Особливості впливу вакцин, виготовлених на основі пухлинних клітин за різними технологіями, на специфічні і неспецифічні реакції протипухлинного імунітету (експериментальні дослідження)

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність проблеми. Недостатня ефективність хірургічного втручання, хіміо- та променевої терапії спонукали до активного пошуку додаткових підходів до лікування хворих онкологічного профілю. Одним з таких підходів є імунотерапія пухлин, в тому числі вакцинотерапія (З.Г. Кадагидзе, 1998; В.М. Моисеенко, 2001; Г.П. Потебня та ін., 2001; А.Ю. Барышников, 2002; S.A. Rosenberg, 1996; R.G. Fenton et al., 1997; D. Berd, 1998; P.J. Mosca et al., 2001). На сьогодні вже ідентифіковано цілу низку антигенів (АГ) пухлин, що відрізняються від АГ нормальних тканин та властиві меланомі, карциномі органів шлунково-кишкового тракту, раку сечового міхура, передміхурової залози, молочної залози, саркомам, нейробластомі, гліобластомі (Г.И. Абелев, 2000; P. Van der Bruggen et al., 1991; S.A. Rosenberg, 1996; S. Zhang et al., 1997; H. Matsumoto et al., 1998; H. Horig et al., 1999; K. Watari et al., 2000; P. Brossart et al., 2001), на основі яких створюються протипухлинні вакцини (ПВ) (А.Д.М. ван ден Ээртвег и др., 1999; В.О. Шляховенко та ін., 2001; D. Chan Arden et al., 1998; D. Berd, 1998; S. Khleif, 1999). Поряд з розробкою ПВ за допомогою сучасних методів генної та клітинної інженерії, пептидних ПВ, ПВ на основі амінокислотних послідовностей, дендритних клітин перспективним напрямком досліджень продовжує залишатись створення поліклональних ПВ (на основі пухлинних клітин), які містять весь спектр притаманних конкретній пухлині АГ. Більш того, за результатами клінічних випробовувань ряд дослідників висловлює думку, що саме такі ПВ можуть бути найбільш адекватними для індивідуалізованої імунотерапії хворих, незалежно від виду злоякісної пухлини (А.Д.М. ван ден Ээртвег и др., 1999; Г.П. Потебня та ін., 2001; R. Repmann et al., 1997; D. Berd et al., 1998; R. Soiffer et al., 1998; S. Nawroccki et al., 1999; J.B. Vermorken et al., 1999; J.E. Harris et al., 2000).

Низька імуногенність багатьох пухлинних АГ, а також наявність в організмі зі злоякісною пухлиною цілої низки порушень регуляторних і ефекторних реакцій імунної системи зумовлюють необхідність додаткового використання при вакцинотерапії ад'ювантних і імунокорегуючих засобів, що складає важливий аспект означеної проблеми. Одним із можливих, але ще мало розроблених підходів до підвищення ефективності ПВ є застосування в технології їх виготовлення, а також в якості ад'ювантів імунотропних речовин мікробного походження, вплив яких на організм реалізується через активацію продукції моноцитарними клітинами ряду цитокинів, які в подальшому корегують і підвищують формування специфічних імунних реакцій (Р.М. Хаитов и др., 1995). Отже, дослідження можливості використання таких речовин в технологіях виготовлення ПВ не втрачають своєї актуальності, не зважаючи на появу ПВ, що розроблені за допомогою трансфікування в пухлинні клітини генів цитокинів, генів, що кодують експресію чужорідних білків; конструкції ф'южерних білків, до складу яких входять суперантигени, рецептори цитокинів, варіабельні ланцюги відповідних моноклональних антитіл (А.Ю. Барышников, 2002).

Надзвичайно важливим і найменш розробленим є питання надійної оцінки клінічної ефективності ПВ (Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун, 2003). Класичний підхід до його вирішення - рандомізовані клінічні випробовування - потребує значного часу і ресурсів (Е.А. Колесник и др., 1999; Г.П. Потебня и др., 2000; P.J. Mosca et al., 2001). В той же час, альтернативним і вже традиційним засобом оцінки ефективності ПВ є вивчення показників протипухлинного антигенспецифічного Т-клітинного імунітету (З.Г. Кадагидзе, 1998; Г.И. Дейчман, 2000; P.J. Mosca et al., 2001). Прогностична цінність змін при вакцинації показників природньої резистентності, а також продукції цитокинів (інтерлейкинів, інтерферонів, ФНП-альфа, тощо) досліджена значно меншою мірою. Більш того, є відомості, що ефекторні клітини, які активно продукують цитокини, можуть бути не здатними до лізісу клітин-мішеней (M. Vitale et al., 1998; A. Cerwenca et al., 2001; L. Moretta et al., 2002).

Науковцями ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України розроблені три технології виготовлення ПВ: 1) на основі клітин аутологічної пухлини з використанням фільтрату культуральної рідини (ФКР) B. subtilis (за старою номенклатурою - Bac. masentericus) AB-56 (Д.Г. Затула та ін., 1982), 2) на основі цих же клітин з використанням цитотоксичного лектину (ЦЛ), виділеного з цього ФКР (Г.П. Потебня та ін., 2001), 3) шляхом контрольованого ферментативного гідролізу - глікопептидна ПВ (В.О. Шляховенко та ін., 2000). Перша з означених ПВ успішно випробувана і виявилась ефективною в лікуванні хворих на колоректальний рак або немілкоклітинний рак легені, але залишились недостатньо вивченими питання її впливу на механізми природньої протипухлинної резистентності, на продукцію основних цитокинів, що приймають участь у формуванні адаптивного імунітету. Для двох інших ПВ показана ефективність лише в модельних експериментах, а механізми їх протипухлинної та антиметастатичної активності не були досліджені зовсім. Щодо показників для імунологічного моніторингу, то це питання залишалось відкритим для всіх трьох вакцин, незважаючи на його надзвичайну актуальність: адже згаданий моніторинг відкрив би перспективу лабораторної оцінки ефективності вакцинації, що в свою чергу, дозволило б прогнозувати клінічну ефективність ПВ.

