НВЧ-опромінення еритроцитарної маси, що дозволяє розгядати еритроцит у ролі безпосередньої мішені дії опромінення.

Кондуктометричними методами виявлено збільшення електропровідності суспензії еритроцитів, зміну фактору форми клітин призворотно-поступальному русі суспензії, підвищення деформованості опромінених ЕМВ НВЧ еритроцитів.

Показано збільшення концентрації дієнових кон'югатів та ТВК-активних продуктів після НВЧ-опромінення, що свідчить про зростання інтенсивності пероксидаційних процесів в опромінених клітинах. Разом з тим ЕМВ НВЧ знижує загальну антиокислювальну активність за рахунок глибокого пригнічення каталазоподібної активності, але при цьому спостерігається підвищеня активності супероксиддисмутази на 33%.

Виявлено вірогідне гальмування осмотичного гемолізу після впливу НМВ НВЧ, що проявляється зростанням часу гемолітичного процесу та зниженням коефіцієнту гемолізу. Зростання гемолітичної стійкості супроводжується підвищенням електричної міцності еритроцитарних мембран, що проявляється збільшенням на 13% електро-дифузійного потенціалу мембранного пробою. Виявлені ефекти треба пояснювати зростанням інтенсивності енерегичного обміну в клітинах. Одним з механізмов, які забезпечують таке зростання, є виявлений факт вірогідного прискорення утилізації глюкози еритроцитами після опромінення ЕМВ НВЧ.

Виявлені значні кореляційні зв'язки між морфо-функціональними параметрами опромінених клітин. Високий позитивний зв'язок парної кореляції виявлено між показниками ШОЕ і сфероцитарним індексом, швидкістю утилізації гюкози і електричною міцністю мембрани, агрегацією і проникністю мембран еритроцитів, параметрами процесів пероксидації та деформованістю клітин.

Опромінення низькоінтенсивним ЕМВ НВЧ еритроцитів людини in vitro призводить до зміни загального морфо-функционального стану клітин. Це маніфестується, в першу чергу, функціональними змінами: прискоренням процесів метаболізму, посиленням активного транспорту, інтенсивності процесів пероксидації ліпідів на тлі пригнічення загальної антиоксилювальної активності.

Функціональні зміни, які, у першу чергу, стосуються стану мембран, призводять до зміни форми еритроцитів в напрямку планоцитозу. Разом з тим має місце підвищення електро-дифузійного потенціалу, деформованості та осмотичної резистентності еритроцитів. Цитологічні зміни визначають характер інтегральних фізіологічних реакцій еритроцитів, які, насамперед, виражаються в прискоренні ШОЕ і підвищенні агрегаційної здатності клітин при експериментальному впливі.

Ключові слова: еритроцит, мембрана, ЕМВ НВЧ, ШОЕ, агрегація, ПОЛ, электродифузійоний пробій, утилізація глюкози.

АННОТАЦИЯ

Рыбалко С.Ю. Физиологические реакции эритроцитов человека на действие низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты. - Рукопись.

Диссертация на соискание научной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.13 - физиология человека и животных. -Таврический национальный университег им. В.И. Вернадского, Симферополь,2003.

Изучено влияние низкоинтенсивного электромагнитного излучения крайне высокой частоты (ЭМИ КВЧ) на характер физиологических реакций эритроцитов in vitro из крови 214 здоровых доноров-добровольцев в возрасте 20-40 лет. Показано, что ЭМИ КВЧ повышает СОЭ и агрегационную способность эритроцитов, при этом выраженность эффектов зависит от экспозиции и плотности потока мощности с максимумом в режиме непрерывной генерации с частотой 61,22ГГц (плотность потока мощности 10-100мкВт/см2) и экспозиции свыше 30 мин. ЭМИ КВЧ, повышая активность СОД, стимулирует перекисное окисление и снижает общую антиокислительную активность. При этом возрастает осмотическая резистентность, деформируемость и электродиффузионный потенциал пробоя клеток на фоне возрастания доли их планоцитарных форм и скорости утилизации глюкозы.

Ключевые слова: эритроцит, мембрана, ЭМИ КВЧ, СОЭ, агрегация, ПОЛ, электродиффузионный пробой, утилизация глюкозы.

ANNOTATION

Rybalko S.Yu. Physiological reactions of human erythrocytes under the action of low-intensity electromagnetic irradiation of extremely high frequency. - Manuscript.

Thesis for the scientific degree of the Candidate of Biological Sciences in specialty 03.00.13. - human and animal physiology. - V.I. Vernadskiy Tavrida National University, Simferopol, 2003.

This dissertation provides a study of the influence of low intensity electromagnetic radiation of extremely high frequency (EMR EHF) on the character of physiological reactions of erythrocytes in vitro extracted from the blood of 214 healthy voluntary donors aged 20-40. It has been shown that under EMR EHF action erythrocytes sedimentation rate and their aggregation ability increase, when the effects degree depends on the exposition and power flux density with a maximum in the permanent generation mode with frequency of 61,22 GHz (with 10-100 мW/cm2) and exposition over 30 min. It has been also estimatedEMR EHF stimulates peroxide oxidation simultaneously increasing SOD activity, and decreases general antioxidant activity. EMR EHF treatment also led to increase the cells osmotic resistance, deformability and electro-diffusive potential as well as growing of their planocitary forms fraction, and the rate of glucose utilization.

Key words: erythrocyte, membrane, EMR EHF, ESR, aggregation, lipid peroxidation, electro-diffusive rapture, utilization of glucose.

Размещено на Allbest.ru