Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Регуляція процесів неоваскуляризації при лікуванні захворювань рогівки

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня доктора медичних наук

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Неоваскуляризація рогівки (НР) - це вростання судин у рогівку, яка за своїми анатомічними і функціональними властивостями є аваскулярною тканиною. НР супроводжує ряд різноманітних захворювань, серед яких знаходяться опіки, травми, вірусні та бактеріальні інфекції, гіпоксія, зокрема при вживанні контактних лінз, імунологічні порушення, у тому числі реакція відторгнення рогівкового трансплантата, деякі дегенеративні захворювання. НР спостерігається при найбільш частих інфекційних захворюваннях як у розвинутих країнах (герпетичний кератит), так і в країнах, які розвиваються (трахома).

НР представляє важливу медико-соціальну проблему. За даними P. Lee, C.C. Wang, A.P. Adamis (1998) у США у 1998 році НР виявлена у 1,4 млн пацієнтів; 4% всього населення країни має новоутворені судини рогівки; у 20% рогівкових дисків, висічених під час кератопластики, є гістоморфологічні ознаки васкуляризації. Тривале спостереження за хворими запальними захворюваннями рогівки показало, що НР розвивається більше, ніж у 60% хворих [Power WJ et al., 1998].

Результатом захворювань рогівки з її неоваскуляризацією є формування васкуляризованих помутнінь рогівки, які є не лише причиною значного зниження зору, але і косметичним дефектом [Benelli U., Ross J.R., Nardi M. et al., 1997; Lepri A., Benelli U., Bernardini N. et al., 1994; Nguyen N, Goldberg M, Pico J. et al., 1995]. Крім того неоваскуляризація приводить до втрати «імунної привілеї» нормальної рогівки [Dana MR, Streilein JW, 1996]. Васкуляризація рогівки є також особливо великим фактором ризику при операції кератопластики [Гундорова Р.А., Степанов А.В., Ибадова С.И., 1995; Maguire M.G., Stark W.J., Gottsch J.D. et al., 1994; Caffery BE. Josephson JE., 1995; Torres PF., De Vos AF., van der Gaag R. et al., 1996, Jonas JB, Rank RM, Budde WM., 2002]. За даними Н.О. Пучковської і В.В. Войно-Ясенецького (1985) неоваскуляризацiя є ознакою патологiчної (замiсної) регенерацiї рогiвки. Хоч неоваскуляризація інколи може бути корисною для подолання інфекції, загоєння рани, зупинки прогресування імуно-залежних розм'якшень рогівки, її негативні сторони значно переважають. Тому серед робіт, присвячених НР, найбільше зацікавлення викликають роботи по вивченню методів її пригнічення.

Незважаючи на чисельні дослідження в області НР, патогенез цього процесу залишається неясним [Копаева В.Г., Плескова А.В., Маклакова И.А. и др., 1993; Epstein R.J., Stulting R.D., Hendricks RL., Harris DM., 1991].

Пригнічення НР є метою багатьох експериментальних і клінічних досліджень. Однак, лікування НР часто виявляється мало ефективним або і зовсім неефективним [Epstein R.J., Stulting R.D.1987].

На основі аналізу приведених літературних даних можна прийти до висновку, що проблема НР викликає значний інтерес офтальмологів. Однак, роботи, присвячені пригніченню НР, не мають систематичного характеру і в значній мірі відбивають спроби дослідити вплив на неоваскуляризацію нових типів і класів біологічно активних речовин, які пропонує сучасна фармакологія і патофізіологія. Клінічне вивчення методів пригнічення НР, практично, не проводилося. Немає моделей НР, які придатні для перенесення результатів експериментальних досліджень в клініку. Недостатньо розробленими і ефективними є також існуючі методи оцінки НР.

Таким чином, можна стверджувати, що НР є важливою і актуальною проблемою офтальмології, а регуляція процесів неоваскуляризації може значно підвищити ефективність лікування захворювань рогівки, які супроводжуються її неоваскуляризацією.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертаційна робота є частиною планової наукової роботи кафедри офтальмології Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького «Розробка терапевтичних методів лікування запальних захворювань переднього відтинку ока (клініко-експериментальне дослідження)» - номер державної реєстрації 0199003672 (1998-2003 р.р.), де дисертант був співвиконавцем.

Мета роботи - підвищити ефективність лікування захворювань рогівки шляхом застосування патогенетично обгрунтованих фармакологічних, фізичних і хірургічних методів, які регулюють процеси неоваскуляризації.

Задачі дослідження:

Розробити моделі неінфекційної виразки рогівки і рогівково-кон'юнктивального опіку для вивчення зв'язку НР з етіо-патогенетичними особливостями патологічного процесу, а також для вивчення ефективності лікувальних заходів, спрямованих на регуляцію НР.

Вивчити особливості неоваскуяризації при центральних ізольованих опіках рогівки середнього і важкого ступенів, а також значення пошкодження різних ділянок поверхні ока (кон'юнктиви, лімбального і рогівкового епітелію) для розвитку НР в експерименті.

Вивчити вплив пригнічення НР шляхом коагуляції новоутворених судин рогівки на перебіг центрального ізольованого опіку рогівки середнього і важкого ступенів.

Вивчити роль порушення метаболічних процесів, які приводять до накопичення метаболітів (лактат, піруват), що ініціюють НР, а також окислювально-відновлювальної системи нікотинамідних коферментів, які забезпечують процеси біосинтезу і дезінтоксикації у хворих при захворюваннях рогівки з дестуктивними процесами і НР.

Розробити комплекс клінічних критеріїв і методів, які дозволяють найбільш повно оцінити якісні і кількісні параметри НР.

Розробити робочу класифікацію НР з урахуванням суттєвих факторів у механізімі її розвитку.

