Мета та задачі досліджень. Метою роботи є пошук вітчизняних рослинних джерел біологічно активних гідроксиантрахінонів, визначення вмісту їх в сировині, методів виділення і встановлення структури, очищення емодину і хризофанолу, визначення вмісту хризофанолу в очищеному зразку для створення хризофанолу-стандарту, розробка проекту фармакопейної статті (ФС) на хризофанол-стандарт, отримання фісціону, синтез і вивчення похідних антрахінону підгрупи алізарину.

Для досягнення зазначеної мети були поставлені наступні завдання:

– провести пошук сировинних джерел флори України, які містять емодин, хризофанол, фісціон, алое-емодин, реїн і їх глікозиди;

– виділити гідроксиантрахінони з насіння жостеру проносного та вивчити їх будову;

– визначити вміст емодину й хризофанолу у сировині;

– випробувати методи виділення з сировини і очищення емодину й хризофанолу;

– підібрати методи вибіркового метилювання емодину для отримання фісціону;

– провести очищення хризофанолу, визначити вміст його у зразку з метою створення фармакопейного стандартного зразку (ФСЗ);

– провести синтез деяких похідних гідроксиантрахінону підгрупи алізарину;

– визначити біологічну активність і за результатами фармакологічного скринінгу виявити сполуки для поглибленого вивчення;

– вивчити анатомічні ознаки плодів та насіння жостеру проносного;

– розробити проект ФС на хризофанол-стандарт.

Об'єктом дослідження стали природні антрахінони, які обумовлюють фармакологічну активність багатьох лікарських засобів та лікарська рослинна сировина, що їх містить в тому числі кора крушини вільховидної, насіння жостеру проносного, кореневища та корені щавлю кінського, а також синтетичні аналоги антрахінонів підгрупи алізарину.

Предметом дослідження став пошук вітчизняних джерел гідроксиантрахінонів, методів їх виділення з ЛРС, очищення, створення стандартного зразку хризофанолу, отримання фісціону з емодину і способів синтезу антрахінонів підгрупи алізарину; вивчення біологічної активності природних і синтетичних похідних антрахінону, визначення анатомічних ознак плодів і насіння жостеру проносного.

Методи дослідження. Ідентифікацію і визначення вмісту біологічно активних речовин у сировині проводили фармакопейними і іншими методами, використовуючи тонкошарову (ТШХ) та паперову хроматографію (ПХ). Для виділення гідроксиантрахінонів з сировини використовували фракційну екстракцію і колонкову хроматографію на силікагелі та поліаміді. Хімічну будову отриманих сполук встановлювали на підставі хроматографічних, спектральних (УФ-, ІЧ-, ПМР-) і хімічних даних. Ліпазотропну активність визначали в тонкому шарі на кордоні поділу олія-вода. Анатомічне вивчення і фотографування зрізів плодів і насіння жостеру проносного проводили за допомогою мікроскопу МБІ-6 на плівці “Мікрат-200” і “Мікрат-300”.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше хромато-спектрофотометричним методом проведено визначення вмісту емодину в корі крушини і насінні жостеру проносного, хризофанолу - в кореневищах і коренях щавлю кінського.

Показана можливість отримання емодину й хризофанолу з вітчизняної сировини.

З підземних органів щавлю кінського виділено і очищено хризофанол з вмістом 99,48%.

Запропоновані методи синтезу 1,3-дігідроксі-2-гідроксиметилантра-

хінону, 1,2-дігідроксі-3-гідроксиметилантрахінону і 1,2,4-тригідроксі-3-гідроксиметилантрахінону і на їх основі отримані прості та складні ефіри, альдегіди та кислоти, та інші ( всього 31 сполука), будова яких підтверджена методами УФ-, ІЧ-, ПМР-спектроскопії, даними елементного аналізу, а в окремих випадках - зустрічним синтезом. Вперше серед похідних підгрупи алізарину виявлені речовини з високою гепатопротекторною, протизапальною, протимікробною та ліпазотропною активностями при низькій токсичності. Встановлені анатомічні ознаки плоду та насіння жостеру проносного.

Практичне значення одержаних результатів. Показана можливість використання кори крушини і насіння жостеру проносного, як джерел емодину, а кореневищ і коренів щавлю кінського - хризофанолу.

