Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ПРОБЛЕМ КРІОБІОЛОГІЇ І КРІОМЕДИЦИНИ

Автореферат дисертації

на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

РЕГЕНЕРАЦІЯ ПЕЧІНКИ ЩУРІВ ПІСЛЯ ЧАСТКОВОЇ ГЕПАТЕКТОМІЇ ТА ТРАНСПЛАНТАЦІЇ ЕМБРІОНАЛЬНИХ І ДИФЕРЕНЦІЙОВАНИХ КЛІТИН ПЕЧІНКИ, ЯКІ ЗАЗНАЛИ ВПЛИВУ НИЗЬКИХ ТЕМПЕРАТУР

Моісєєва Наталія Миколаївна

УДК:57.017.35.085:616.36-089.87:615.361.36.013.014.413

03.00.19 - кріобіологія

Харків - 2003

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України.

Науковий керівник

доктор біологічних наук, професор

Петренко Олександр Юрійович, Інститут проблем кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, завідувач відділу кріобіохімії.

Офіційні опоненти:

доктор біологічних наук,

Розанов Леонід Федорович, Інститут проблем

кріобіології і кріомедицини Національної академії наук України, старший науковий співробітник відділу низькотемпературного консервування;

доктор біологічних наук, професор

Малоштан Людмила Миколаївна, Харківський національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри фізіології.

Провідна установа Харківський національний університет

ім. В.Н. Каразіна, кафедра біохімії, м. Харків.

Захист відбудеться 20.05.2003 р. о 13-30 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.242.01 при Інституті проблем кріобіології і кріомедицини НАН України , 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІПКіК НАН України за адресою: 61015, м. Харків 15, вул. Переяславська, 23.

Автореферат розісланий_19.04.2003 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук, професор Гольцев А.М.

Размещено на http://www.allbest.ru/

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Сучасний етап розвитку медико-біологічних наук характеризується пошуком таких методів корекції патологічних станів, які б зводили до мінімуму екзогенне втручання та грунтувалися на задійсненні внутрішніх ресурсів організму. Клітинна трансплантація дозволяє уникнути значного хірургічного втручання, не потребує тривалої підготовки та особливо перспективна в тих випадках, коли для заміни втраченої функції органу досить невеликої кількості донорського матеріалу, як це показано для багатьох спадкових метаболічних дефектів печінки [Fuller B., 1988; Gupta S., 1992; Kobayasashi N., 2000]. Більш того, трансплантація гепатоцитів справляє суттєвий позитивний вплив навіть у випадках летальних форм експериментальної гострої печінкової недостатності [Wang X. D., 1991;Vogels B. F., 1996].

Пересадка клітин має суттєву перевагу порівняно з трансплантацією цілих органів, котрі надзвичайно важко піддаються тривалому зберіганню [Roddriguez J., 1999]. Інтенсивне опрацювання методів тривалого зберігання ізольованих клітин із застосуванням як гіпотермічних, так і низьких температур, призвело до створення банків різноманітних клітинних суспензій. Існуючі за наших часів методи кріоконсервування диференційованих клітин печінки - гепатоцитів дозволяють зберігати життєздатними протягом практично необмеженого строку близько 50 60% клітин суспензії [Chesne C., 1988; Petrenko A. et al., 1992]. Гіпотермічне зберігання може забезпечувати більш високі показники життєздатності клітин суспензії, але має обмежені терміни зберігання. Розроблений в Інституті проблем кріобіології та кріомедицини НАН України метод гіпотермічного зберігання гепатоцитів щурів при 0 - 4С [Кравченко Л. П. 1997], в якому використовується сахарозомісткий розчин, забезпечує зберігання гепатоцитів протягом 3-х діб без значної втрати нативних властивостей. Цей метод успішно конкурує за рядом структурних і функціональних тестів in vitro з кращими закордонними аналогами. Разом з цим ефективність трансплантації консервованих таким методом гепатоцитів не вивчалась.

Використання суспензій клітин печінки ембріонального походження як трансплантата завдяки великій пластичності та проліферативній активності має додаткову перевагу порівняно з диференційованими гепатоцитами. Трансплантація кріоконсервованих ембріональних гемопоетичних клітин печінки вже знайшла досить широке застосування у сучасній клінічній практиці для корекції патологій кровотворення різної етіології [Грищенко В. И. и др., 1988, 2001]. Можливість використання клітин ембріональної печінки для корекції станів, пов'язаних з дисфункцією печінки, тільки починають розроблятися. Обгрунтованість такого підходу базується на наявності у суспензії клітин ембріональної печінки попередників гепатоцитів та біліарних клітин [Shafritz D., 2000]. Крім цього, ембріональні клітини продукують широкий збалансований спектр ростових факторів і біологічно активних речовин, які можуть позитивно впливати на стан організму в цілому.

Незважаючи на наявний інтерес до можливостей трансплантації консервованих гепатоцитів та клітин ембріональної печінки коригувати різні патологічні стани печінки, комплексні дослідження, які б поєднували морфологічний, біохімічний та клінічний підходи, не проводилися.

Складність та багатофакторність обраного підходу зумовили вибір експериментальної моделі для дослідження, яка б відповідала вимогам стійкої відтвореності і вивченості. Модель часткової гепатектомії (ЧГЕ) дозволяє вилучити 67 68% загальної маси органа. При цьому залишений фрагмент печінки має потенціал і здатність до відновлення маси, структури та функцій, що дозволяє вивчати на цій моделі процеси регенерації та вплив на них трансплантації диференційованих гепатоцитів і клітин ембріональної печінки.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконана у відділі кріобіохімії в рамках планових тем НДР ІПКіК НАН України: № 87 "Вивчення механізму біологічної дії кріоконсервованих препаратів ембріональної печінки на метаболізм гепатоцитів в умовах функціональної недостатності печінки", № ГР 0202U000833; № 7 "Вивчення морфофункціональних особливостей регіональних стовбурових клітин ембріонів, їхньої кріочутливості й механізмів реалізації біологічної активності в умовах культивування і на моделях деяких патологічних станів", № ГР 0102U002026.