Провести клінічну оцінку впливу препаратів, які покращують трофіку і регенерацію, на НР у пацієнтів з захворюваннями рогівки, які супроводжуються деструктивними змінами.

Вивчити вплив імуносупресорів, стероїдних і нестероїдних протизапальних препаратів і гепарину на розвиток НР в експерименті і у клініці.

Вивчити вплив кисневих аплікацій на розвиток НР у хворих, що спричинена гіпоксією внаслідок користування контактними лінзами.

Розробити хірургічні методи пригнічення НР, викликаної дефіцитом лімбального епітелію, порушенням епітелізації і персистуючим епітеліально-стромальним дефектом шляхом трансплантації амніотичної оболонки і у комбінації останньої з трансплантацією лімбу. Вивчити їх ефективність в експерименті і у клініці.

На основі отриманих результатів розробити комплексну систему патогенетично-орієнтованих методів, спрямованих на регуляцію процесів НР при лікуванні її захворювань, та вивчити їх ефективність.

Об'єкт дослідження: неоваскуляризація рогівки.

Предмет дослідження: вивчення деяких сторін патогенезу неоваскуляризації рогівки, особливостей неоваскуляризації рогівки при деструктивних процесах рогівки різного ступеня, лікувальних впливів фармакологічних препаратів, фізичних та хірургічних методів впливу на неоваскуляризацію рогівки в експерименті і у клініці.

Методи дослідження: моделювання захворювань рогівки, які супрводжуються її неоваскуляризацією (центральний ізольований, периферичний і рогівково-кон'юнктивальний хімічний опік рогівки, стерильна виразка рогівки, проникаюче лімбально-рогівкове поранення); моделювання центрального ізольованого хімічного опіку рогівки різної важкості для вивчення особливостей НР; пошкодження рогівкового, лімбального епітелію і кон'юнктиви в експерименті для дослідження їх ролі у виникненні НР; визначення швидкості, площі, інтенсивності НР і її відношення до ділянки деструкції рогівки; визначення концентрації протеїназ при пошкодженні різних ділянок рогівкового епітелію; визначення концентрації лактата, пірувата, нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату, глюкозо-6-фосфатдегідрогенази у сльозі і у крові хворих з НР; систематичний клінічний контроль, біомікроскопія і фотореєстрація патологічного процесу для визначення ефективності пригнічення НР в експерименті; гістоморфологічне дослідження для вивчення характеру і динаміки НР в експерименті; при апробації методів у клініці - систематичний клінічний контроль, біомікроскопія, фотореєстрація, кількісна і «якісна» оцінка НР, визначення гостроти зору, середній ліжко-день, використання анкет обліку хворих.

Наукова новизна одержаних результатів. Розроблені оригінальні моделі кон'юнктивально-рогівкового опіку і стерильної виразки рогівки, характерною особливістю яких є пошкодження кон'юнктиви, лімбального епітелію, наявність персистуючого епітеліально-стромального дефекту, які дозволяють виявити етіо-патогенетичні особливості виникнення і розвитку НР та вивчити ефективність лікувальних впливів, спрямованих на регуляцію НР (пат. 38672 А Україна, МКВ9 А61F9/00. №2000084857).

Вперше встановлено, що при важких центральних ізольованих опіках рогівки неоваскуляризація периферичної (незміненої) частини рогівки відбиває процес проростання судин до ангіогенного стимулу, а неоваскуляризація центральної частини (ділянки деструкції) - відбиває етап замісної регенерації рогівкової строми.

Доповнено нові дані про патогенетичне значення пошкодження кон'юнктиви та лімбального епітелію у розвитку НР. Показано, що десквамація епітелію супроводжується підвищенням активності колагеназ і желатиназ, які приймають безпосередню участь у розвитку НР.

Розширені уявлення про роль відновленої форми нікотинамідаденіндинуклеотидфосфату, як попередника утворення факторів ангіогенезу в розвитку НР.

Вперше показано, що коагуляція новоутворених судин рогівки при важких деструктивних процесах, викликаних важким опіком, приводить до погіршання перебігу патологічного процесу (сповільнює епітелізацію і загоєння рогівки) і не зменшує інтенсивності неоваскуляризації, а при деструктивних процесах середньої важкості, викликаних опіком середнього ступеню, - позитивно відбивається на перебігу і наслідках процесу (наступає швидше заспокоєння ока, епітелізація рогівки і її просвітління) з менш інтенсивною НР.

Розроблена робоча класифікація НР, в основу якої покладені відмінності у механізмах розвитку НР, а саме відмінність у: 1) ступені деструкції рогівки; 2) дефіциті лімбального епітелію та персистуючому епітеліально-стромальному дефекті рогівки внаслідок пошкодження лімбального епітелію і кон'юнктиви; 3) імунологічному конфлікті.

На основі експериментально-клінічних досліджень вперше розкрито і доповнено нові сторони фармакологічної дії наступних препаратів. Циклоспорин А у вигяді інстиляцій пригнічує НР при експериментальному асептичному запаленні рогівки. Гепарин у вигляді субкон'юнктивальних ін'єкцій проявляє ангіомодулюючу дію: інгібування НР, викликаної опіками середньої важкості, і стимуляцію НР, викликаної важким опіком. Дексаметазон і наклоф з однаковою ефективністю пригнічують НР при їх місцевому застосуванні. При цьому наклоф у меншій мірі, ніж дексаметазон погіршує силу загоєння рогівкового поранення.

Розкрито і обгрунтовано регулюючу роль метаболітних препаратів, які покращують трофіку і регенерацію, у розвитку НР в залежності від важкості деструктивного процесу. У важких випадках вони сприяють замісній регенерації рогівки і її неоваскуляризації, а у випадках середньої важкості, навпаки, пригнічують НР.