Мета дослідження. Порівняльне вивчення впливу протипухлинних вакцин, виготовлених на основі пухлинних клітин за різними технологіями, на неспецифічні і адаптивні реакції протипухлинного імунітету тварин з модельним пухлинним процесом і обґрунтування на цій основі можливості використання імунологічних показників для прогнозу ефективності вакцинації.

Задачі дослідження.

1. Визначити протипухлинну і антиметастатичну ефективність досліджуваних вакцин на моделі карциноми легені Льюїс при застосуванні різних схем вакцинації.

2. Провести порівняльне вивчення впливу досліджуваних вакцин на специфічні і неспецифічні протипухлинні реакції лімфоїдної ланки системи імунітету та на різні прояви функціональної активності моноцитів/макрофагів в динаміці пухлинного процесу.

3. Дослідити вплив ПВ, застосованих за різними схемами, на динаміку продукції деяких цитокинів (ФНП, ІЛ-1, ІЛ-2) та на характер дії сироватки крові вакцинованих тварин на аутологічні природні кілери (ПК) і макрофаги (МФ).

4. Охарактеризувати та співставити вплив ЦЛ, виділених з ФКР, у якій культивується B. subtilis АБ-56 (штам B. subtilis 7025), і ПВ, виготовлених з їх використанням, на центральні і периферичні органи імунної системи та дискретні прояви функціональної активності лімфоцитів.

5. Оцінити ефективність та вплив на основні протипухлинні реакції вакцин, виготовлених з використанням ЦЛ ФКР B. subtilis 7025, в залежності від середовища культивування останньої.

1. Матеріали та методи дослідження

Репрезентовані в роботі дані одержані на експериментальному матеріалі. Дослідження проводили на мишах лінії C57Bl/6 (самки віком 2,5-3,5 міс., масою 19-21 г), які були одержані з розплідника віварію ІЕПОР НАН України. Утримання мишей та робота з ними здійснювались у відповідності до міжнародно прийнятих правил проведення робіт з експериментальними тваринами. В якості моделі пухлинного росту використовували метастазуючу карциному легені Льюїс. Для індукції пухлин клітини карциноми Льюїс (ККЛ) вводили в стопу задньої кінцівки (2,5 x 105 клітин/0,05 мл). В роботі було використано ПВ (серія ІЕПОР), що виготовлені з ККЛ з використанням ФКР В. subtilis 7025 (вакцина 1), ЦЛ В. subtilis 7025 (вакцина 2), на основі глікопептидів ККЛ (вакцина 3) співробітниками відділу ензимології (Д.Г. Затула та ін., 1982; Г.П. Потебня та ін., 2001; Г.П. Потебня та ін., 2001; В.О. Шляховенко, Г.П. Потебня, В.С. Мосієнко та ін., 2000). Вакцинування тварин проводили до прищеплення ККЛ (1-ша серія досліджень) або після оперативного видалення первинної пухлини (2-га серія). В 1-ій серії експериментів досліджувані ПВ вводили підшкірно триразово з інтервалами в 7 діб, в дозах: 0,5; 0,75 та 1 мл/мишу. На 28-у добу після останньої вакцинації тваринам дослідних груп було прищеплено ККЛ. В 2-ій серії - на 16-у добу після прищеплення ККЛ, пухлину видаляли; вакцинацію починали з 18-ї доби, вводячи ПВ 2 рази на тиждень п'ятиразово (0,3; 0,3; 0,3; 0,5; 0,5 мл/мишу, підшкірно). За аналогічною схемою проводили і досліди, спрямовані на порівняння ПВ, виготовлених з використанням ЦЛ B. subtilis 7025, в залежності від середовища культивування останньої (3-тя серія досліджень). При додатковому вивченні впливу на дискретні імунологічні показники ЦЛ B. subtilis 7025 і виготовлених за їх допомогою ПВ (4-та серія) досліджувані препарати вводили інтактним мишам в дозах 0,5; 0,75 та 1 мл/мишу з інтервалом в 7 діб. В усіх дослідах тваринам контрольної групи в режимах, аналогічних описаним вище, вводили підшкірно фізіологічний розчин хлориду натрію; крім того, враховуючи фізіологічні сезонні коливання імунологічних показників, кожного разу проводили обстеження інтактних мишей (по 5-6 тварин). Використовували схеми і дози введення ПВ або ЦЛ B. subtilis 7025, запропоновані співробітниками відділу ензимології (Н.Л. Загадарчук, 1997; О.А. Танасієнко та ін., 1999; В.О. Шляховенко та ін., 2001).

Перебіг пухлинного процесу характеризували за стандартними показниками: частота виникнення пухлин, розміри пухлинного вузла (об'єм у мм3); після операції - частота виникнення рецидивів захворювання; частота метастазування (відсоток мишей в кожній групі, які мали метастази в легенях), інтенсивність метастазування (середня кількість метастазів на одну тварину), швидкість росту метастазів (за об'ємом метастазів в мм3). Ефект використаних вакцин оцінювали за відсотком гальмування росту пухлин (ГРП) та за індексом інгібування метастазування (ІІМ) (Н.В. Чердынцева и др., 1997).

Імунологічне обстеження тварин в 1-ій серії експериментів проводили до прищеплення ККЛ, на 7- та 36-у добу пухлинного процесу; у 2-ій та 3-ій серіях - після операції (до початку вакцинації), на 38-у (7-ма доба після закінчення вакцинації) та 45-у (14-а доба після вакцинації) добу після прищеплення ККЛ; у 4-ій серії - через 3 доби після 2- та 3-го введення ЦЛ або відповідних ПВ.