Мета і задачі дослідження. Мета роботи стимуляція процесів регенерації печінки у частково гепатектомованих щурів шляхом трансплантації гепатоцитів, підданих гіпотермічному зберіганню, або кріоконсервованих клітин ембріональної печінки.

Для досягнення поставленої мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Вивчити вплив трансплантації свіжоізольованих та консервованих за умов гіпотермії гепатоцитів щурів на процеси регенерації печінки щурів після часткової гепатектомії.

2. Дослідити вплив трансплантації кріоконсервованих клітин ембріональної печінки людини на відновлення маси, детоксикаційну, видільну, білоксинтетичну функції печінки, а також показники периферичної крові у частково гепатектомованих щурів.

3. Визначити морфологічний стан печінки та селезінки частково гепатектомованих щурів після трансплантації гепатоцитів і клітин ембріональної печінки.

Об'єкт дослідження. Процеси відновлення печінки щурів після часткової гепатектомії та трансплантації клітин, які зазнали дії гіпотермічного чи низькотемпературного зберігання.

Предмет дослідження. Кріоконсервовані клітини ембріональної печінки людини та консервовані гепатоцити щурів.

Методи дослідження. Детоксикаційну функцію печінки оцінювали за швидкістю метаболізму ксенобіотика гексенала; для вивчення біохімічних показників крові застосовували спектрофотометричний метод; кількість

лейкоцитів, еритроцитів і тривалість протромбінового часу визначали загальноприйнятими клінічними методами; для оцінки загального та фетального гемоглобіну застосовували спектрофотометричний метод; рівень середніх молекул визначали методом гель-проникної хроматографії; дослідження морфології печінки та селезінки проводили методом світлової мікроскопії; гепатоцити (Гц) виявляли в селезінці щурів з використанням гістохімічного методу; присутність у селезінці та печінці щурів кріоконсервованих клітин ембріональної печінки людини - з використанням непрямого імунофлуоресцентного тесту.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше встановлено, що трансплантація гепатоцитів покращує показники печінки і стану організму щурів після часткової гепатектомії, прискорює відновлення маси печінки, яка регенерує; сприяє значному скороченню тривалості гексеналового сну; нормалізує рівень загального білірубіну; знижує вміст лейкоцитів у периферичній крові. Гіпотермічне зберігання гепатоцитів при 4С протягом 2-х діб у сахарозомісткому розчині (СМР) зберігає їх ефективність як трансплантата.

Встановлено, що кріоконсервовані клітини ембріональної печінки (ККЕП), як і гепатоцити, сприяють відновленню маси печінки і нормалізації її функцій. Крім того, вони позитивно впливають на показники периферичної крові при трансплантації щурам з частковою гепатектомією.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані дані про відновлення та нормалізацію функцій печінки у частково гепатектомованих щурів після трансплантації кріоконсервованих клітин ембріональної печінки та консервованих гепатоцитів сприяють з'ясуванню механізмів процесів регенерації органа і можуть бути використані при розробці методів регенераційної терапії патологічних станів печінки.

У роботі доведено, що гіпотермічне зберігання гепатоцитів у СМР протягом двох діб не впливає на їх морфофункціональні властивості та дозволяє повною мірою зберегти їх потенціал як трансплантата. Одержані результати можуть бути використані в клінічній та експериментальній трансплантології.

Особистий внесок здобувача. Автором дисертаційної роботи самостійно проаналізовано дані літератури за темою дослідження, конкретизовані мета і задачі роботи й обрані шляхи їх вирішення. Автором особисто одержані результати експериментальних досліджень та проведено їх статистичну обробку, а також зроблено попередні висновки. Разом з науковим керівником автором були інтерпретовані результати та зроблені остаточні висновки.

Апробація результатів дисертації. Результати досліджень докладалися: на конференції молодих вчених ІПКіК НАНУ (м. Харків, 1999, 2000); 2-ому з'їзді трансплантологів України (м. Київ, 2000); конференції ХНУ “Научное наследие академика И. Н. Буланкина и его развитие в современной биохимии” (м. Харків, 2001); конференції ХДМУ “Медицина третього тисячоліття” (м. Харків, 2001); щорічній зустрічі міжнародного товариства кріобіологів CRYO 2001 (м. Едінбург, 2001); конференції ХДМУ “Успіхи та перспективи розвитку кріобіології та кріомедицини” (м. Харків, 2001).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 7 статей, 5 тез доповідей, з яких 5 статей опублікано у провідних фахових виданнях.

Структура дисертації. Дисертаційна робота складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів дослідження, глави власних спостережень та їх обговорення, заключної частини, висновків та переліку літературних посилань. Матеріали дисертації викладені на 118 сторінках. Роботу проілюстровано 35 рисунками, 2 таблицями. Список літератури містить 225 джерел і розміщений на 23 сторінках.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ РОБОТИ

регенерація печінка трансплантація гепатоцит

Матеріали і методи дослідження

Дослідження проводили на білих щурах-самцях вагою 140-160 г.

Часткову гепатектомію здійснювали за стандартним методом [Higgins G. H., Anderson R. N., 1931].

Гепатоцити дорослих щурів виділяли неферментативним методом [Кравченко Л. П., 1997].

Клітини ембріональної печінки ембріонів людини 7-12 тижнів гестації отримували неферментативним методом [Петренко О. Ю., 1991]. Кріоконсервування клітин ембріональної печінки здійснювали у сахарозному середовищі з 5% ДМСО за трьохетапною програмою заморожування з початковою швидкістю 1С/хв до -40С, 10С/хв від -40С до -80С і наступним занурюванням контейнера з суспензією клітин у рідкий азот. Безпосередньо перед експериментом суспензію ККЕП, яка зберігалася протягом місяця у рідкому азоті, відігрівали на водяній бані (+37С).

