Експресія генів дефенсинів в клітинах злоякісних пухлин людини

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

14.01.07 - Онкологія

Експресія генів дефенсинів в клітинах злоякісних пухлин людини

Лісовський Ігор Леонідович

Київ 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Науковий керівник - кандидат біологічних наук, старший науковий співробітник Погрібний Петро Васильович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу біології пухлинної клітини

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук Кудрявець Юрій Йосипович, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, завідувач відділу експериментальних клітинних систем кандидат біологічних наук В'юницька Людмила Василівна, Київська медична академія післядипломної освіти ім. П.Л. Шупика МОЗ України, асистент кафедри клінічної лабораторної діагностики

Провідна установа - Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця, кафедра онкології, м.Київ

Захист відбудеться _“10”_квітня_ 2002 року о _13 год. 30 хв._ на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України за адресою: 03022, Київ, вул. Васильківська, 45

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці ІЕПОР ім. Р.Є. Кавецького НАН України

Автореферат розісланий _“09”__березня 2002 р.__

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук Н.В. Бородай

1. Актуальність проблеми

пухлина ген епітелій дефенсин

Для дослідження природи пухлинного росту та механізмів, за допомогою яких нормальна клітина перетворюється в злоякісну, вивчаються закономірності експресії генів, що кодують біологічно активні пептиди та білки, при злоякісній трансформації клітин, встановлюється роль окремих білків в прогресії пухлин та проводиться пошук молекулярних маркерів неоплазії. З цієї точки зору мало дослідженим є новий клас біологічно активних пептидів - дефенсинів. Останні є компонентом так званої неадаптивної імунної системи людини та продукуються клітинами тканин людини у відповідь на місцеву бактеріальну інфекцію. Дефенсинам притаманний широкий спектр антибіотичної активності та, як вважається, домінуюча роль в миттєвій відповіді на мікробну інфекцію (Ganz T., 1999). В той же час дані про експресію дефенсинів в пухлинах людини майже відсутні і лише окремі роботи присвячені дослідженням в даному напрямку. Так, було показано, що в плоскоклітинних карциномах ротової порожнини експресуються гени дефенсинів hBD-1 та hBD-2 (Abiko Y. et. al., 1999), а в сечі хворих на рак сечового міхура підвищено вміст дефенсинів. В останні роки з'явилися дані, що вказують на можливу роль дефенсинів в контролі проліферації клітин; також встановлено, що дефенсини людини є ефективними інгібіторами протеїнкінази С (Pogrebnoi P.V. et. al., 2001). Регуляція активності кіназ і, відповідно, фосфорилювання білків свідчить про роль дефенсинів не тільки як антимікробних агентів, але й як важливих регуляторних факторів, та частково пояснює їх мітогенні властивості.

Таким чином, дослідження особливостей експресії генів дефенсинів в злоякісно трансформованих клітинах та їх участі в контролі проліферації є актуальними для сучасної онкології.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Роботу виконано у відділі біології пухлинної клітини Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України (завідувач відділом - П.В. Погрібний). Робота виконана в рамках програм ДКНТ України та Міністерства України у справах науки і технологій (шифр 2/1297-97, № 0198U005252; шифр 02.04/04439, № 0198U005179) та в планах науково-дослідних робіт Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є. Кавецького НАН України, шифр проблеми 2.2.5.209, № 0198U001092).

Мета роботи. Дослідити особливості експресії генів дефенсинів в злоякісно трансформованих клітинах людини.

Задачі дослідження:

1. Визначити характер експресії генів дефенсинів в лініях пухлинних клітин різного гістогенезу.

2. Визначити умови індукції експресії генів бета-дефенсинів в культивованих клітинах ліній А431 та М-HeLa, що походять з пухлин вульви та шийки матки відповідно.

3. Встановити взаємозв'язок між індукованою експресією гена hBD-2, експресією гена рецептору епідермального фактору росту (ЕФР-р) та рівнем аутофосфорилювання ЕФР-р в пухлинних клітинах людини in vitro.

4. Дослідити закономірності експресії генів дефенсинів та рецептора ЕФР у зразках нормального та злоякісно трансформованого епітелія шийки матки та вульви людини.