Визначення клітинності тимусу (Т), селезінки (С), ПЛВ, кісткового мозку (КМ) проводили за стандартними методиками, використовуючи суправітальне фарбування трипановим синім. Клітинний склад КМ вивчали в мазках, які забарвлювали за Паппенгеймом (А.И. Воробьев, 1981); субпопуляційний склад ПЛВ - при забарвленні за Штокінгером і Келльнером (Ю.А. Уманский и др. 1975). Цитотоксичну активність ПК, ЦТЛ, МФ, ефекторів АЗКЦ, сироватки крові (СК) визначали в цитотоксичних тестах in vitro: радіометричний метод, клітини-мішені мітили 14С-гідролізатом білку або 3Н-сумішшю амінокислот (“Amersham”, Великобританія), 18,5 x 104 Бк/мл культурального середовища; співвідношення ефектори/мішені становило 50:1 або співвідношення об'єм СК/загальний об'єм проби - 1:10; термін інкубації - 12-18 год.; кожну пробу ставили в 3 паралелях (Р.А. Бурханов и др., 1984; М.П. Рыкова и др., 1981; Г. Фримель, 1987; Г.А. Белокрылов и др., 1994). Продукцію спленоцитами (неприлипаюча фракція) ІЛ-2 (без додаткової стимуляції in vitro) визначали за здатністю супернатантів (Сн) однодобових культур спленоцитів відновлювати проліферативну відповідь тимоцитів (107 кл/мл) мишей С3Н на мітоген (Кон А, “Sigma”, США, 5мкг/мл), блоковану гідрокортизоном (“Koch-Light Laboratories Ltd”, Англія, 10-6 М/мл); оцінку результатів проводили на підставі включення індикаторними клітинами 3Н-тимідіну (18,5 х 104 Бк/пробу) (Дж. Клаус, 1990). Продукцію моноцитами/макрофагами ФНП (без додаткової стимуляції in vitro, термін інкубації клітин-продуцентів 24 год) досліджували за допомогою біологічного методу з використанням ФНП-чутливої культури клітин L-929 (H. Fisch, 1983; А.Э. Медведев и др., 1992); ІЛ-1 (без додаткової стимуляції та за умов стимуляції in vitro ЛПС (“Sigma”, США, 100 мкг/мл середовища, інкубація 24 год) визначали в комітогенному тимоцитарному тесті з ФГА (“Sigma”, США, 3 мкг/мл, термін інкубації 72 год; оцінку результатів проводили на підставі включення індикаторними клітинами 3Н-тимідіну, 18,5 х 104 Бк/пробу) (Дж. Клаус, 1990). Визначення спонтанної та Кон А-індукованої антигеннеспецифічної супресорної активності лімфоцитів селезінки проводили в системі адоптивного переносу сингенним реципієнтам (В.М. Юдин и др., 1984). Аналізуючи результати імунологічного обстеження, оцінювали як абсолютні величини відповідних показників, так і індекси їх модуляції (ІМ) відносно аналогічних показників мишей контрольних груп: ІМ=[(Д-К)/К]х100%. Статистичну обробку результатів проводили з використанням t-критерію Ст'юдента, критерію Пірсона (ч2) та коефіцієнтів кореляції (r) (Г.Ф. Лакин, 1980).

2. Результати досліджень та їх обговорення

В 1-ій серії дослідів були співставленні протипухлинні, антиметастатичні та імунологічні ефекти застосування ПВ 1, 2 та 3. Результати оцінки впливу вакцинації на ріст і метастазування карциноми легені Льюїс наведені в табл. 1.

Таблиця 1. Перебіг росту карциноми легені Льюїс у вакцинованих та невакцинованих („контроль прищеплення”) мишей С57Bl

Примітка: 1 - p<0,05 і 2 - 0,05<p<0,1 при порівнянні з „контролем прищеплення”.

Як видно, вакцини 1 і 3 зменшували частоту прищеплення карциноми Льюїс на 34,9 (0,05<p<0,1) та 16,8% відповідно; вакцина 2 не справляла впливу на цей показник. Латентний період виникнення пухлин у невакцинованих і вакцинованих тварин суттєво не відрізнявся. Динаміка росту первинних пухлин у мишей, імунізованих вакцинами 1 та 3, не мала суттєвих відмінностей від такої в контролі. У тварин, імунізованих вакциною 2, спостерігали тенденцію до гальмування пухлинного росту (на 28-у добу після прищеплення ККЛ об'єм первинних пухлин 76,617,4 мм3 проти 533,7302,3 мм3 в контролі, p>0,05). Вакцинація практично не впливала на частоту виникнення метастазів у тварин, проте суттєво зменшувала кількість метастазів та гальмувала їх ріст: ІІМ для вакцини 1 - 50 (p<0,05), вакцини 2 - 75 (p<0,05), вакцини 3 - 29% (0,05<p<0,1) (табл. 1).

У 2-ій серії дослідів порівнювали ефективність вакцин 1 і 2, в 3-ій серії - вакцин, виготовлених за допомогою ЦЛ B. subtilis 7025, яку вирощували на МПБ або оптимізованому для синтезу лектинів синтетичному середовищі Гаузе (модифікації вакцини 2), за умов проведення вакцинації після оперативного видалення пухлини. В обох серіях експериментів не спостерігали суттєвого впливу вакцинації на частоту виникнення рецидивів захворювання, але був зафіксований антиметастатичний ефект. Зменшення кількості та об'єму метастазів КЛ у вакцинованих тварин порівняно з „контролем прищеплення” спостерігали як за відсутності, так і за наявності рецидивів захворювання, а також при порівнянні інтенсивності метастазування у дослідних і контрольних тварин з метастазами.