Гіпотермічне зберігання ізольованих гепатоцитів при температурі 4 С здійснювали у сахарозомісткому розчині (СМР, ізотонічний розчин сахарози, збалансований сольовими компонентами, з додаванням 1% БСА) протягом двох діб [Кравченко Л. П., 1993].

Життєздатність отриманої суспензії визначали через забарвлення клітин вітальним барвником трипановим синім [Seglen P. O., 1976]. Концентрацію клітин у суспензії визначали за стандартною методикою з підрахунком у камері Горяєва [Неменова Ю. М., 1972].

Трансплантацію клітин печінки здійснювали в пульпу селезінки щурів у кількості 1107 клітин (0,3 мл) на тварину. Контрольним тваринам вводили рівний об'єм (0,3 мл) середовища консервування.

Тварин виводили з експерименту через три доби, регенерацію маси печінки визначали за формулою [Child C. G. et al., 1953]. Протягом 3-х діб експерименту оцінювали: детоксикаційну функцію печінки за тривалістю гексеналового сну [Трахтенберг И. М., 1991] та за вмістом середніх молекул у сироватці крові методом гель-проникної хроматографії на колонці, заповненій полівініловим гелем Toyopearl HW-40 Fine (Toyo Soda, Japan), який дозволяє розділити поліпептидні молекули у діапазоні молекулярних мас від 100 до 10000 Да; видільну функцію печінки оцінювали за вмістом загального білірубіну у сироватці крові щурів за допомогою діагностичного набору “Лахема” (Чехія); вміст альбуміну у сироватці крові визначали за допомогою діагностичного набору "Агат" (Росія); для оцінки вмісту загального білка використовували загальноприйнятий метод Лоурі в модифікації Міллєра [Miller G. L., 1959].

Протягом 3-х діб у периферичній крові щурів визначали вміст лейкоцитів, еритроцитів [Меньшикова В. В., 1987], рівень загального та фетального гемогло- біну [Базарнова М. А., 1994], тривалість протромбінового часу [Меньшикова В.В., 1987].

Для гістологічних досліджень селезінку та печінку щурів фіксували в кальцій-формолі за Холтом [Луппа Х., 1980], зрізи фарбували гематоксиліном та еозином [Ліллі Р., 1969], глікоген виявляли реактивом Шиффа [Пірс Є., 1962], сполучну тканину в гістологічних зрізах визначали методом алохромного фарбування [Ліллі Р., 1969]. Дослідження фарбованих зрізів печінки та селезінки щурів проводили під світловим мікроскопом.

Ідентифікацію кріоконсервованих клітин ембріональної печінки (ККЕП) людини в селезінці та печінці щурів здійснювали непрямим імунофлуоресцент- ним тестом, в якому використовувались моноклональні антитіла, кон'юговані з флуоресцентним барвником СD45-FITC за допомогою люмінесцентного мікро- скопа Jenaval (Carlzeiss, Jena, Germany).

Морфологічну ідентифікацію трансплантованих Гц у місці введення - селезінці - здійснювали за наявністю в клітинах глікогену [Пірс Є., 1962].

Одержані результати обробляли статистично на персональному комп'ютері за допомогою пакету програм Excel i Statistica. Для визначення достовірності розбіжностей використовували параметричний метод статистичного аналізу (t - критерій Ст'юдента) або непараметричний - Манна-Уітні.

Результати досліджень та їх обговорення

Вплив гіпотермічного зберігання на здатність гепатоцитів стимулювати процеси регенерації у частково гепатектомованих щурів. Життєздатність свіжоізольованих гепатоцитів (сГц) складала 861,0%. Гіпотермічне зберігання у сахарозомісткому розчині (СМР) при 4С приводило до незначного зниження життєздатності через 24 години до 803,0%, через 48 - до 773,5%. Свіжоізольовані і консервовані гепатоцити через три доби після трансплантації були ідентифіковані у селезінці реципієнта. Виявлені гепатоцити відрізнялися від довколишнього оточення розмірами, формою та наявністю глікогену. Ніяких інших розбіжностей у морфології селезінки контрольних та дослідних тварин ретельний аналіз не виявив.

Введення частково гепатектомованим (ЧГЕ) щурам свіжоізольованих гепатоцитів сприяло відновленню маси печінки (рис. 1): на третю добу у частково гепатектомованих щурів вона становила 3,2±0,2 г, після трансплантації свіжоізольованих гепатоцитів 4,4±0,1 г, що складає 61 і 84% від маси інтактного органа, відповідно. Гіпотермічне зберігання не впливало на здатність гепатоцитів прискорювати процес відновлення печінки. Після трансплантації гепатоцитів, консервованих протягом 48 годин, маса печінка щурів становила 3,8±0,3 г (рис. 1).

Часткова гепатектомія призводила до пригнічення детоксикаційної функції печінки, про що свідчить уповільнення метаболізму ксенобіотика гексенала - тривалість гексеналового сну у частково гепатектомованих щурів у три рази перевищувала цей показник відносно інтактних тварин протягом всього експерименту (рис. 2).

Трансплантація гепатоцитів незалежно від строку їх гіпотермічного зберігання забезпечувала значне скорочення гексеналового сну у частково гепатектомованих щурів. Привертає увагу той факт, що значне зниження тривалості сну спостерігалося вже на першу добу після трансплантації гепатоцитів, що може свідчити про органозамісну дію трансплантата.

Вміст загального білірубіну в сироватці крові щурів після часткової гепатектомії знижувався протягом трьох діб спостереження - з 72% на першу добу до 53% на третю (табл. 1). Після трансплантації свіжоізольованих гепатоцитів та гепатоцитів, які зберігалися протягом 24-х годин, зменшений рівень білірубіну реєструвався тільки на першу добу спостереження, після чого він підвищувався до рівня інтактних тварин. Можна зробити висновок, що трансплантація диференційованих клітин відновлює нормальний обмін порфіринів у ЧГЕ щурів. У випадку введення гепатоцитів термін гіпотермічного зберігання яких складав 48 годин, нормалізація сироваткового вмісту білірубіну реєструвалася пізніше на третю добу (табл. 1), що свідчить, з одного боку, про те, що трансплантат таки зазнає деяких змін під час гіпотермічного зберігання, а з другого боку, що зміни ці неглибокі або поворотні.