Об'єкт дослідження - культури злоякісно трансформованих клітин людини M-HeLa, KB, COLO 320HSR, U251, Molt-4, CEM, A431 та трансфекована ретровірусним вектором, що містить кДНК трансформуючого фактору росту типу альфа (ТФР-a), сублінія клітин А431/1522; післяопераційний матеріал пухлин вульви та шийки матки людини.

Предмет дослідження - експресія генів дефенсинів в культурах злоякісно трансформованих клітин за умов стандартної культивації. Вплив екзогенної стимуляції (фактори росту, бактеріальна та вірусна інфекція) на експресію генів дефенсинів, експресію гена ЕФР-р та функціональний стан ЕФР-рецептора in vitro.

Методи дослідження - методи молекулярної біології (виділення та очистка нуклеїнових кислот, полімеразна ланцюгова реакція (ПЛР), реакція зворотньої транскрипції (ЗТ)); біохімічні методи (виділення та очистка білків - гель-фільтрація, електрофорез в поліакриламідному гелі, електроперенос білків на нітроцелюлозні фільтри); мікробіологічні методи (культивування мікроорганізмів на твердих середовищах); культивування еукаріотичних клітин.

Наукова новизна отриманих результатів. Вперше проведено аналіз спектру експресії генів дефенсинів в пухлинних клітинах людини in vitro та в зразках хірургічно видалених пухлин вульви та шийки матки. Встановлено, що пухлинні клітини різного гістогенезу, характеризуються наявністю конститутивної експресії певних генів сімейства дефенсинів. Продемонстровано, що експресія гена hBD-2 індукується у відповідь на дію факторів росту (ЕФР та ТФР-a). Проведено аналіз спектру генів дефенсинів, що експресуються в новоутвореннях вульви та шийки матки людини. Показано, що експресія гена hBD-2 є характерною для пухлин цієї локалізації та є асоційованою з гіперекспресією гена ЕФР-рецептора.

Практичне значення одержаних результатів. Створено системи та оптимізовано умови для аналізу експресії генів дефенсинів методом зворотньої транскрипції. Дане дослідження є фундаментальною роботою, результати якої можуть бути використані при розробці нових біологічних засобів лікування онкологічних хворих.

Особистий внесок здобувача. Всі дослідження виконувались при безпосередній участі здобувача. Планування експериментів, очистка нуклеїнових кислот та експерименти із застосуванням методів зворотньої транскрипції (ЗТ) та полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР) були проведені здобувачем самостійно.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертації були представлені на Міжнародному конгресі “Beyond the Genome” (Birmingham, UK, 2000); II з'їзді онкологів країн СНД (Київ, Україна, 2000); Міжнародному симпозіумі “Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems” (Київ, Україна, 2001); X з'їзді онкологів України (Ялта, Автономна Республіка Крим, 2001) та на конференції молодих науковців ІЕПОР ім Р.Є. Кавецького НАН України (Київ, 2001).

Публікації. Результати дисертації опубліковано в 9 наукових роботах, в тому числі в 4 статтях у провідних фахових виданнях.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури, опису матеріалів і методів досліджень, шести підрозділів власних досліджень, аналізу та узагальнення отриманих результатів, висновків і списка використаної літератури. Основний зміст дисертації викладений на 140 сторінках машинописного тексту, містить 5 таблиць та 34 рисунка. Список використаної літератури включає 202 джерела, з них 8 вітчизняних та 194 іноземних авторів.

2. Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Для пошуку нуклеотидних послідовностей генів дефенсинів та послідовностей їх кДНК використовували сервер http://www.ncbi.nlm.nih.gov.

Аналіз експресії генів дефенсинів методом ЗТ-ПЛР проведено на РНК-матрицях злоякісно трансформованих клітин людини ліній M-HeLa, KB, COLO 320HSR, U251, Molt-4, CEM, A431 та сублінії А431/1522.