Як видно, вакцина 1 гальмувала розвиток метастазів переважно у тварин без рецидивів захворювання (індекс інгібіції метастазування (ІІМ) 93%); вплив вакцини 2 був виражений і за відсутності (ІІМ 94%), і за наявності (ІІМ 48%) останніх, а також навіть у тварин з метастазами (ІІМ 42 проти 14% у групі „вакцина 1”).

У 3-ій серії було показано, що антиметастатична ефективність вакцини 2 практично не залежить від того, на якому середовищі вирощується B. subtilis 7025: ІІМ вакцини, виготовленої з використанням ЦЛ ФКР росту на МПБ, складав 92%, ЦЛ ФКР росту на середовищі Гаузе - 81 % (p>0,1).

Функціональні характеристики імунної системи вакцинованих мишей до прищеплення ККЛ залежали від того, яку ПВ було використано. При застосуванні вакцини 1 вірогідно підвищеними були активність ЦТЛ, неспецифічна цитотоксичність СК (НЦтСК) та потенціюючий вплив СК на індекси цитотоксичності (ІЦ) ПК: на 101,4, 181,3 і 59,7% відповідно (p<0,05); вакцини 3 - НЦтСК, ІЦ МФ та ПК: на 99,1% (p<0,05), 77,3% (р<0,05) та 51,7%, (0,05<p<0,1) відповідно. Статистично суттєвої різниці між показниками мишей, яким вводили вакцину 2, та інтактним контролем в цей термін дослідження не спостерігали. На ранніх стадіях пухлинного росту (7-а доба) у групах „вакцина 1” і „вакцина 3” зафіксовано підвищення цитотоксичної активності ПК (індекс модуляції (ІМ) - 173 і 137% відповідно, порівняно з тваринами групи “контроль прищеплення” р<0,05), МФ (ІМ - 479 і 530% відповідно, р<0,05), ЦТЛ (ІМ - 88 і 125% відповідно, р<0,05), ефекторів АЗКЦ (ІМ - 106 та 123% відповідно, р<0,05), специфічної цитотоксичності СК (СЦтСК) (ІМ - 236 і 191% відповідно, р<0,05). В групі „вакцина 2” вірогідно збільшувались ІЦ неспецифічних протипухлинних ефекторів (ІМІЦ ПК 110,9%, p<0,05, ІМІЦ МФ 370,0%, p<0,05) та зростала на рівні тенденції СЦтСК (ІМ 147%, 0,05<p<0,1). Таким чином, на 7-у добу після прищеплення ККЛ при застосуванні вакцин 1 і 3 спостерігали вірогідну активацію всього спектру досліджених протипухлинних реакцій, що узгоджується зі зменшенням частоти прищеплення пухлин; при застосуванні вакцини 2 вірогідно підвищувались лише показники природньої резистентності, що, вочевидь, виявилось недостатнім для зменшення частоти прищеплення пухлин.

На 36-у добу пухлинного процесу більшість досліджуваних показників у мишей, імунізованих вакциною 1 або 3, знижувались і суттєво відрізнялись від таких у інтактних тварин та у контрольних тварин з карциномою Льюїс, маючи від'ємні ІМ, за винятком АЗКЦ і СЦтСК (рис. 2), що, можливо, є проявом високодозної (внаслідок надмірної активації цих реакцій на ранніх етапах пухлинного процесу) імуносупресії. Проте і за таких умов захисний ефект (ІІМ) вакцин ще зберігався. Стан імунної системи мишей групи „вакцина 2” був більш благоприємним: зростали активність МФ (р7-36<0,05) і НЦтСК, ІЦ ЦТЛ і ефекторів АЗКЦ практично не змінювались, достовірно зменшилась (р7-36<0,05) лише активність ПК; порівняно з „контролем прищеплення” жоден з показників не мав суттєвої від'ємної модуляції. Така динаміка добре узгоджується з найбільш вираженим антиметастатичним ефектом цієї вакцини.

Дослідження змін в регіонарних ПЛВ, які відбивають динаміку локальної імунної відповіді на ріст пухлини (Ю.А. Уманский, В.Г. Пинчук, 1982; С.А. Ковбасюк, 1985), дало подібні результати. На 7-у добу у мишей, імунізованих вакциною 1 або 3, зафіксована чітка локальна реакція: загальна кількість лімфоцитів, абсолютний вміст зрілих Т-, В-лімфоцитів, бластів і великих лімфоцитів достовірно збільшувались в регіонарних (але не контрлатеральних) ПЛВ; у контрольних тварин подібного феномену не спостерігали. На 28-36-у добу у групі „контроль прищеплення” всі згадані параметри достовірно знизились (р7-36<0,05) як в регіонарних, так і в контрлатеральних ПЛВ; при цьому суттєво зменшилось співвідношення показників відносного вмісту Т/В-лімфоцитів. У мишей груп „вакцина 1” і „вакцина 3” різниця між характеристиками регіонарних і контрлатеральних ПЛВ також стала менш виразною. Загальна клітинність ПЛВ знизилась (р7-36<0,05), але не була меншою за вихідний рівень. Зменшення абсолютного вмісту Т-лімфоцитів, бластів і великих лімфоцитів, дисбаланс Т/В-субпопуляцій при застосуванні вакцини 1 були виражені на рівні тенденцій, а при застосуванні вакцини 3 досягли статистичної вірогідності. За сукупністю характеристик стан ПЛВ тварин цих груп можна оцінити як більш благоприємний, ніж у „контролі прищеплення”; водночас, динаміка субпопуляційного складу ПЛВ може вказувати на поступове виснаження Т-популяції лімфоцитів. У мишей, які одержали вакцину 2, загальна клітинність регіонарних ПЛВ, абсолютний вміст в них зрілих Т-лімфоцитів, бластів і великих лімфоцитів поступово зростали протягом всього часу спостереження, співвідношення показників відносного вмісту Т/В-лімфоцитів як в регіонарних, так і в контрлатеральних ПЛВ залишалось практично стабільним. Тобто, при застосуванні вакцини 2 прояви локальної імунної відповіді на пухлинний ріст та збалансований стан імунної системи зберігались найбільш тривало.