У наукових працях, опублікованих зі співавторами Безуглим П.О., Зінченко В.В, Ковальовою А.М,, Комісаренко А.М., Журавльовим М.С,, Картмазовою Л.С., Дроговоз С.М., Павлієм О.І., Зареченським М.А., Абу Дарвіш Мухаммедом, Краснопьоровою О.П., Далецькою Н.В., особисто здобувачем:

– проведено аналіз літературних джерел по розповсюдженню, виявленню, виділенню з сировини й очищенню, визначенню вмісту, синтезу і біологічному вивченню антрахінонів;

– підібрані і опробовані методики визначення вмісту емодину і хризофанолу в сировині;

– відпрацьовано методики виділення і очищення суми гідроксиантрахінонів і індивідуальних сполук: емодину (кора крушини і насіння жостеру проносного) і хризофанолу (кореневища і корені щавлю кінського);

– з насіння жостеру проносного виділено в індивідуальному стані три сполуки антрахінонової природи, встановлено їх структуру;

– визначено вміст антраценпохідних в підземних органах щавлю кінського в різні строки заготівлі;

- визначено вміст хризофанолу в очищеному зразку;

– синтезовано 31 сполуку похідних антрахінону підгрупи алізарину, встановлено їх структуру;

– виявлено біологічну активність деяких природних і синтетичних похідних антрахінону;

– вивчені морфолого-анатомічні ознаки плодів і насіння жостеру проносного;

Апробація результатів дисертації.

Матеріали дисертаційної роботи були представлені на Міжнародній конференції “Физиолого-биологические аспекты изучения лекарственных растений” (Новосибирск, 1998), Міжнародній конференції “Теорія і практика створення лікарських препаратів” (Харків, 1998), на науково-практичній конференції “Современные проблемы фармакогнозии и фитотерапии” (Ярославль, 1999), та на V з їзді фармацевтів України (Харків, 1999).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 10 робіт, з них 5 статей і 5 тез доповідей.

Обсяг та структура дисертації.

Дисертаційна робота викладена на 165 сторінках, складається із вступу, огляду літератури, розділу, який присвячено об'єктам вивчення, методикам та реактивам, чотирьох розділів експериментальних досліджень, висновків і списку використаних джерел. Робота ілюстрована 31 таблицями, 29 рисунками, 2 графіками, 9 схемами реакцій. Список літератури містить 203 джерела, в тому числі 130 іноземних.

2.ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

1. Сировина, методики та реактиви.

Об'єктами дослідження служили кора крушини (Cortex Frangulae), насіння жостеру проносного (Semina Rhamni catharticae), кореневища та корені щавлю кінського (Rhizomata et radices Rumicis conferti), заготовлені на протязі 1995-2001 рр. Для визначення вмісту суми гідроксиантрахінонів у підземних органах щавлю кінського сировину заготовляли з однієї промислової ділянки на протязі вегетації з квітня по жовтень 1997 р. о околиці м. Чугуєва. Мікроскопічну будову плодів і насіння жостеру проносного вивчали на свіжих, фіксованих та розмочених зразках.

За результатами аналізу літературних джерел та експериментальної роботи відпрацьовано методики:

- хроматографічного і хімічного якісного визначення похідних антрахінонів в ЛРС, субстанціях і очищених зразках;

– виділення і очищення індивідуальних гідроксиантрахінонів з сировини, в тому числі емодину з кори крушини (методи А,Б), насіння жостеру (методи А,Б,В) і хризофанолу з кореневищ і коренів щавлю кінського (методи А,Г)

– кількісного визначення суми гідроксиантрахінонів, емодину і хризофанолу в ЛРС, субстанції та очищених зразках.

Метод А. Наважку сировини тричі екстрагували на водяній бані сумішшю /хлороформ - розчин сірчаної кислоти/. Хлороформні екстракти об'єднували, промивали водою, випарювали. Сухий залишок розчиняли в розчині натрію карбонату, нагрівали на водяній бані, охолоджували, підкислювали розчином сірчаної кислоти. Осад, який випав, відокремлювали, сушили, розчиняли в бензолі й отримували емодин з незначними домішками фенолів.

Метод Б . Наважку сировини обробляли при нагріванні на водяній бані розчином соляної кислоти, охолоджували, сировину відокремлювали, промивали водою, сушили. Суху сировину тричі екстрагували хлороформом при нагріванні, хлороформні витяги об'єднували, упарювали. Сухий залишок розчиняли в розчині натрію карбонату, нагрівали на водяній бані, охолоджували, фільтрували, підкислювали розчином соляної кислоти, відокремлювали осад, який випав, сушили, розчиняли в бензолі й отримували емодин з незначними домішками фенолів.