Для культивування клітин використовували середовища DMEM або RPMI-1640 (Gibco BRL, Великобританія) з додаванням 10% сироватки крові ембріонів теляти (Gibco BRL, Великобританія)

Експресію гена hBD-2 в культурах клітин M-HeLa та A431 індукували шляхом зміни середовища на безсироваткове, в яке вносили наступні індуктори: живу та стерилізовану кип'ятінням культуру B.subtilis з розрахунку 2,5х109 клітин на чашку Петрі діаметром 3 см; ЕФР до кінцевої концентрації 10 мкг/мл. Продукцію рекомбінантного ТФР-a в сублінії А431/1522 індукували додаванням в середовище культивування CdCl2 до кінцевої концентрації 3 мкМ.

Антимікробну активність препаратів концентрованого кондиційованого середовища клітин сублінії А431/1522 визначали за пригніченням росту бактерій в тонкому шарі агарози за методом (Hultmark D. et. al., 1983).

Для моделювання вірусної інфекції використовували еталонний штам аденовірусу людини 5-го типу, що був люб'язно наданий чл.-кор. НАНУДяченко Н.С. Процес сорбції вірусу на клітинах лінії А431 проводили протягом 1 год (Носач Л.Н., Дяченко Н.С., 1982).

В роботі було використано клінічний матеріал нормального та злоякісно трансформованого епітелія вульви (17 зразків) та шийки матки (12 зразків), який отримано з відділення онкогінекології Інституту онкології АМН України (зав. відділом проф. Воробйова Л.І.) За клінічними та гістологічними ознаками пухлини вульви та шийки матки було верифіковано як плоскоклітинний рак 1-ої, 2-ої та 3-ої стадії.

Для проведення реакції зворотньої транскрипції використовували набір реактивів First Strand cDNA Synthesis Kit (№К1621, MBI Fermentas, Литва). Реакцію проводили згідно з протоколом виробника. В кожну реакцію вносили 3 мкг сумарної РНК. Для визначення ефективності перебігу реакції зворотньої транскрипції проводили контрольну ПЛР з олігонуклеотидними затравками до гена гліцеральдегід-3-фосфат дегідрогенази.

Полімеразну ланцюгову реакцію проводили в 0,2 мл пробірках в об'ємі 25 мкл. Реакційна суміш містила 2,5 мкл 10Х ПЛР буферу (№ЕР0401, MBI Fermentas, Литва), 4 мкл 2 мМ суміші дезоксинуклеотидтрифосфатів, 1-2 мкл 25 мМ МgCl2, по 30 пМ кожної олігонуклеотидної затравки, 25-50 нг ДНК, або 2 мкл суміші, отриманої в результаті реакції зворотньої транскрипції, та 1,5 од. термостабільної Taq ДНК-полімерази (№ЕР0401, MBI Fermentas, Литва). Ампліфікація проводилась протягом 40 циклів при температурних режимах, що були підібрані експериментально для кожної з пар олігонуклеотидних затравок. В усіх експериментах використовували ампліфікатор Gene Amp PCR System 2400 (Perkin Elmer, США). Для підвищення специфічності ампліфікації та зменшення виходу неспецифічного ампліфікату використовувався принцип “Hot Start”, який полягає в тому, що Taq ДНК-полімеразу вносили після прогріваня реакційної суміші при 940С протягом 1 хв.

Аналіз продуктів ампліфікації проводили за допомогою електрофорезу в агарозному або поліакриламідному гелі (Маниатис Т. и др., 1984).

Для визначення фосфокіназної активності ЕФР-рецептору (ЕФР-р) білкові лізати клітин фракціонували електрофоретично в системі буферів Леммлі з використанням 7-22% градієнтних поліакриламідних гелів товщиною 1 мм, застосовуючи апарати “Біорух” (Україна). Після електрофорезу білки переносили на нітроцелюлозну мембрану (Schleicher & Schuell, Німеччина). Інкубацію нітроцелюлозних фільтрів проводили в розчині PBS, що містив 0,1% Tween-20 та антифосфотирозинові антитіла (PY20, Santa Cruz Biotechnology INC, США). Візуалізацію фосфорильованих білків здійснювали з використанням набору ECL (RPN2106, Amersham, Великобританія) згідно протоколу виробника.