У 2-ій серії дослідів відмінності імунологічних показників вакцинованих тварин від показників у групі „контроль прищеплення” були виражені на рівні тенденцій (вірогідність 85-95%) і залежали як від того, яку ПВ було застосовано, так і від наявності чи відсутності у тварин рецидивів захворювання. За наявності останніх (38-а доба пухлинного процесу) найбільш виразним імунологічним ефектом застосування обох вакцин була відсутність блокуючої дії СК на активність in vitro аутологічних ПК. У вакцинованих мишей обох груп було відмічено тенденцію до підвищення цитотоксичної активності МФ; ефектом застосування вакцини 1 було також деяке підвищення НЦтСК і СЦтСК. За відсутності рецидивів (45-а доба пухлинного процесу) у вакцинованих мишей спостерігали: при застосуванні вакцини 1 - тенденції до збільшення ІЦ ПК, МФ і НЦтСК; вакцини 2 - тенденції до підвищення ІЦ ЦТЛ, ефекторів АЗКЦ, СЦтСК та достовірне підвищення ІЦ МФ (р<0,05 порівняно з „контролем прищеплення”). Менш виразні імунологічні ефекти застосування вакцин 1 і 2 в цій серії досліджень, вірогідно, пов'язані з тим, що вакцинацію розпочинали на той час, коли всі досліджувані показники були змінені (порівняно з інтактними тваринами) внаслідок росту пухлини та оперативного втручання. За умов розвитку рецидивів захворювання на імунну систему впливали як власне вакцини, так і досить швидке збільшення пухлинної маси. Але навіть при цьому спостерігали певні позитивні імунологічні зрушення та гальмування накопичення в СК речовин, які знижують активність цитотоксичних ефекторів; відповідно спостерігали і гальмування метастазування. Результати цієї серії досліджень підтверджують висунуте раніше положення (Д.Г. Затула, 1985; Г.П. Потебня та ін., 2001), що основним призначенням досліджених вакцин є гальмування розвитку рецидивів і метастазів у радикально прооперованих пацієнтів.

Досліджували також рівень продукції in vitro відповідними клітинами ІЛ-2, ФНП, ІЛ-1. В 1-ій серії експериментів було показано, що на 7-у добу після перещеплення КЛЛ невакцинованим мишам здатність неприлипаючих спленоцитів до продукції in vitro ІЛ-2 суттєво знижувалась (p<0,05 порівняно з інтактними тваринами). В групах мишей, які отримали вакцину 1 або 3, продукція ІЛ-2 була суттєво активованою (p<0,05 в порівнянні з обома контрольними групами), вакцину 2 - не відрізнялась від такої у невакцинованих тварин. Одержані дані узгоджуються з вираженим підвищенням активності ЦТЛ і ПК на 7-у добу після прищеплення ККЛ мишам груп „вакцина 1” і „вакцина 3”. Перше пов'язане з важливою роллю ІЛ-2 у формуванні специфічної клітинної імунної відповіді, друге - з індукцією ЛАК-феномену (Н.М. Бережная, Б.А. Горецкий, 1992). З прогресуванням пухлинного процесу (36-та доба) титри ІЛ-2 в Сн спленоцитів невакцинованих мишей і тварин груп „вакцина 1” і „вакцина 3” знижувались (p7-36<0,05); групи „вакцина 2” - не зазнавали вірогідних змін (p7-36>0,1). Після оперативного видалення пухлини (18-та доба) продукція ІЛ-2 була вищою (р<0,05), ніж у інтактних мишей; в подальшому - знижувалась в групах „контроль прищеплення” і „вакцина 1” (р18-38<0,05, р18-45<0,05), але не у тварин групи „вакцина 2” (р18-38>0,1, р18-45>0,05). Стабільність продукції ІЛ-2 у імунізованих вакциною 2 мишей, визначена в обох серіях досліджень, є ще одним доказом збереження збалансованого стану імунної системи у тварин цих груп і узгоджується з виразним антиметастатичним ефектом цієї вакцини.