Таблиця 1

Показники периферичної крові щурів після часткової гепатектомії та трансплантації диференційованих гепатоцитів (М±m, n=10)

	Строки	Показники
Групи тварин		експерименту,	Еритроцити,	Лейкоцити,	Білірубін,
		доба	x1012/л	X109/л		мкмоль/л
Інтактні щури			7,50,2	9,40,5	12,91,2
Контрольні	1	5,40,5 *	16,11,2 *	9,40,6*
щури (ЧГЕ)	2	3,70,1 *	25,91,4 *	8,41,6*
		3	4,00,1 *	19,61,7 *	6,81,0*
ЧГЕ щури з	1	5,01,0 *	14,60,7 *	7,32,2*
трансплантацією сГц	2	3,80,1 *	14,01,4 *§	12,4±1,3
		3	3,60,3 *	15,02,8 *	11,51,8§
ЧГЕ щури з	1	5,80,7 *	14,71,7 *	8,92,4*
трансплантацією Гц,	2	3,90,2 *	16,41,4 *§	11,71,3
консервованих 24 год		3	4,10,2 *	16,41,6 *	15,40,9§
ЧГЕ щури з	1	5,00,7 *	14,31,1 *	7,82,2*
трансплантацією Гц,	2	4,10,5 *	15,00,6 *§	7,61,8*

Примітки: § p<0,05 - відносно контрольних щурів;

* p<0,05 - відносно інтактних щурів.

Вміст альбуміну в сироватці периферичної крові щурів після 70%-ової гепатектомії і трансплантації свіжоізольованих та консервованих гепатоцитів не змінювався протягом експерименту. Досить тривалий період півжиття альбуміну та його великий вміст в сироватці крові забезпечує повільні зміни концентрації альбуміну навіть при гострих порушеннях функцій печінки і, як наслідок, сталість цього показника при нашому короткому терміні експерименту [Tian X. et al., 1997].

Аналіз гістологічних препаратів печінки, фарбованих на глікоген, показав, що у клітинах печінки, яка регенерувала після часткової резекції, вміст цього вуглеводу зменшений (2,620,3 у.о. при нормі 4,00,1 у.о.). Після трансплантації гепатоцитів було відзначено повне відновлення цього органоспецифічного показника при відсутності інших відмінностей від контролю.

Метаболічні зміни, які відбуваються в органі під час регенерації, залежать від загальних реакцій організму на пошкодження, зумовлених гуморальними та іншими чинниками. Враховуючи цей аспект, були вивчені деякі показники системи крові частково гепатектомованих щурів.

Встановлено, що кількість еритроцитів у периферичній крові ЧГЕ щурів після операції поступово знижувалася, що пов'язано як з крововтратою, так і з гемолітичною ситуацією в крові внаслідок операції. Трансплантація гепатоцитів не впливала на цей процес (див. табл. 1).

Відомо, що у процесах регенерації та реакції організму на трансплантат важливе значення мають лейкоцити периферичної крові [Бабаєва А. Г., 1999; Маянский Д. Н., 1998]. Визначення вмісту лейкоцитів у частково гепатектомованих щурів виявило лейкоцитоз протягом усього періоду спостереження (три доби) з максимумом на другу добу. Після трансплантації свіжоізольованих та консервованих гепатоцитів динаміка лейкоцитозу змінювалась він носив більш помірний характер, і коливань його зареєстровано не було (див. табл. 1). Це свідчить про те, що після трансплантації ізольованих гепатоцитів процеси деструкції менш виражені у ЧГЕ щурів.

Отримані результати встановили, що трансплантація гепатоцитів прискорює регенерацію печінки після часткової гепатектомії. Ефект трансплантації реалізується як через органозамісну дію, так і більш генералізованим шляхом, про що свідчить також менш виражений характер лейкоцитозу.

Консервування гепатоцитів за гіпотермічних умов у СМР дозволяє зберігати не тільки цілісність клітин, але й їхні властивості як трансплантата, протягом принаймні 48 годин.

Регенераторні процеси у частково гепатектомованих щурів після трансплантації кріоконсервованих клітин ембріональної печінки. Клітини ембріональної печінки людини після кріоконсервування за трьохетапною програмою заморожування у сахарозному середовищі з 5% ДМСО мали життєздатність не нижче 50%.

Трансплантація суспензії ККЕП щурам з 70%-вою гепатектомією призводила до збільшення маси печінки на третю добу до 3,90,1 г, що значно перевищувало відновлення маси органа у контрольних тварин та відповідала ступеню регенерації печінки після трансплантації гепатоцитів.

Через три доби після введення ККЕП вони визначалися за допомогою моноклональних антитіл не тільки у селезінці реципієнта, але й у печінці. Таким чином, трансплантовані ККЕП мігрують до органа-мішені частково гепатектомованих щурів - печінки.

Введення ККЕП приводило до значних змін тривалості гексеналового сну у ЧГЕ щурів (рис. 3), динаміка якої різко відрізнялася від картини впливу диференційованих гепатоцитів. Скорочення гексеналового сну після трансплантації ККЕП спостерігалося, починаючи з другої доби, а на кінець експерименту мала місце повна нормалізація цього показника, чого не відзначалося після трансплантації Гц (див. рис. 2). ККЕП, на відміну від гепатоцитів, очевидно, не можуть безпосередньо впливати на метаболізм ксенобіотика гексеналу в обраний термін спостереження, тому що представлені головним чином клітинами кровотворного ряду і містять невелику кількість лише попередників гепатоцитів [Alison M., 1998; Shafritz D., 2000]. Таким чином, прискорення метаболізму гексеналу забезпечується виключно відновленою детоксикаційною функцією печінки реципієнта, яка регенерує після часткової гепатектомії.