Результати досліджень та їх обговорення

Добір олігонуклеотидних затравок та оптимізація умов для ідентифікації експресії генів дефенсинів методом ЗТ-ПЛР.

Аналіз експресії генів дефенсинів в пухлинних клітинах проводили методом ЗТ-ПЛР. Використовуючи базу даних нуклеїнових кислот Американського центру біотехнологічної інформації (http://www.ncbi.nlm.nih.gov), було проаналізовано послідовності генів дефенсинів людини, ЕФР-рецепторів та послідовності їх мРНК з метою добору олігонуклеотидних затравок для ПЛР. Виходячи з двохекзонної структури генів дефенсинів людини, олігонуклеотидні затравки добирались таким чином, щоб прямий і зворотній праймер мали місця зв'язування на сусідніх екзонах гена. Такий підхід виключає можливість отримання хибного результату при проведенні ЗТ-ПЛР внаслідок ампліфікації фрагмента гена у випадку потрапляння ДНК в зразок сумарної РНК у процесі її виділення. Використовуючи комп'ютерні програми GENEPRO та OLIGO було підібрано олігонуклеотидні затравки до кожного з генів дефенсинів людини. У випадку генів ЕФР-р були підібрані вироджені праймери, які задовольняють умови комплементарності усіх чотирьох генів, що кодують ЕФР-рецептор. Використовуючи геномну ДНК в якості матриці, в експерименті було встановлено оптимальні умови ампліфікації, а саме температуру асоціації олігонуклеотидних затравок та концентрацію MgCl2 в реакційній суміші

Для перевірки генетичної належності фрагментів ДНК, що були отримані в результаті ЗТ-ПЛР, проводили рестриктний аналіз.

Експресія генів дефенсинів в культивованих пухлинних клітинах людини.

Методом ЗТ-ПЛР проаналізовано сумарну РНК клітин ліній А431, M-HeLa, Colo320HSR, Molt-4, CCRF-CEM, KB, U251 та сублінії А431/1522, що культивувались в стандартних умовах. Отримані дані дозволили встановити наступне:

в культурі клітин гліобластоми людини лінії U251 експресуються гени HNP-1та HNP-3 (

в культивованих клітинах ліній КВ та А431, а також в сублінії клітин А431/1522 експресується ген hBD-1

в культивованих клітинах лінії COLO 320HSR експресується ген HD-5

- в культивованих клітинах ліній КВ, M-HeLa, CCRF-CЕM, Molt-4, А431 та сублінії А431/1522 експресується ген HD-6

Отримані дані свідчать, що злоякісні клітини різного гістогенезу характеризуються наявністю експресії одного або декількох генів дефенсинів. Так, трансформовані епітеліальні клітини КВ, M-HeLa, А431 та сублінія А431/1522 експресують ген HD-6, а також ген hBD-1 за виключенням клітин лінії M-HeLa. Експресія генів HNP-1 та HNP-3 в культивованих клітинах гліобластоми лінії U251 та експресія гена HD-6 в лімфоїдних Т-клітинах ліній CEМ та Molt-4 виявлена в наших дослідженнях вперше. Дані літератури свідчать, що експресія генів HNP-1 та HNP-3 властива лише активно проліферуючим клітинам кісткового мозку, а експресія гена HD-6 є характерною для секреторних клітин Пенета тонкого кишківника та в меншій мірі притаманна епітеліальним клітинам ендоцервіксу, ендометрію та фаллопієвих труб.