Ми припустили, що особливості динаміки імунологічних показників при застосуванні вакцин 1 і 2 можуть бути пов'язані з їх неоднаковим впливом на функціональну активність МФ, які, як відомо, є не лише ефекторами природньої резистентності, але і імунорегуляторними клітинами, що можуть діяти і як активатори, і як супресори інших ланок імунної системи (А.П. Суслов, 1984; И.С. Фрейдлин, 1995; А.А. Ярилин, 2000). Тому досліджено динаміку продукції прилипаючими спленоцитами важливих плюрипотентних імунорегуляторних цитокинів МФ - ФНП та ІЛ-1. В 1-шій серії досліджень було показано, що у невакцинованих мишей з карциномою Льюїс продукція ФНП вірогідно знижена на 7-у та 36-ту добу (р<0,05 порівняно з інтактним контролем). При застосуванні вакцини 1 на 7-у добу після прищеплення ККЛ титр ФНП у Сн прилипаючих спленоцитів значно збільшувався (ІМ порівняно з „контролем прищеплення” становив 333%, р<0,01; порівняно з інтактними мишами - 79%, р<0,05). На 36-у добу титр ФНП виявився нижчим, ніж у інтактних тварин (р=0,1), та не відрізнявся від такого у „контролі прищеплення”, хоча ІЦ Сн в розведенні 1:2 залишались дещо вищими (р=0,1) порівняно з обома контролями. Титри ФНП в Сн групи „вакцина 2” протягом пухлинного процесу зберігались на рівні інтактного контролю (р>0,1), ІЦ Сн в розведенні 1:2 поступово зростали (на 36-у добу р<0,05 порівняно з обома контролями). Результати 2-ої серії досліджень були подібними: у найбільш віддалений термін після прищеплення ККЛ та оперативного видалення пухлини (45-та, 27-ма доба відповідно) спостерігали зниження титрів ФНП і ІЦ Сн в розведенні 1:2 як в групі „контроль прищеплення” (р38-45=0,1, р38-45<0,05 відповідно), так і в групі „вакцина 1” (р38-45=0,1, р38-45=0,1 відповідно). У групі „вакцина 2” спостерігали поступове зростання продукції ФНП; на 45-у добу спостереження і титр ФНП, і ІЦ Сн в розведенні 1:2 були найвищими (p<0,05 порівняно з обома контролями та з групою „вакцина 1”). Таким чином, ефектом застосування вакцини 2 було тривале збереження активованого стану МФ протягом пухлинного процесу.

Про збереження функціонального резерву МФ при застосуванні вакцини 2 свідчать і дані щодо продукції прилипаючими спленоцитами ІЛ-1. На 38-му добу після перещеплення ККЛ (27-ма доба після оперативного видалення пухлини, 7-ма - після закінчення вакцинації) спонтанна продукція цього цитокину в культурах клітин мишей контрольної і дослідних груп суттєво не відрізнялась (p>0,1), але додаткова індукція in vitro ЛПС супроводжувалась підвищенням (рсп-інд<0,05) титрів ІЛ-1 лише в Сн клітин, виділених від мишей групи „вакцина 2”.

З літератури відомо, що так званий „природний спектр цитокинів” (ІЛ-1, 2, 6, ІНФ-гамма) підвищує активність МФ, а активність ПК підвищується при дії ІЛ-2, 12 та помірних концентрацій ФНП-альфа (Л.В. Ковальчук и др., 1995; И.С. Фрейдлин, 1999; Н.М. Бережная, В.Ф. Чехун, 2002). Для якісної оцінки балансу цитокинів в СК було досліджено вплив in vitro останньої на активність аутологічних ПК і МФ. В обох серіях експериментів додавання CК інтактних мишей в систему цитолізу in vitro дещо збільшувало ІЦ ПК: на 60% (0,05<р<0,1) і на 23 % (р>0,1). На 7-му добу після перещеплення ККЛ невакцинованим тваринам аутологічна СК збільшувала ІЦ ПК на 140% (р<0,05), на 36-ту добу такого феномену не спостерігали. У мишей, імунізованих вакциною 1, на 7-му добу після перещеплення ККЛ відмічали найбільш високу активність ПК, додавання в реакцію аутологічної СК суттєво знижувало ІЦ (р<0,05). На 36-ту добу активність ПК мишей цієї групи достовірно знижувалась, на цьому фоні спостерігали значну гетерогенізацію ефекту аутологічної СК (у 40% - підвищення ІЦ, в 40% - зниження, в 20% - відсутність ефекту). У мишей, імунізованих вакциною 2, динаміка активності ПК була аналогічною, проте відмінність від інтактного контролю не досягала 95% значущості ні на 7-му, ні на 36-у добу. В обидва терміни дослідження вплив аутологічної СК виявлявся в підвищенні ІЦ ПК (на 36-ту добу - р<0,05). В 2-ій серії досліду в усіх групах відмічено суттєве підвищення ІЦ ПК на 38-му добу і зниження до 45-ї доби пухлинного процесу. СК невакцинованих мишей мали тенденцію до зниження ІЦ аутологічних ПК (на 38-му добу - на 25%, р=0,1; на 45-ту добу - на 59%, р=0,1). Подібна дія СК вакцинованих мишей не була відмічена в жоден з термінів дослідження. Щодо активності МФ, то СК невакцинованих мишей не впливали на ІЦ аутологічних МФ за відсутності рецидиву захворювання та суттєво знижували цей показник за наявності рецидиву (p<0,05). СК мишей групи „вакцина 1” не впливали на ІЦ МФ, групи „вакцина 2” - підвищували їх (за відсутності рецидиву - на рівні тенденції (р=0,1), за наявності останнього - більш суттєво (0,05<p<0,1).

Виходячи з результатів визначення кількості клітин (до перещеплення ККЛ) в ПЛВ мишей, яким вводили вакцину 2, ми припустили, що одним із механізмів дії цієї вакцини може бути компенсаторна активація імунної системи у відповідь на цито-(лімфо-)токсичний ефект ЦЛ В. subtilis 7025. Тому додатково була досліджена (4-та серія дослідів) динаміка впливу ЦЛ B. subtilis 7025, яку вирощували на МПБ або синтетичному середовищі Гаузе, і відповідних їм вакцин на показники клітинності КМ, Т, С, ПЛВ, а також на субпопуляційний склад КМ і ПЛВ. І ЦЛ B. subtilis 7025, і „лектиновим вакцинам” були притаманні прояви транзиторної цито(лімфо)токсичності: зменшення клітинності КМ, Т, С, ПЛВ після 2-го введення та відновлення цих показників після 3-го введення препаратів; зниження в КМ та ПЛВ вмісту зрілих клітинних форм (в КМ - клітин гранулоцитарного паростку, в ПЛВ - В-лімфоцитів). Одночасно спостерігали і прояви компенсаторної реакції: підвищення відносного та абсолютного вмісту менш диференційованих (зрілих) клітин (в КМ - гранулоцитарних елементів, що диференціюються, в ПЛВ - бластів і великих лімфоцитів). За сукупністю та вираженістю описаних змін можливо припустити, що дещо більшу імунотоксичність (але в межах компенсаторних можливостей організму дослідних тварин) мають ЦЛ B. subtilis 7025, особливо „ЦЛ, МПБ”. Треба також зазначити, що ефекти вакцин були більш подібні (як якісно, так і кількісно), ніж ефекти ЦЛ.