Доведено пригнічення НР під дією трансплантації амніотичної оболонки, а також трансплантації амніотичної оболонки у комбінації з трансплантацією лімба і розкрито зв'язок цього впливу з відновленням нормальної структури поверхні ока.

Практичне значення одержаних результатів. Розроблені методи та критерії оцінки НР (відношення неоваскуляризації до ділянки деструкції рогівки, швидкість, площа та інтенсивність неоваскуляризації, час початку і зупинки вростання судин, регрес новоутворених судин) дозволяють об'єктивізувати дослідження цього патологічного процесу та ефективності лікувальних впливів на нього (пат. 46545 А Україна, МКВ9 А61В5/107. №2001085666).

Показана доцільність пригнічення НР у вигляді коагуляції новоутворених судин при деструктивних процесах рогівки середньої важкості (спостерігається просвітління рогівки, площа неоваскуляризації рогівки у 10 разів менша, ніж у контрольній групі, а інтенсивність неоваскуляризації - у 2 рази менша) і її шкідливість при важких деструктивних процесах. Пригнічення НР в останньому випадку приводить лише до короткочасної зупинки вростання судин у рогівку.

Розширено покази до місцевого застосування циклоспорину А у вигляді інстиляцій 3-5 разів на день для пригнічення НР. Особливо ефективне застосування циклоспорину А у комбінації з інстиляціями дексаметазону. Доведено, що субкон'юнктивальні ін'єкції гепарину в дозі 500 од при опіках середньої важкості пригнічують НР (швидкість вростання судин у рогівку зменшується на 36%), а при важких опіках, навпаки, стимулюють її (швидкість вростання судин підвищується на 47%).

Дексаметазон і наклоф у вигляді інстиляцій 3-5 разів на день з однаковою ефективністю пригнічують НР, викликану опіками, виразками рогівки, лімбально-рогівковими пораненнями тощо. Інтенсивність і площа НР впри застосуванні обох препаратів зменшувалися приблизно на 14%. Поскільки наклоф у меншій мірі впливає на регенерацію рогівкової тканини, його можна застосовувати на будь-якому етапі захворювання, яке спричинило НР. Доведено, що ефективним методом пригнічення НР, викликаної користуванням контактних лінз, є оксигенотерапія у вигляді ванночкових аплікацій кисню. При цьому довжина лімбу, захопленого новоутвореними судинами зменшується на 70%, а інтенсивність неоваскуляризації - на 80%.

Коагуляція новоутворених судин рогівки, проведена на тлі комплексного патогенетично спрямованого лікування, приводить до зменшення інтенсивності і площі неоваскуляризації приблизно на 40% порівняно з коагуляцією судин, проведеною у вигляді самостійної процедури.

Удосконалено метод хірургічного лікування НР (трансплантація амніотичної оболонки і її комбінація з трансплантацією лімба) при захворюваннях поверхні ока. У хворих з синдромом «дефіциту лімбального епітелію», персистуючим епітеліально-стромальним дефектом і НР під впливом трансплантації амніотичної оболонки площа неоваскуляризації рогівки зменшується на 34%, інтенсивність НР через 4 місяці після операції зменшується в 2 рази у порівнянні з контрольною групою. Розроблений безшовний спосіб фіксації трансплантата амніотичної оболонки у шарах рогівки забезпечує умови для якісної епітелізації рогівки по поверхні трансплантата і більш ефективного пригнічення неоваскуляризації (пат. 46208 А Україна, МКВ9 А61F9/00. №2000116430).

Розроблена патогенетично орієнтована система лікування захворювань рогівки, які супроводжуються її неоваскуляризацією, дозволяє суттєво підвищити ефективність лікування, що проявляється прискоренням загоєння, епітелізації, відновленням прозорості рогівки з меншою її неоваскуляризацією. Застосування цієї системи приводить до зупинки вростання судин у рогівку у 43% випадків, до повної і часткової редукції новоутворених судин у 44% випадків. В результаті, підвищення гостроти зору при застосуванні розробленої системи підвищується, в середньому, на 0,14 у порівнянні з контрольною групою.

Положення і висновки дисертаційної роботи впроваджені в навчальний процес кафедри офтальмології факультету післядипломної освіти Львівського національного медичного університету імені Данила Галицького. Розроблена система патогенетично орієнтованих методів лікування захворювань рогівки, які супроводжуються її неоваскуляризацією, застосовується в очному відділенні Львівської міської лікарні швидкої допомоги та в очному відділенні Львівської обласної клінічної лікарні.

Особистий внесок здобувача. Автором визначені мета, основні напрямки дослідження та завдання роботи. Експериментальні дослідження, проведені на 450 очах 225 кроликів, виконані особисто автором. Клінічні дослідження 342 хворих (403 очей), реєстрація і формування баз даних, фотореєстрація динаміки патологічного процесу проведені автором. Автором виконувався забір біологічних матеріалів для біохімічних та гістологічних досліджень. Узагальнення та заключення за результатами біохімічних досліджень проведені автором. Автором проведено також оцінку гістоморфологічних препаратів, співставлення клініко-морфологічних результатів і проведено їх узагальнення. Статистична обробка отриманих даних проведена автором самостійно.

Ідея розробки способів моделювання стерильної виразки рогівки та фіксації трансплантата амніотичної оболонки в шарах рогівки належить також співавторам патентів. Особисто авторові належить ідея використання моделі стерильної виразки для вивчення неоваскуляризації рогівки, а також ідея вивчення патогенетичного зв'язку між неоваскуляризацією рогівки і відновленням поверхні ока шляхом реконструктивної трансплантації амніотичної оболонки.