Для підтвердження стимуляції з боку ККЕП відновлення детоксикаційної функції печінки вивчався пептидний спектр сироватки крові щурів. Після ЧГЕ в сироватці крові щурів у діапазоні від 7500 до 1900 Да, окрім семи головних фракцій, реєструвалися нові фракції пептидів від А до А5 (75005300 Да) та D (3200 Да), спостерігалося збільшення фракцій В1 (3900 Да), С (3600 Да), F (2400 Да) і зменшення фракції G (1900 Да) (рис. 4).

Ці зміни викликані, очевидно, з одного боку, протіканням деструктивних процесів після пошкодження печінки, а з другого боку, пов'язані з обмеженою

детоксикаційною функцією печінки, внаслідок чого в плазмі крові накопичуються пептиди, що відсутні у інтактних тварин. Після трансплантації

ККЕП ЧГЕ щурам реєструвалась нова фракція Е (3000 Да) та зниження вмісту фракцій В1 і С. На третю добу спостереження відмічалося також різке збільшення фракції А на фоні відсутності фракцій А4 і А1.

Додатковий експеримент щодо введення кріоконсервованих клітин ембріональної печінки інтактним тваринам показав, що тільки виникнення низькомолекулярного пептиду Е є наслідком введення середніх молекул зі складом трансплантата. Інші зміни пептидного спектра у дослідної групи тварин відтворюють вплив ККЕП на організм реципієнта. Слід зазначити, що введення ККЕП нормалізує саме ті пептидні фракції, які зазнали найбільших змін внаслідок ЧГЕ, що свідчить на користь зробленого раніше висновку про стимуляцію відновлення детоксикаційної функції.

Позитивний вплив ККЕП на відновлення органоспецифічних функцій печінки після часткової резекції був відмічений також при визначенні протромбінового часу (ПЧ), подовження якого пов'язують з недостатністю плазматичних факторів білкової природи, які синтезуються печінкою

[Козінець Г. І., 1998]. У ЧГЕ щурів спостерігалося значне збільшення цього показника на першу добу дослідження (табл. 2), а трансплантація ККЕП запобігала такому збільшенню.

Таблиця 2

Показники периферичної крові частково гепатектомованих щурів (M±m, n=15-20).

Показники				Групи	тварин
периферичної	Інтактні		Контрольні		ЧГЕ+ККЕП
крові щурів		Строки експерименту, доба	Строки експерименту, доба
		1	2	3	1	2	3
Еритроцити	,
x1012/л	7,5±0,2	5,4±0,5*	3,7±0,1*	4,0±0,1*	5,6±0,2*	6,8±0,2§	3,7±0,1*
Лейкоцити,
x109/л	9,4±0,5	16,1±1,2*	25,9±1,4*	19,6±1,7*	11,8±1,4*§	27,0±2,2*	10,1±1,0§
Загальний
Hb, мг/мл	60,2±1,7	48,4±3,9*	42,5±3,4*	37,2±1,7*	69,6±4,4§	54,2±3,6§	40,1±2,8*
Фетальний
Hb, мг/мл		7,7 ± 1,7	10,7 ± 0,8	8,4 ± 1,6	12,3±1,4*	43,8±2,1*§	20,4±1,2§*	14,7±2,3*
Загальний білок, г/л	61,0±2,0	39,0±3,2*	38,0±1,0*	43,03,6*	38,0±2,5*	41,0±5,0*	58,0±2,0§
Білірубін, мкмоль/л	12,91,2	9,40,6*	8,41,6*	6,81,0*	11,71,0	29,13,6*§	8,31,1*
ПЧ, хв	24,0±0,7	44,5±2,5*	26,8±2,9	20,8±1,5	27,4±1,8§	20,9±1,8	23,5±1,2

Примітки: § р0,05 відносно контрольного рівня;

* р0,05 відносно інтактних щурів.

Гістологічний аналіз препаратів печінки на вміст глікогену встановив нормалізацію цього показника у ЧГЕ щурів після трансплантації кріоконсервованих клітин ембріональної печінки, що також свідчить про скоріше відновлення органоспецифічних функцій печінки.

Рівень загального білірубіну, як зазначалося раніше, у частково гепатектомованих тварин протягом експерименту знижувався. Трансплантація кріоконсервованих клітин ембріональної печінки на відміну від гепатоцитів приводила до значного збільшення вмісту цього метаболіту в сироватці крові ЧГЕ щурів на другу добу дослідження (див. табл. 2). На наш погляд, головним джерелом такого підвищення білірубіну є гемоглобін уведених клітин ембріональної печінки. При терміні гестації 7-12 тижнів печінка здійснює в організмі кровотворну функцію, тому суспензія кріоконсервованих клітин ембріональної печінки здебільшого містить клітини еритроїдного ряду

[Грищенко В. І., та ін., 1988].

Гемопоетичний характер ККЕП зумовлює також те, що на другу добу після введення кріоконсервованих клітин ембріональної печінки реєструється значне збільшення вмісту еритроцитів у периферичній крові частково гепатектомованих щурів (див. табл. 2). З одного боку, наявність в трансплантаті великої кількості глікофорин-А-позитивних клітин забезпечує додаткову кількість еритроцитів у периферичному руслі піддослідних щурів [Tarasov A.I. et al., 2002], а з другого боку, гемопоетичні чинники трансплантата впливають на еритропоез реципієнта. Підтвердження реалізації обох механізмів було отримане в серії експериментів, коли частково гепатектомованим щурам вводили кріоконсервовані клітини ембріональної печінки, піддані багаторазовому швидкому заморожуванню-швидкому відігріву. Життєздатність такої суспензії ККЕП становила близько 0%, що виключає дію першого механізму при збереженні у повній мірі реалізації другого. Кількість еритроцитів у тварин цієї групи протягом усього періоду спостереження була 5,6-5,91012/л, що займає проміжне значення між контрольними і частково гепатектомованими щурами з трансплантацією кріоконсервованих клітин ембріональної печінки. Про стимуляцію еритропоезу свідчить також збільшена кількість еритроцитів у кров'яному руслі щурів у більш віддалені строки спостереження (через тиждень). Слід зазначити, що збільшення числа еритроцитів реципієнта також може вносити свій вклад у підвищення рівня білірубіну у тварин дослідної групи.