Як зазначалось вище, ПВ, які були виготовлені з використанням ЦЛ B. subtilis 7025, вирощуваної на МПБ або напівсинтетичному середовищі Гаузе, мали практично однакову антиметастатичну ефективність. Дослідження цитотоксичної активності основних протипухлинних клітин-ефекторів також продемонструвало ідентичність дії цих ПВ. Принципово важливою є відсутність у вакцинованих тварин обох груп різкого падіння ІЦ більшості з досліджуваних клітин (ЦТЛ, МФ, АЗКЦ) у віддалені терміни пухлинного росту (45-та доба). Імунологічні показники вакцинованих тварин (не залежно від середовища вирощування B. subtilis 7025) не мали суттєвих відмінностей в жодний з термінів спостереження; хоча відмічено дещо більш виражений вплив ПВ, виготовленої за допомогою ЦЛ МПБ, на МФ, а ПВ “ЦЛ, Гаузе” - на ЦТЛ та АЗКЦ.

Завершальним етапом аналізу одержаних результатів стало визначення кореляційних зв'язків між модуляцією імунологічних параметрів та показниками ефективності ПВ. За ступенем кореляційного зв'язку між ступенем активації протипухлинних реакцій та гальмування прищеплення пухлини (1-ша серія дослідів) можна скласти наступний ряд: ІЦ ПК (r=0,999), СЦтСК (r=0,999), продукція in vitro ФНП (r=0,873) та ІЛ-2 (r=0,831), АЗКЦ (r=0,791), ІЦ ЦТЛ (r=0,715) - сильний кореляційний зв`язок; ІЦ МФ (r=0,562) - виражений; НЦтСК (r=0,157) - кореляція відсутня. При порівнянні стану імунологічних показників з ІІМ кореляційні зв'язки були дещо іншими. За наявності в організмі значної маси пухлинних клітин (1-ша серія дослідів, 2-га серія - миші з рецидивами захворювання) позитивна кореляція відмічена між ІІМ та: продукцією in vitro ФНП (відповідно r=0,990, r=0,960) та ІЛ-2 (відповідно r=0,890, r=0,923), ІЦ ПК (відповідно r=0,661, r=0,623), ЦТЛ (відповідно r=0,370, r=0,395), АЗКЦ (відповідно r=0,341, r=0,330). Кореляція між ІІМ та СЦтСК за умов вакцинації до прищеплення пухлинних клітин була позитивною (r=0,999), за вакцинації після операції - від'ємною (r=-0,669). Між ІІМ та ІЦ МФ кореляція була відсутня (r<0,1). За відсутності рецидивів захворювання визначена сильна позитивна кореляція між ІІМ та ІЦ ЦТЛ (r=0,805), продукцією in vitro ФНП (r=0,716) та ІЛ-2 (r=0,722), виражена - між ІІМ та СЦтСК (r=0,632), АЗКЦ (r=0,508). Звертає увагу поява від'ємної кореляції між ІІМ та ІЦ МФ (r=0,-895), ПК (r=-0,166) та наявність від'ємної кореляції між ІІМ і НЦтСК при всіх варіантах порівняння (1-ша серія дослідів r=-0,824; 2-га серія - r=-0,528 (за наявності рецидиву захворювання), r=-0,780 (за відсутності рецидиву захворювання).

Таким чином, проведені дослідження показали, що для моніторингу ефективності застосування вакцин серії ІЕПОР слід оцінювати не тільки показники, які характеризують специфічні реакції протипухлинного імунітету, що є традиційним при використанні більшості вакцин, але і функціональні зміни ефекторів неспецифічної ланки: ПК, МФ, а також рівень продукції мононуклеарами ФНП та ІЛ-2 без додаткової стимуляції in vitro. Враховуючи залежність кореляційних зв'язків між індексом інгібіції метастазування (ІІМ) та рядом проаналізованих імунологічних показників від розвитку рецидиву захворювання, моніторинг імунологічних показників доцільно проводити не тільки під час застосування вакцини та після його закінчення, але й в більш віддалені від вакцинації строки.

протипухлинний вакцинація цитотоксичний культуральний

Висновки

Робота присвячена проблемі вакцинотерапії при злоякісних новоутвореннях: експериментальному дослідженню протипухлинної і антиметастатичної дії та імунологічних ефектів протипухлинних вакцин, що створені на основі пухлинних клітин за оригінальними технологіями, розробленими в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України.

1. На моделі карциноми легені Льюїс показано, що застосування вакцин серії ІЕПОР до прищеплення пухлинних клітин супроводжується протипухлинним і антиметастатичним ефектами, але виразність останніх є різною: при використанні вакцини 1 (виготовленої на основі пухлинних клітин з використанням ФКР B. subtilis 7025) гальмування росту пухлин (ГРП) складало 34,9%, а індекс інгібіції метастазування (ІІМ) дорівнював 50%; при використанні вакцини 3 (виготовленої з тих же пухлинних клітин шляхом контрольованого глікопептидного гідролізу) ГРП складало 16,8%, а ІІМ дорівнював 29%. При використанні вакцини 2 (виготовленої на основі пухлинних клітин за допомогою цитотоксичних лектинів ФКР B. subtilis 7025) ІІМ становив 75%.