В друкованих працях з співавторами, дисертантом особисто проаналізовано зв'язок НР з етіо-патогенетичними особливостями експериментальних модельованих захворювань та перебіг патологічного процесу у хворих, проведено узагальнення стосовно особливостей неоваскуляризації при захворюваннях, які характеризуються деструктивними процесами рогівки різної локалізації і важкості.

Особисто виконано оформлення роботи, її редагування, формування теоретичних та практичних висновків і рекомендацій.

Здобувач щиро вдячний за велику допомогу науковому консультанту доктору медичних наук, професорові, член-кореспондентові АМН України Геннадію Дмитровичу Жабоєдову, співпрацівникам кафедри патанатомії Львівського національного медичного університету ім. Данила Галицького і лабораторії біохімії Інституту очних хвороб і тканинної терапії ім. В.П.Філатова АМН України за консультативну і технічну допомогу, а також співавторам наукових праць.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень оприлюднені та обговорені на науково-практичній конференції, присвяченій 25-річчю створення Львівської міської клінічної лікарні швидкої медичної допомоги (Львів, 1997), Х та ХП міжнародних офтальмологічних симпозіумах Одеса-Генуя (Одеса, 1997, 2001), науковій конференції офтальмологів, присвяченій 90-річчю акад. Н.О. Пучковської (Одеса, 1998), П Українсько-Польській конференції з офтальмології (Трускавець, 1999), міжнародній конференції присвяченій застосуванню амніотичної оболонки в офтальмології (Варшава, 2000), науковій конференції офтальмологів, присвяченій 125-річчю з дня народження акад. В.П.Філатова (Одеса, 2000), Х з'їзді офтальмологів України (Одеса, 2002), науково-практичній конференції з міжнародною участю «Актуальні питання тканинної терапії та перспективи застосування природних біологічно активних речовин у сучасній медицині» (Одеса, 2003), засіданні наукового товариства офтальмологів Львівської області (Львів, 2003) та інших конференціях.

Публікація результатів дослідження. За матеріалами дисертації опубліковано 38 наукових робіт, з них 18 статей у провідних фахових виданнях, затверджених ВАК України, 3 патенти України, 1 - розділ навчального посібника для студентів та інтернів медичних закладів ІІІ та IV рівнів акредитації, решта - у збірниках наукових праць, матеріалах конференцій і з'їздів.

Клінічні дослідження проведено на 202 хворих (246 очей) з патологією рогівки, яка супроводжувалася її неоваскуляризацією. Серед них з виразковими кератитами різної етіології було 73 хворих (74 очей), з опіками очей - 44 хворих (45 очей), з рогівково-лімбальними проникаючими пораненнями - 26 хворих (26 очей), з важкою формою трахоми - 22 хворих (44 ока), з дегенераціями рогівки різного генезу -14 хворих (17 очей), після кератопластики з приводу васкуляризованого більма і з явищами відторгнення рогівкового трансплантата - 6 хворих (6 очей), з неоваскуляризацією рогівки, викликаною користуванням контактними лінзами, - 17 хворих (34 очей). Контрольну групу склали 140 хворих (157 очей) з НР, виклаканою такими ж захворюваннями, що і в основній групі. У клінічній частині роботи представлені дані відносно розроблених методів оцінки НР, придатних для застосування у хворих; досліджувалися особливості НР при деструктивних процесах різної важкості і локалізації; вивчався вплив на НР метаболітних препаратів, що покращують трофіку і регенерацію, гепарину, стероїдних і нестероїдних протизапальних препаратів, оксигенотерапії, лазерної, термо- і кріокоагуляції судин, ТАО в тому числі в комбінації з трансплантацією лімбу; представлено дані щодо розробленої системи патогенетично-орієнтованих методів регуляції НР при лікуванні захворювань рогівки та вивчалася її ефективність.

Особливості та деякі сторони патогенезу неоваскуляризації рогівки в експерименті

Особливості неоваскуляризації рогівки при важких деструктивних процесах, викликаних опіком проведено на 30 очах 15 кроликів у двох групах - з опіками середньої важкості (перша група) і важкими опіками (друга група). Неоваскуляризацiю рогівки оцінювали за швидкістю вростання новоутворених судин і за часом завершення неоваскуляризації попеченої ділянки рогівки.

Результати досліджень показали, що, незалежно від важкості опіку, новоутворені судини появляються в ділянці лімбу вже на 3-й день спостереження. Швидкість вростання судин при опіках середньої важкості на протязі першого тижня становила 0,230,02 мм/добу, на протязі другого тижня - 0,210,01 мм/добу. При важких опіках швидкість вростання судин на протязі першого тижня становила 0,310,02 мм/добу. Однак, на 8-10 день, коли новоутворені судини досягали ділянки некрозу, швидкість вростання судин знижувалася і становила 0,110,01 мм/добу.

Таким чином НР при центральних ізольованих опіках рогівки можна умовно розділити на два етапи. Перший етап - це час, на протязі якого судини вростають до місця деструкції рогівки і другий етап - період неоваскуляризації пошкодженої ділянки. На першому етапі вростання судин відбувається під впливом ангіогенних факторів, які виробляються в попеченій рогівці. Швидкість неоваскуляризації на цьому етапі залежить перш за все від концентрації ангіогенних факторів, тобто від важкості опіку (рівня деструктивних змін). Надалі для «якісної» оцінки НР ми брали до уваги два якісних параметри: час досягнення судинами пошкодженої ділянки і час закінчення васкуляризації цієї ділянки.

Доцільність пригнічення неоваскуляризації рогівки шляхом коагуляції новоутворених судин рогівки на перебіг деструктивних процесів різної важкості проведено на 40 очах 20 кроликів у двох групах - з опіками середньої важкості (перша група) і важкими опіками (друга група).