Наявність двох складових дії кріоконсервованих клітин ембріональної печінки підтверджують дані щодо фетального гемоглобіну. Весь гемоглобін кріоконсервованих клітин ембріональної печінки є фетальним [Gurmit S., 2000; Marcus O., 2001], тоді як у нормі у дорослих тварин він складає декілька відсотків, але значно збільшується при різних гіпоксичних станах. Після часткової гепатектомії на третю добу спостереження було зареєстровано підвищення вмісту фетального гемоглобіну як розвиток компенсаторної реакції організму (див. табл. 2). Трансплантація кріоконсервованих клітин ембріональної печінки призводила до значного підвищення цього показника в ранній термін експерименту з поступовим зниженням його до рівня контрольних частково гепатектомованих щурів на кінець експерименту.

Вміст загального гемоглобіну після 70%-ової гепатектомії протягом експерименту знижувався відповідно зменшенню кількості еритроцитів (див. табл. 2). Після трансплантації кріоконсервованих клітин ембріональної печінки рівень загального гемоглобіну перевищував значення частково гепатектомованих щурів на першу і другу добу спостереження, що відбиває збільшення на цей час рівня фетального гемоглобіну в периферичній крові експериментальних щурів.

Вивчення іншого показника периферичної крові - вмісту лейкоцитів - дає додаткове підтвердження впливу кріоконсервованих клітин ембріональної печінки на організм в цілому. Як видно з табл. 2, трансплантація ККЕП нормалізує на третю добу експерименту підвищений, внаслідок часткової гепатектомії, рівень лейкоцитів у периферичній крові щурів. У той же строк спостереження нормалізувався інший генералізований показник - вміст загального білка в сироватці крові, який після часткової гепатектомії був знижений відносно норми (див. табл. 2). Таким чином, дія трансплантованих гемопоетичних клітин ембріональної печінки не обмежується червоним ростком крові, а здійснює генералізований вплив на весь організм.

Результати роботи свідчать про те, що трансплантація диференційованих алогенних гепатоцитів та ембріональних ксеногенних кріоконсервованих клітин ембріональної печінки чинить односпрямовану дію - стимулює регенерацію печінки у щурів після 70%-ової гепатектомії. Однак механізми реалізації такої дії внаслідок неоднакової за рівнем диференційованості клітин різні. Трансплантовані гепатоцити здійснюють органозамісну функцію, що, як встановлено, сприяє регенерації печінки. Їх дія на метаболізм ксенобіотика проявляється вже через добу після трансплантації, однак нормалізації детоксикаційної функції протягом експерименту зареєстровано не було. Слід зазначити, що гіпотермічне зберігання гепатоцитів протягом двох діб у сахарозомісткому розчині при 4?С не суттєво впливало на здатність гепатоцитів після трансплантації стимулювати регенерацію печінки у ЧГЕ щурів.

Позитивний вплив трансплантації ККЕП на процеси відновлення регенеруючої печінки у частково гепатектомованих щурів відбувався на організменому рівні за участю функціональних систем, зокрема системи гемопоезу.

ВИСНОВКИ

1. Дисертація присвячена вирішенню актуальної наукової задачі по з'ясуванню біологічної дії трансплантації ембріональних і диференційованих клітин печінки, які зазнали впливу низьких температур, на процеси регенерації печінки після часткової гепатектомії. Вперше проведена оцінка морфологічних і функціональних особливостей печінки, що регенерує, та показників периферичної крові частково гепатектомованих щурів у ранні строки (перші три доби) після трансплантації в селезінку кріоконсервованих клітин ембріональної печінки людини або гепатоцитів щурів після гіпотермічного зберігання і встановлена здатність деконсервованих клітин ембріональної печінки та гепатоцитів прискорювати регенерацію печінки після часткової гепатектомії.

2. Свіжоізольовані та консервовані при 4С у сахарозомісткому розчині гепатоцити за морфологією та специфічним фарбуванням на глікоген були ідентифіковані в селезінці частково гепатектомованих щурів на третю добу після трансплантації.

3. Гіпотермічне зберігання гепатоцитів у сахарозомісткому розчині при 4С протягом двох діб незначно впливає на морфологічний стан клітин in vitro та на їх здатність стимулювати регенераторні процеси в печінці при трансплантації частково гепатектомованим щурам.

4. Трансплантація свіжоізольованих та деконсервованих гепатоцитів вже на першу добу приводить до значного скорочення тривалості гексеналового сну, подовженого у частково гепатектомованих щурів внаслідок обмеженості детоксикаційної функції печінки. Окрім органозамісної дії, введення гепатоцитів стимулює відновлення маси та морфологічних характеристик печінки, знижує рівень лейкоцитозу, нормалізує вміст загального білірубіну у щурів після 70%-ової гепатектомії.

5. Трансплантація кріоконсервованих клітин ембріональної печінки викликає підвищення рівня фетального та загального гемоглобіну у частково гепатектомованих щурів, а також збільшує кількість еритроцитів та нормалізує рівень лейкоцитів, тривалість протромбінового часу та вміст загального білка в сироватці крові щурів після часткової гепатектомії. За допомогою видоспецифічних моноклональних антитіл через три доби після трансплантації клітини ембріональної печінки людини були ідентифіковані в селезінці та печінці частково гепатектомованих щурів.

6. Трансплантація кріоконсервованих клітин ембріональної печінки частково гепатектомованим щурам сприяє відновленню маси печінки, вмісту глікогену в гепатоцитах, детоксикаційної функції, яка оцінювалась за швидкістю метаболізму ксенобіотика гексеналу та вмісту середніх молекул у сироватці крові щурів.