Метод В . Емодин з насіння жостеру проносного виділяли також багаторазовою екстракцією ЛРС розчином натрію гідроксиду при кімнатній температурі. Лужні розчини об'єднували, нагрівали на водяній бані, охолоджували, підкислювали розчином сірчаної кислоти, нагрівали. Осад, який випав, відокремлювали, розчиняли у розчині натрію карбонату, фільтрували, підкислювали розчином сірчаної кислоти. Осад, який випав, відокремлювали, сушили, розчиняли в бензолі й отримували емодин, з незначними домішками інших гідроксиантрахінонів.

Метод Г.. Наважку сировини екстрагували ізопропиловим спиртом, з домішкою соляної кислоти при нагріванні на водяній бані. Сировину відокремлювали та ще двічі екстрагували чистим ізопропиловим спиртом. Спиртові екстракти об'єднували, упарювали та виливали у воду .Осад , що випадав, відокремлювали, промивали водою, обробляли розчином натрію карбонату, нагрівали на водяній бані на протязі 30 хв, охолоджували. Осад, що не розчинився , відокремлювали, промивали водою, сушили, розчиняли в етанолі 96%. Випадав хризофанол з незначною домішкою фісціону.Очищення хризофанолу від супутніх речовин здійснювали на колонці силікагелю.

2. Виявлення, визначення вмісту, виділення із ЛРС, очищення та вивчення гідроксиантрахінонів.

Якісними реакціями та хроматографічним аналізом (ТШХ, ПХ) в корі крушини і підземних органах щавлю кінського підтверджено, а в насінні жостеру проносного доведено наявність гідроксиантрахінонів.

2.1 Кора крушини вільховидної.

За модифікованою методикою Британської фармакопеї було визначено вміст емодину у корі крушини та здійснено виділення його з сировини двома методами. У названій сировині кількісний вміст емодину було визначено вперше, і також вперше виділено його в чистому вигляді методами А і Б( табл.1)

Таблиця 1. Вміст емодину або хризофанолу в ЛРС та вихід їх із сировини

2.2. Насіння жостеру проносного.

Методом ТШХ та ПХ у сировині було виявлено не менш п'яти агліконів і чотирьох глікозидів антрахінонової природи. Було розроблено спосіб одержання очищеної суми агліконів і глікозидів, а за допомогою рідинної екстракції та колонкової хроматографії на силікагелі було виділено два аглікони та один глікозид антрахінонової природи. Структуру виділених речовин встановлювали на підставі спектральних, фізичних та хімічних методів аналізу в порівнянні з достовірними зразками (табл. 2).

За характером хроматографічної поведінки в порівнянні з достовірними зразками, продуктам ацетилювання, метилування та дезалкілування речовини Iж і IІж віднесено до антрахінонових агліконів. УФ-спектри сполук Iж і IІж мають характерні максимуми поглинання в області 224, 286, 431 нм та 222, 290, 440 нм відповідно. При додаванні розчину алюмінію хлориду до спиртового розчину Іж, спектр його має батохромний зсув довгохвильового максимуму на 40нм, а спектр речовини ІІж на 75 нм, що підтверджує наявність вільних ОН-груп в ??положенні. У ІЧ-спектрі речовини ІІж присутня інтенсивна смуга поглинання при 3400 см^-1, а у Іж такої смуги немає, що свідчить про наявність вільної ОН-групи у -положенні ІІж. Інтенсивна смуга у Іж і ІІж при 1683 см^-1 та 1670 см^-1 відповідає вільній хіноідній карбонільній групі, а також смуга хіноідної ЇС==О групи, яка пов'язана внутрішньомолекулярним гідрогенним зв'язком (ВМГЗ) з гідроксилом в ?-положенні, відмічена в області 1630см^-1 та 1625 см^-1 відповідно. На підставі УФ, ІЧ-спектроскопії речовини Іж та ІІж мають вільні ОН-групи в ?-положенні, а речовина ІІж - вільну гідроксильну групу в ?-положенні.

Таблиця 2. Фізико-хімічні властивості виділених сполук і продуктів їх перетворень