Зупинка неоваскуляризації внаслідок коагуляції новоутворених судин рогівки при опіках середньої важкості сприяла позитивному перебігу опікового процесу. Так заспокоєння ока у підгрупі, де проводилася коагуляція новоутворених судин, наступила швидше, ніж у контрольній підгрупі: у контрольній підгрупі заспокоєння ока наступило на 8,90,6 день, а в основній - на 7,10,5 день. Завершення епітелізації рогівки та розсмоктування перифокального набряку рогівки в обох підгрупах (основній та контрольній) спостерігалося в той самий час. Однак, у основній підгрупі спостерігалося формування менш інтенсивного помутніння, ніж у контрольній підгрупі. При цьому інтенсивність і площа НР в основній підгрупі була значно меншими, ніж у контрольній підгрупі.

При важких опіках через 5-7 днів після повторної коагуляції у частині прокоагульованих судин спостерігалося відновлення кровотоку та активне вростання нових судинних гілок. Початок загоєння і більш швидка епітелізація виразки рогівки починалася лише після досягнення новоутвореними судинами попеченої ділянки. Епітелізація рогівки таким чином закінчувалася значно пізніше, ніж у контрольній підгрупі. Розсмоктування перифокального набряку у контрольній підгрупі відмічалася на 21,41,3 день, в основній - на 27,61,4 день. Так само і заспокоєння ока в контрольній підгрупі спостерігалося на 22,51,3 день, а в основній - лише на 29,11,6 день.

Процес закінчувався формуванням інтенсивно васкуляризованого більма. Інтенсивність помутніння становила 9,20,5 балів і була достовірно вищою (р<0,05, ніж у контролі (7,90,4 балів). Інтенсивність та площа НР теж були вищими, ніж у контролі.

Отже, пригнічення НР є показаним при деструктивних процесах середньої важкості і протипоказаним - при важких деструктивних процесах.

Вивчення ролі пошкодження рогівкового епітелію і кон'юнктиви у патогенезі розвитку НР проводилося на моделях центрального ізольованого опіку рогівки, центрального ізольованого опіку рогівки у комбінаціїії з деепітелізацією рогівки і в комбінації з ексцизією кон'юнктиви, а також на моделях периферичного і рогівково-кон'юнктивального опіків.

Центральний опік рогівки викликав НР середньої інтенсивності, в той час як такий же опік у комбінації з повною деепітелізацією рогівки достовірно приводив до вираженої НР. Однаковий по силі і площі опік периферичної частини рогівки разом з опіком лімбу теж закономірно приводив до вираженої НР (табл. 1). Механізм НР в цих випадках пов'язаний з пошкодженням лімбального епітелію і виникненням «дефіциту» лімбального епітелію.

Пошкодження кон'юнктиви (у вигляді висікання перилімбальної частини або її важкого опіку) на тлі опіку рогівки приводило до різкого порушення життєдіяльності рогової оболонки і проявлялося виразкуванням і виникненням персистуючого епітеліально-стромального дефекту. Це в свою чергу викликало виражену НР. Особливістю неоваскуляризації в цих випадках був пізній початок неоваскуляризації ділянки деструкції і повільний її розвиток (див. табл. 1).

Таблиця 1. Характеристика неоваскуляризації рогівки при різних моделях пошкодження поверхні ока

Таким чином, одним з механізмів виникнення НР поруч з глибоким порушенням життєдіяльності рогівки є дефіцит росткових епітеліальних клітин лімбу на ґрунті його пошкодження і персистуючий епітеліально-стромальний дефект рогівки, пов'язаний з пошкодженням кон'юнктиви.

Дослідження активності колагеназ і желатиназ для вивчення значення пошкодження різних ділянок рогівкового епітелію у виникненні НР проводилося у пробах тканини при десквамації лімбального ептелію та епітелію центральної частини рогівки на початку і на 7-й день експерименту. Субстратом для визначення активності колагеназ і желатиназ служив десквамований рогівковий епітелій.

Дослідження виявили різке підвищення активності як колагеназ, так і желатиназ у рогівковому епітелії на 7-й день експерименту (період активної НР) у порівнянні з активністю ферментів на початку експерименту (контроль) в обох групах. Однак, при пошкодженні лімбального епітелію таке підвищення активності було більш вираженим, ніж при пошкодженні епітелію центральної частини рогівки. Так активність колагенази в лімбальному епітелії у контролі становила 1,200,16 нкат х10^-2/г, а на 7-й день експерименту - 2,100,24 нкат х10^-2/г. Активність колагенази в епітелії центральної частини рогівки в контролі становила 1,350,19 нкат х10^-2/г, а на 7-й день експерименту - 1,980,22 нкат х10^-2/г

Активність желатиназ у лімбальному епітелії становила 0,950,18 нкат х10^-2/г, а після його пошкодження на 7-й день, коли спостерігалася активна неоваскуляризація лімбу - 1,560,10 нкат х10^-2/г. В центральній частині епітелію активність желатиназ у контролі становила 1,020,15 нкат х10^-2/г, а на 7-й день - 1,420,11 нкат х10^-2/г.

Нами в експерименті було показано, що в епітелії рогівки, у разі НР, відмічалася суттєва активація колагенази і желатинази, які включають комплекси металопротеїназ. Ці дані підтверджують роль металопротеїназ матриксу в процесах неоваскуляризації. Ця теза стає ще більше переконливою при співставленні величин активності колагенази і желатинази в центральній частині рогівкового епітелію, пошкодження якого не викликає неоваскуляризації, і лімбальної частини, пошкодження якої приводить до НР.

Дослідження ролі метаболічних компонентів у механізмі регуляції процесу неоваскуляризації рогівки. З метою дослідження пускових факторів механізму НР проводилося вивчення концентрації у сльозі і у крові хворих з неоваскуляризацією на різних стадіях цього патологічного процесу концентрації лактату, пірувату, нікотинамідного коферменту (НАДФН) і глюкозо-6-фосфату.