ПЕРЕЛІК ОПУБЛІКОВАНИХ РОБІТ

1. Петренко А. Ю., Росляков А. Д., Оченашко О. В., Моисеева Н. Н. О значении перекисных процессов в гибели криоконсервированных гепатоцитов, выделенных из сытых и голодных крыс // Пробл. криобиологии. - 1999. - №1. - С. 19-25. (Дисертантом досліджена життєздатність гепатоцитів щурів.)

2. Моисеева Н. Н., Мазур С. П., Оченашко О. В., Петренко А. Ю. Влияние трансплантации криоконсервированных клеток фетальной печени человека на регенерацию и функции печени крыс после частичной гепатэктомии // Пробл. криобиологии. -2001. - №1. - С. 42-47. (Дисертантом досліджена детоксикаційна функція печінки та динаміка вмісту еритроцитів у периферичній крові ЧГЕ щурів після трансплантації ККЕП).

3. Моиcеева Н. Н., Кравченко Л. П., Семенченко О. А., Петренко А. Ю. Влияние трансплантации гепатоцитов, подвергнутых гипотермическому хранению, на регенерацию печени крыс после частичной гепатэктомии // Пробл. криобиологии. - 2002. - №1. - С. 24-31. (Дисертантом проводилися експерименти щодо визначення маси та ступеню регенерації печінки, стану її детоксикаційної функції, вмісту загального білірубіну, альбуміну, еритроцитів і лейкоцитів у периферичній крові тварин після трансплантації гепатоцитів ЧГЕ щурам. У селезінці експериментальних тварин ідентифіковано повноцінний клітинний трансплантат).

4. Моисеева Н. Н., Мазур С. П., Петренко А. Ю. Показатели периферической крови и регенерация печени крыс после гепатэктомии и трансплантации дифференцированных и эмбриональных клеток печени // Пробл. криобиологии. - 2002. - №2. - С. 20-23. (Дисертантом досліджена маса печінки, показники периферичної крові, морфологічний стан селезінки у контрольних щурів і ЧГЕ щурів з трансплантацією ККЕП).

5. Моисеева Н. Н., Розанова Е. Д., Мазур С. П., Петренко А. Ю. Некоторые показатели системы эритропоэза крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации криоконсервированных клеток эмбриональной печени // Пробл. криобиологии. - 2002. - №4. - С. 72-75. (Дисертантом вивчено вміст фетального та загального гемоглобіну у периферичній крові ЧГЕ щурів після трансплантації ККЕП. За допомогою моноклональних антитіл трансплантат ідентифіковано в селезінці та печінці реципієнта).

6. Грищенко В.И., Моисеева Н.Н., Герасимова И.Г., Петренко А.Ю. Трансплантация аллогенных гепатоцитов взрослых крыс и криоконсервированных клеток эмбриональной печени человека гепатэктомированным крысам // Актуальные вопр. репродуктологии и криомедицины: Сб. науч. тр. - Х., 1998. - С. 193-198. (Дисертантом досліджено вплив сумісної та роздільної трансплантації свіжоізольованих гепатоцитів і кріоконсервованих клітин ембріональної печінки на відновлення маси печінки у ЧГЕ щурів).

7. Петренко О. Ю. Мазур С. П., Моісєєва Н. М., Оченашко О. В. Вивчення можливостей використання трансплантації клітин фетальної печінки при лікуванні гострої печінкової недостатності // Трансплантологія. - 2000. - Т. 1. -№1. - С. 276-277 ( Дисертантом досліджено детоксикаційну функцію печінки та деякі показники периферичної крові частково гепатектомованих щурів після трансплантації кріоконсервованих клітин ембріональної печінки людини).

8. Моисеева Н. Н., Петренко А. Ю. Изучение показателей периферической крови крыс после трансплантации эмбриональных клеток печени на фоне частичной гепатэктомии // Зб. тез конф. мол. вчен. Харк. держ. мед. ун-ту. - Ч.1 - Х., 2001. - С. 25.

9. Моисеева Н. Н., Семенченко А. Ю., Петренко А. Ю. Изменение пептидного состава сыворотки крыс после трансплантации криоконсервированных клеток эмбриональной печени // Тр. науч. конф., посвященной 100-летию со дня рождения акад. И. Н. Буланкина. - Х., 2001. - С. 64-65.

10. Моисеева Н. Н., Петренко А. Ю., Кравченко Л. П. Влияние гипотермического хранения изолированных гепатоцитов на эффективность трансплантации частично гепатэктомированным крысам // Пробл. криобиологии. - 2001.- №3. - С. 35-36.

11. Петренко А. Ю., Оченашко О. В., Моисеева Н. Н., Скоробогатова Н. Г. Функция криоконсервированных клеток эмбриональной печени в системе in vitro и при экспериментальной трансплантации // Пробл. криобиологии. - 2001.- №3. - С. 34-35.

12. Petrenko A. Yu, Tarasov A. I., Sukach A. N., Masur S. P., Grishuk V. P., Moiseyeva N. N., Ochenashko O. V. and Skorobogatova N. G. Cryopreservation effect on the integrity and functional activity of emryonic liver stem cells // Cryobiology. - 2001. - Vol. 4, № 43. - P. 387-388.

АНОТАЦІЇ

Моисеева Н.Н. Регенерация печени крыс после частичной гепатэктомии и трансплантации эмбриональных и дифференцированных клеток печени, подвергнутых действию низких температур. - Рукопись.

Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.19-криобиология. - Институт проблем криобиологии и криомедицины НАН Украины, Харьков, 2003 г.

Диссертационная работа посвящена изучению регенерации печени крыс после частичной гепатэктомии с последующей трансплантацией дифференцированных гепатоцитов, подвергнутых гипотермическому хранению (4С) в сахарозосодержащей среде на протяжении 2-х суток или криоконсервированных клеток эмбриональной печени.

Гипотермическое хранение гепатоцитов при 4С в сахарозосодержащей среде на протяжении 2-х суток не приводило к значимому снижению жизнеспособности клеток, сохраняло их способность влиять на регенерацию печени после удаления 70% её массы. Как свежевыделенные, так и подвергнутые гипотермическому хранению донорские гепатоциты были выявлены с помощью окрашивания на гликоген в селезёнке реципиента на 3-и сутки после трансплантации.