2. При застосуванні вакцин 1 та 2 після видалення первинної пухлини спостерігається антиметастатичний ефект: для вакцини 1 - ІІМ дорівнював 93,6% (для тварин без рецидивів захворювання), 27,5% (для тварин з рецидивами захворювання), 14,4% (для тварин з метастазами); для вакцини 2 - 94,0, 48,5 і 42,2% відповідно.

3. Спектр імунологічних ефектів досліджених вакцин включає активуючий вплив на клітинні і гуморальні реакції адаптивного імунітету (активність ЦТЛ, специфічна цитотоксичність сироватки крові), на реакції природньої протипухлинної резистентності (цитотоксична активність ПК і МФ), а також на рівень продукції відповідними клітинами in vitro ІЛ-2, ФНП, ІЛ-1.

4. Динаміка змін імунологічних показників при використанні досліджених вакцин різна: за умов використання вакцин 1 та 3 значне підвищення (р<0,05) індексу цитотоксичності (ІЦ) ПК, МФ, ЦТЛ, АЗКЦ і специфічної цитотоксичності сироватки крові спостерігається на ранніх етапах розвитку пухлин, але при прогресуванні пухлинного процесу перелічені показники зазнають від'ємної модуляції; при імунізації вакциною 2 в ранній термін зазнають активації ПК (р<0,05) і МФ (р<0,05) та спостерігається тенденція (0,05<р<0,1) до підвищення специфічної цитотоксичності сироватки крові, але навіть за умов прогресування пухлинного процесу зберігається збалансований стан імунної системи (вірогідної від'ємної модуляції не зазнає жоден з досліджених показників).

5. До механізмів, які опосередковують тривале збереження збалансованого стану імунної системи імунізованих вакциною 2 тварин, можливо, як свідчать результати проведених досліджень, віднести а) пролонгацію деструктивної фази активації МФ та збереження функціонального резерву цих клітин; б) розвиток компенсаторних реакцій імунної системи на лімфомієлотоксичний вплив лектину ФКР B. subtilis 7025; в) гальмування асоційованої з пухлинним ростом імуносупресії (накопичення в сироватці крові речовин, що пригнічують активність ЦТЛ, ПК, ефекторів АЗКЦ, МФ).

6. Порівняльне дослідження протипухлинної ефективності і імунологічної активності вакцин, виготовлених з використанням лектину ФКР B. subtilis 7025 за умов вирощування останньої на різних середовищах, вказує на можливість культивування B. subtilis 7025 на оптимізованому для синтезу лектинів напівсинтетичному середовищі Гаузе, що сприятиме стандартизації та здешевленню технології виготовлення вакцини.

7. При найбільш вираженому ефекті застосування вакцин 1 і 2 (відсутність у прооперованих тварин рецидивів захворювання, гальмування росту метастазів) встановлено позитивні кореляційні зв'язки між ІІМ та ІЦ ЦТЛ (r=0,805), продукцією in vitro ФНП (r=0,716) та ІЛ-2 (r=0,722), СЦтСК (r=0,632), АЗКЦ (r=0,508). Кореляційні зв'язки між ІІМ та цитотоксичною активністю ПК і МФ змінювались в динаміці спостереження: після закінчення вакцинації - rІІМ-ІЦ ПК>0,6, rІІМ-ІЦ МФ<0,1; у більш віддалений термін кореляція ставала від'ємною - rІІМ-ІЦ ПК=-0,166, rІІМ-ІЦ МФ=-0,895, rІІМ-НЦтСК=-0,780. Викладене обґрунтовує доцільність визначення прогностичної значимості динаміки перелічених показників при моніторингу відповіді імунної системи онкологічних хворих на застосування вакцин.

Література

1. Савцова З.Д., Усач О.М., Воєйкова І.М., Юдіна О.Ю., Леонов Ю.І., Новиченко Н.Л., Шляховенко В.О., Потебня Г.П.. Особливості впливу протипухлинних вакцин (серія ІЕПОР), виготовлених за різними технологіями, на ефекторні реакції специфічного і неспецифічного імунітету // Наукові записки НаУКМА. Серія: Біологія та екологія (Національний університет “Києво-Могилянська академія”). - 2001. - Т. 19. - С. 26-31.

2. Усач О.М., Танасиенко О.А., Юдина О.Ю., Потебня Г П., Савцова З.Д. Биологические свойства и эффективность противоопухолевых вакцин, приготовленных с использованием продуктов метаболизма Bacillus subtilis 7025, культивируемой на различных средах. // Эксперим. онкология. - 2002. - Т. 24, №1. - С. 76-79.

3. Федосова Н. І., Усач О.М., Юдіна О.Ю., Воєйкова І.М., Ковбасюк С.А., Потебня Г.П., Шляховенко В.О., Савцова З.Д Вплив протипухлинних аутовакцин на активність макрофагів // Наукові записки НаУКМА. Серія: Біологія та екологія (Національний університет “Києво-Могилянська академія”). - 2002. - Т. 20. - С. 441-444.

4. Савцова З.Д., Усач О.М., Юдина О.Ю., Федосова Н.И., Танасиенко О.А., Лисовенко Г.С., Потебня Г.П. Сопоставление эффективности вакцин серии ИЭПОР с динамикой продукции ФНО, ИЛ-1, ИЛ-2 у мышей с карциномой Льюис // Эксперим. онкология. - 2002. - Т. 24, №4. - С. 295-300.

5. Усач О.М., Федосова Н.І. Порівняння механізмів дії протипухлинних вакцин (серія ІЕПОР), виготовлених за різними технологіями. // Тези до IV Республіканської науково-практичної конференції молодих онкологів України “Сучасні проблеми експериментальної та клінічної онкології”. - Київ, 2001. - С. 22.

Размещено на Allbest.ru