Визначення концентрації лактата у сльозі хворих з активною НР показало достовірне її підвищення у порівнянні з контрольною групою. Після завершення патологічного процесу, який викликав неоваскуляризацію, і зупинки вростання судин спостерігалося помітне зниження концентрації лактата у сльозі хворих. Так концентрація лактата у сльозі хворих контрольної групи становила 3,640,60 ммоль/л, при активній НР - 5,390,56 ммоль/л, а після завершення вростання судин - 4,540,63 ммоль/л

Концентрація пірувата у хворих з активною НР, навпаки, знижувалась у порівнянні з контрольною групою, а після завершення патологічного процесу і зупинки вростання судин - дещо підвищувалась. Концентрація пірувата у сльозі хворих контрольної групи становила 0,2080,036 мкмоль/л, у групі хворих з активною НР - 0,1590,022 мкмоль/л і у групі хворих з закінченим процесом і зупинкою вростання судин - 0,1820,027 мкмоль/л.

Визначення концентрації НАДФН у сльозі хворих з активною НР показало достовірне її зниження у порівнянні з контрольною групою. Після завершення процесу вростання судин у рогівку відмічалося підвищення вмісту досліджуваного кофермента.

Так концентрація НАДФН у сльозі хворих контрольної групи становила 0,2070,027 нмоль/л, у групі хворих з активною НР - 0,1350,016 нмоль/л і у групі з завершеним процесом і зупинкою вростання судин у рогівку - 0,1670,020 нмоль/л.

Визначення концентрації глюкозо-6-фосфату у сльозі хворих з активною НР теж виявило суттєве її зниження у порівнянні з контрольною групою та поступову нормалізацію показників після завершення патологічного процесу і зупинки вростання судин у рогівку. Так концентрація глюкозо-6-фосфату у сльозі хворих контрольної групи становила 26,204,26 мкмоль/л, у хворих з активною НР - 21,533,04 мкмоль/л і у групі хворих з завершеним процесом - 23,893,58 мкмоль/л.

Дослідження слізної рідини щодо рівня пірувата і лактата у хворих з інтенсивним процесом НР свідчить, що значний підйом концентрації лактата у сльозі може бути пусковою метаболічною ланкою в стимуляції процеса утворення нових судин. При цих же умовах значне зниження рівня відновленої форми досліджуваного нікотинамідного кофермента може свідчити про його підвищену витрату для регенерації відновленої форми глютатіону, а також про стимуляцію процесу його прямого окислення в оксигеназних реакціях ферментативного окислення поліморфними нуклеарами. Якщо у першому випадку можливе підвищення окисленої форми глютатіону - активатора металопротеїназ матрикса, то у другому випадку можливе утворення значних кількостей вільно-радикальних форм кисню, зокрема супероксидного радикала. Останні є прозапальними агентами і можуть пошкоджувати навколишні здорові тканини шляхом пероксидації ліпідів мембран, а також шляхом індукції пошкодження клітинних білків та інших молекул, зокрема ДНК [Hayashi S., Ishimoto S., Wu G.S. et al., 1997].

По мірі затихання процесу спостерігалося значне зниження концентрації лактата, яке статистично не відрізнялося від показників контролю. Це ж відноситься і до відновленої форми НАДФН, хоч в обох випадках абсолютні показники їх концентрації все ще не досягали нормального рівня.

Рівень глюкозо-6-фосфату у сльозі хворих з активною НР виявляв чітку тенденцію до зниження. Це відбиває порушення процесів біоенергетики, поскільки відомо, що синтез глюкозо-6-фосфату відбувається за участю аденозинтрифосфату.

Таким чином пусковими факторами НР слід розглядати ті метаболічні компоненти, які запускають весь каскад процесів утворення нових судин. До цих компонентів в першу чергу відносяться два види метаболітів. Перший тип - це природні метаболіти, які перевищують їх нормальну концентрацію внаслідок порушення аеробної фази окислювальних процесів через недостаток кисню. До таких належать молочна кислота та її попередник - піруват. До другого типу метаболітів, які є стимуляторами усього каскаду ангіогенезу, на нашу думку можна віднести продукти так званого «окислювального стресу», які також утворюються у надлишку при гіпоксичних станах різних тканин. Як відомо, у цих умовах активуються різноманітні оксигеназні реакції, які приводять до утворення вільно-радикальних сполук, що стимулюють біологічно активні ліпіди, а також викликають альтерацію білкових і вуглеводневих молекул. Продукти, які утворюються при цьому є медіаторами, що запускають у дію каскад специфічних регуляторів неоваскуляризації.

Експериментальне обґрунтування впливу медикаментозних і хірургічних методів лікування на неоваскуляризацію рогівки

Дослідження впливу місцевого застосування циклоспорину та циклоспорину у комбінації з дексаметазоном на неоваскуляризацію рогової оболонки проведено на 80 очах 40 кроликів на моделі асептичного запалення рогівки.

Місцеве застосування (інстиляції) циклоспорину проявляє виражений ангіостатичний ефект, особливо у комбінації з дексаметазоном. Так середня швидкість вростання судин у рогівку на протязі перших двох тижнів у випадку застосування циклоспорину становила 0,210,08 мм/добу, при застосуванні циклоспорину і дексаметазону - 0,180,06 мм/добу, а в контролі - 0,320,12 мм/добу. Таким чином місцеве застосування циклоспорину-А у вигляді інстиляцій має виражений ангіостатичний ефект, який проявляється меншою швидкістю вростання судин, меншою площею та інтенсивністю НР. Результати є статистично достовірними у порівнянні з контролем і з групою, в якій проводилися інстиляції дексаметазону. Особливо виражений ангіостатичний ефект отримано при одночасному застосуванні циклоспорину-А і дексаметазону. Крім пригнічення НР, в цій групі в результаті лікування відмічено формування менш інтенсивного помутніння рогівки.