Трансплантация гепатоцитов в селезёнку крыс, перенесших частичную гепатэктомию, способствовала ускорению процессов восстановления массы регенерирующей печени и нормализации уровня гликогена в печёночных клетках реципиента, что может быть расценено как стимулирующее действие клеточного трансплантата. Введение гепатоцитов приводило к сокращению продолжительности гексеналового сна уже в ранний послеоперационный период (начиная с первых суток после трансплантации), что свидетельствует об участии трансплантата в осуществлении детоксикационной функции печени и может рассматриваться как один из путей реализации заместительного действия трансплантата.

Положительное влияние трансплантации гепатоцитов проявлялось в нормализации уровня билирубина и снижении лейкоцитоза у крыс, вызванного операцией. Концентрация эритроцитов и альбумина в периферической крови частично гепатэктомированных крыс не изменялась.

Трансплантация криоконсервированных клеток эмбриональной печени также приводила к ускоренному восстановлению массы печени, увеличению содержания гликогена в гепатоцитах реципиента и нормализации детоксикационной функции печени, оцененной по скорости метаболизма ксенобиотика и содержанию средних молекул в сыворотке крови.

Введение криоконсервированных клеток эмбриональной печени оказывало позитивное влияние на показатели периферической крови: нормализовало протромбиновое время, содержание общего белка, количество лейкоцитов и способствовало увеличению концентрации эритроцитов, общего и фетального гемоглобина у частично гепатэктомированных крыс, что может быть связано с выраженным биологическим действием криоконсервированных клеток эмбриональной печени на целостный организм. Спустя 3-е суток после трансплантации криоконсервированные клетки эмбриональной печени человека были идентифицированы в селезёнке и печени реципиента с помощью иммунофлуоресцентного теста.

Полученные результаты работы указывают на позитивный эффект как дифференцированных печёночных клеток после гипотермического хранения, так и криоконсервированных клеток эмбриональной печени при трансплантации частично гепатэктомированным животным. При этом выявлены особенности действия in vivo обоих видов консервированных клеточных трансплантатов, связанные со степенью дифференцированности вводимых клеточных суспензий.

Ключевые слова: гепатоциты, гипотермическое хранение, криоконсервированные клетки эмбриональной печени человека, регенерация печени, частичная гепатэктомия.

Моісєєва Н.М. Регенерація печінки щурів після часткової гепатектомії та трансплантації ембріональних і диференційованих клітин печінки, які зазнали впливу низьких температур - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.19 - кріобіологія. - Інститут проблем кріобіології і кріомедицини НАН України, Харків, 2003 р.

Дисертація присвячена вивченню регенерації печінки щурів після часткової гепатектомії і трансплантації гепатоцитів, підданих гіпотермічному зберіганню у сахарозомісткому розчині при 4 С протягом двох діб та кріоконсервованих клітин ембріональної печінки.

Встановлено, що трансплантація гепатоцитів як свіжо ізольованих, так і після гіпотермічного зберігання призводила до відновлення маси печінки, збільшення вмісту глікогену в гепатоцитах, значного скорочення гексеналового сну, нормалізації вмісту загального білірубіну, зменшення кількості лейкоцитів у периферичній крові частково гепатектомованих щурів.

Введення кріоконсервованих клітин ембріональної печінки сприяло відновленню маси печінки, збільшенню вмісту глікогенУ в гепатоцитах, нормалізацїї детоксикаційної функції, дослідженої за тривалістю гексеналового сну і рівнем середніх молекул в сироватці крові частково гепатектомованих щурів. Встановлено позитивний вплив кріоконсервованих клітин ембріональної печінки на показники периферичної крові за збільшенням кількості еритроцитів, вмісту загального та фетального гемоглобіну, нормалізації протромбінового часу, вмісту загального білка і кількості лейкоцитів.

Гіпотермічне зберігання гепатоцитів у сахарозомісткому розчині при 4 С не впливало на їхню здатність стимулювати відновлення печінки у частково гепатектомованих щурів.

Ключові слова: гепатоцити, гіпотермічне зберігання, кріоконсервовані клітини ембріональної печінки, регенерація печінки, часткова гепатектомія.

Moiseeva N.M. Rat liver regeneration following partial hepatectomy and transplantation of embryonic and differentiated cells under low temperature effect.- manuscript.

Thesis for candidate's degree obtaining (PhD equivalent, biology) on the specialty 03.00.19 - cryobiology.- Institute for Problems of Cryobiology and Cryomedicine of the National Academy of Sciences of Ukraine, Kharkov, 2003.

Thesis is dedicaded to studying the effect of freshly isolated hepatocytes and the ones following hypothermic storage under sucrose-based solution at 4C within 2 days and cryopreserved human embryonic hepatic cells on liver regeneration in partially hepatectomised rats.

It was established that transplantation of hepatocytes both freshly isolated and after hypothermic storage resulted in liver mass renewal, augmentation of glycogen content in hepatocytes, significant shortening of a hexenal sleep, promoted normalization of total bilirubin content, reduction of leukocytes number in peripheral blood of partially hepatectomised rats.

Transplantation of cryopreserved embryonic liver cells resulted in the recovery of liver mass, rise of glycogen content in hepatocytes, normalization of detoxicational function, studied by the hexenal sleep duration and the level of average molecules in blood serum of partially hepatectomised rats. There has been noted a positive effect of cryopreserved embryonic liver cells on peripheric blood indices (increase of red cells number, total and fetal haemoglobin content, normalization of prothrombin time, total protein and leukocytes number).

Hepatocytes hypothermic storage in sucrose-based solution under 4C did not affect their capability of stimulating liver regeneration in partially hepatectomised rats.

Key words: hepatocytes, hypothermic storage, cryopreserved embryonic liver cells, liver regeneration, partial hepatectomy.

Размещено на Allbest.ru