Дослідження впливу гепарину на НР проводили на моделі центрального ізольованого опіку середньої важкості (15 очей, перша група) у порівнянні з контролем (15 очей, друга група) та важкого ступеню (15 очей, третя група) у порівнянні з контролем (15 очей, четверта група).

В контролі швидкість вростання судин при опіках середньої важкості на протязі першого тижня становила 0,230,02 мм/добу, на протязі другого тижня - 0,210,01 мм/добу. При важких опіках швидкість вростання судин на протязі першого тижня становила 0,310,02 мм/добу. Однак, на 8-10 день, коли новоутворені судини досягали ділянки опіку, швидкість вростання судин знижувалася і становила 0,110,01 мм/добу (табл. 2).

Таблиця 2. Швидкість вростання новоутворених судин рогівки (мм/добу) в контролі і при лікуванні гепарином в залежності від важкості опіку

Тиск повітря, який викликав розрив рогівкової рани в контролі становив 250,517,6 мм рт. ст., в групі, де проводилися інстиляції дексаметазону - 175,415,1 мм рт. ст., при інстиляціях наклофу - 207,616,6 мм рт. ст. При цьому різниця між результатами у контрольній і другій групах була недостовірною.

Таким чином, на основі отриманих результатів можна зробити висновок, що інстиляції дексаметазону і діклофенаку пригнічують неоваскуляризацію рогівки при проникаючих пораненнях рогівки в однаковій мірі. Однак, інстиляції дексаметазону в більшій мірі, ніж інстиляції наклофу, знижують міцність загоєння проникаючих ран рогової оболонки. Тому в комплексному лікуванні проникаючих поранень рогівки, які супроводжуються запальною реакцією і неоваскуляризацією рогівки перевагу слід віддавати нестероїдним протизапальним препаратам.

Вплив трансплантації амніотичної оболонки у вигляді реконструкції рогівкової поверхні на НР досліджувався на 20 очах з хімічним опіком рогівки і кон'юнктиви і 20 очах зі стерильною виразкою рогівки. Контролем служили 20 очей з кон'юнктивально-рогівковим опіком і 20 очей зі стерильною виразкою рогівки без лікування.

ТАО при експериментальних рогівково-кон'юнктивальному опіку і стерильній виразці рогівки приводить до стихання запальної реакції і швидшої, ніж в контролі, епітелізації рогівки, а також пригнічує неоваскуляризацію рогівки, що проявляється відсутністю васкуляризації в місці трансплантації, а також редукцією новоутворених судин. Так площа НР в контрольній групі зі стерильною виразкою рогівки становила 32,62,8 мм², після ТАО - лише 11,11,0 мм²; в контрольній групі з опіками - 39,23,1 мм² і після ТАО - 21,41,9 мм² (табл. 4).

Таблиця 4. Площа та інтенсивність неоваскуляризації рогівки в контрольних і експериментальних підгрупах на 30-й день експерименту (Mm)

Таким чином, закриття стромального дефекту амніотичною мембраною і стимуляція епітелізації рогівки по її поверхні перериває патогенетичний ланцюг змін, який веде до неоваскуляризації рогівки. Крім того трансплантація амніотичної оболонки може мати і прямий вплив на неоваскуляризацію завдяки дії факторів росту, які містяться в амніоні і безпосередньо пригнічують НР.

Клінічна ефективність медикаментозних, фізичних і хірургічних засобів впливу на неоваскуляризацію рогівки при лікуванні її захворювань

Оцінка неоваскуляризації рогівки в клініці. Враховуючи недоліки існуючих методів оцінки НР, ми розробили і користувалися наступними критеріями і методами оцінки НР в клініці: 1. Довжина лімбу в годинах, захопленого новоутвореними судинами (від 1 до 12 год.); 2. Довжина новоутворених судин від лімбу до центру рогівки виражена в частинах радіуса (1/3; 2/3 і 3/3 - судини досягнули центру); 3. Відношення неоваскуляризації до ділянки деструкції рогівкової строми: а) відсутня, б) почалася, в) завершилася; 4. Інтенсивність неоваскуляризації: а) слаба - поодинокі судини, б) середня - густа сітка судин, в) виражена - васкуляризація у вигляді пануса; 5. Інші важливі зміни рогівки: а) виразка (епітеліально-стромальний дефект), б) глибока деструкція рогівкової строми, в) дефіцит лімбального епітелію, г) помутніння.

Перший і другий критерії (довжина лімбу, захопленого новоутвореними судинами, в годинах і довжина новоутворених судин від лімбу до центру рогівки виражена в частинах радіуса рогівки) в сукупності визначають площу НР.

Дослідження особливостей НР при виразкових кератитах та опіках очей проведено на основі аналізу 307 історій хвороб хворих з виразковими кератитами (282 хворих) і опіками очей (25 хворих). Серед них виділено 24 хворих (25 випадків) з виразковими кератитами і 15 хворих (15 випадків) з опіками, які характеризувалися торпідним перебігом, рецидивуючим характером з персистуючим епітеліально-стромальним дефектом, дефіцитом лімбального епітелію та НР.

Аналіз історій хвороб 282 пацієнтів (286 очей) з виразковими кератитами показав, що в частині випадків - 24 хворих (25 очей), що склало 8,8% - спостерігався торпідний характер захворювання зі сповільненими регенерацією і загоєнням виразки та НР.

Таким чином, в частині випадків важкі кератити набирають торпідного, хронічного перебігу. Такі захворювання характеризуються персистуючим епітеліально-стромальним дефектом, порушенням трофіки, спотвореною регенерацією з неоваскуляризацією рогівки. При важких деструктивних процесах рогівки неоваскуляризація непошкодженої ділянки у всіх випадках починається на 3-й день після опіку або на 3-й день після формування виразки. Однак неоваскуляризація деструктивно зміненої частини затримується, а час васкуляризації цієї ділянки корелює з часом загоєння.

Патогенетична класифікація неоваскуляризації рогівки. Неоваскуляризація рогівки є патологічним процесом, який виникає при багатьох станах і захворюваннях рогівки. Уже сам перелік захворювань, які викликають неоваскуляризацію, свідчить не лише про поліетіологічність цього процесу, але й про різноманітні механізми і фактори виникнення НР.

Згідно наших спостережень характерною особливістю першої групи захворювань, які приводять до НР, є глибока деструкція рогівкової строми. До таких захворювань відносяться виразки рогівки, глибокі опіки рогівки, проникаючі корнео-склеральні поранення та інші травматичні пошкодження.

Друга група захворювань, які приводять до НР - це так звані захворювання поверхні ока. Ці захворювання виникають внаслідок пошкодження кон'юнктиви, рогікового, особливо лімбального епітелію, і приводять до дефіциту лімбального епітелію, персистуючих епітеліально-стромальних дефектів, хронічного запалення рогівкової строми і НР.

Третю групу складають захворювання, які супроводжуються імунологічним конфліктом, наприклад, реакція відторгнення рогівкового трансплантата, скрофульозний кератокон'юнктивіт, герпетичний кератит, опіки рогівки тощо.

На основі літературних даних і власних досліджень ми запропонували патогенетичну класифікацію НР:

1. НР внаслідок глибокої деструкції рогівкової строми;

2. НР внаслідок дефіциту лімбального епітелію та персистуючого епітеліально-стромального дефекту рогівки;

3. НР внаслідок імунологічного конфлікту;

4. НР при комбінованій дії цих механізмів.

Першим механізмом НР є глибока деструкція рогівкової строми. Сюди відноситься не тільки деструкція на морфологічному (наприклад, виразка), або тканинному рівні (некротичні зміни при глибокому опіку), але й на обмінному рівні (порушення тканинного дихання тощо). Такі порушення спостерігаються при виразках, опіках, травматичних пошкодженнях, запальних процесах.

Другий механізм НР (дефіцит лімбального епітелію та персистуючий епітеліально-стромальний дефект рогівки) спостерігається при багатьох захворюваннях, об'єднаних в групу захворювань поверхні ока - опіки, неінфекційні виразки, рецидивуючі ерозії, трахома, повторні операції в лімбальній ділянці та ін. Дефіцит лімбального епітелію приводить до кон'юнктивізації рогівкового епітелію з вростанням судин в рогівку (Kruse FE, Chen JJY, Tsai RJF, Tseng SCG, 1990; Huang AJW, Tseng SCG, 1991; Сroasdale CR, Schwartz GS, Malling JV, Holland EJ, 1999). Крім того лімбальний епітелій має антиангіогенні властивості і його відсутність сприяє вростанню судин в рогівку. З іншого боку персистуючий епітеліальний дефект рогівки приводить до порушення бар'єру між сльозою і рогівкою, проникнення в рогівкову строму ферментів, ензимів, запальних клітин і, як наслідок, до деградації рогівкової строми і НР (Xu KP, Wu Y, Zhou J, Zhang X., 1999; Kenyon KR, Roberts CW., 1984; Choi YSC, Kim JY, Wee WR, Lee JH., 1998; Schanzlin DJ, Cyr RJ, Friedlaender MH, 1983).

Наші порівняльні дослідження при опіку центральної частини рогівки і периферичної частини рогівки разом з лімбом підтверджують велике значення пошкодження рогівкового, зокрема лімбального епітелію, у розвитку НР.

Третій механізм НР (імунологічний конфлікт) спостерігається при реакції відторгнення рогівкового трансплантату з приводу васкуляризованого більма, при опіках з автосесибілізацією до попеченої рогівкової тканини, при герпетичних ураженнях рогівки, при ксенотрансплантації в експерименті. Одночасно васкуляризація рогівки приводить до порушення її імунологічного статусу.

В багатьох випадках механізм НР є змішаним. Так у випадку опіку найчастіше присутні всі три патогенетичні механізми НР: глибока деструкція рогівкової строми, дефіцит лімбального епітелію і імунологічний конфлікт на ґрунті автосенсибілізації. Переважно один з цих механізмів є ведучим, інші - другорядними або розвиваються з часом.

Запропонована патогенетична класифікація є кроком для розуміння і подальшого вивчення різноманітних варіантів НР, а також може служити підставою для патогенетично спрямованої терапії захворювань рогівки, які супроводжуються її неоваскуляризацією.

Дослідження впливу метаболітних препаратів, які покращують трофіку та регенерацію рогівки, на НР проведено на 35 хворих (36 очей) з виразками рогівки. Контрольну групу склали інших 24 хворих (25 очей) з виразками рогівки аналогічними за важкістю та перебігом запального процесу.

Введення в комплексне лікування препаратів та фізичних методів, які стимулюють регенерацію, епітелізацію і трофіку рогівки, значно підвищувало ефективність лікування. У хворих основної групи спостерігалося прискорення епітелізації рогівки та швидше розсмоктування інфільтрату порівняно з хворими контрольної групи. Васкуляризація виразки проходила швидше, що сприяло регенерації рогівкової строми і епітелізації виразки. Завершення васкуляризації виразкової поверхні у контрольній групі наступало на 18,21,5 день, а в основній групі - на 13,11,0 день (р<0,01). При цьому васкуляризація виразки ставала менш інтенсивною. Такий перебіг захворювання спостерігався у 21 хворого (22 очей).