Вплив факторів росту, бактеріальної та вірусної інфекції на експресію генів дефенсинів in vitro

Проведені дослідження дали змогу встановити, що клітини сублінії А431/1522 експресують гени hBD-1 та HD-6 на невисокому рівні. В той же час дані наших досліджень свідчать про індукцію секреції антимікробного пептиду в клітинах сублінії А431/1522 за умов активованої продукції рекомбінантного ТФР-a

Наслідком продукції даного пептиду є зниження проліферативних показників клітин. За рядом біохімічних характеристик та спектром біологічної активності вказаний пептид мав спільні риси з антимікробними пептидами людини - дефенсинами, тому було висунуто припущення, що таким пептидом може бути бета-дефенсин-2, єдиний з дефенсинів, експресія якого має індуцибельний характер. Дані літератури свідчать, що експресія гена hBD-2 розпочинається при контакті клітин з бактеріальними агентами або їх компонентами (Diamond G. et al., 1997). У зв'язку з цим було проведено дослідження, з метою оцінки впливу бактеріальних агентів і факторів росту, а також вірусної інфекції на рівень експресії генів дефенсинів in vitro в пухлинних клітинах ліній А431 та M-HeLa. Спочатку таке дослідження було проведено на клітинах сублінії А431/1522 за умов продукції рТФР-a. Дійсно, методом ЗТ-ПЛР встановлено, що за таких умов в клітинах сублінії А431/1522 індукується транскрипція гена hBD-2, яка відсутня в неіндукованих клітинах сублінії А431/1522

Отримані нами дані свідчать на користь припущення про те, що експресія гена hBD-2 може бути індукована in vitro у відповідь на дію факторів росту. Для перевірки цього припущення було необхідно провести аналогічний експеримент на клітинах вихідної лінії А431 з використанням екзогенного ЕФР. Для цього клітини лінії А431 інкубували в середовищі, що містило ЕФР в концентрації 1 мкг/мл. За таких умов починаючи з 2 год інкубації спостерігалась індукція експресії гена hBD-2, відсутня в клітинах, що не були індуковані фактором росту

Аналогічні результати, отримані на клітинах ліній M-HeLa, дозволили впевнитись, що експресія цього пептидного антибіотика може бути індукована при дії на клітини факторів росту. Змін рівня експресії генів hBD-1 та HD-6 в клітинах, культивованих в присутності ЕФР, відмічено не було.

Далі було проведено подібне дослідження, в якому індукторами експресії гена hBD-2 були бактеріальні агенти. Для цього клітини ліній А431 та M-HeLa інкубували протягом 6 год в присутності живої або стерилізованої кип'ятінням культури B.subtilis. Отримані дані продемонстрували появу експресії гена hBD-2 в зразках клітин, що були інкубовані з культурами живих мікроорганізмів або стерилізованою бактеріальною культурою. Рівень експресії генів дефенсинів, що транскрибуються конститутивно в клітинах даного типу, при цьому залишився незмінним. Таким чином, регуляція експресії генів дефенсинів hBD-1 та HD-6 перебуває під контролем інших механізмів, що не залежать від наявності зовнішніх стимулів.

Наступною задачею даної роботи було дослідити, як впливає вірусна інфекція на експресію генів дефенсинів in vitro. Для цього клітини лінії А431 інфікували живою культурою аденовірусу людини (Ad5). Експресію генів дефенсинів оцінювали методом ЗТ-ПЛР. За допомогою цитологічного методу було встановлено, що використання високого титру вірусу призводить до ефективного інфікування клітин лінії А431.

Аналіз експресії генів hBD-1, HD-6 та hBD-2 виявив відсутність відмінностей між інфікованими та контрольними клітинами. Таким чином, отримані результати показали, що в злоякісно трансформованих клітинах шийки матки та вульви людини, індукція експресії гена hBD-2 відбувається не лише за класичним механізмом (у відповідь на бактеріальну інфекцію), а й внаслідок дії факторів росту. Натомість аденовірусна інфекція не впливає на цей показник.

Експресія гена ЕФР-Р та рівень фосфорилювання ЕФР-Р за умов індукції експресії гена hBD-2.

Наведені вище дані свідчать про існування взаємозв'язку між експресією гена hBD-2 та функціонуванням ЕФР-рецептору. У зв'язку з цим в даній серії експериментів логічним було дослідити рівень експресії генів, що кодують ЕФР-рецептор. Встановлено, що в клітинах лінії А431 транскрибується ген erbB1, рівень експресії якого не змінюється при експресії гена hBD-2, індукованій ЕФР

I) 1-4 - 0, 2, 4, 6 год інкубації клітин в присутності ЕФР, 5 - стандарт розміру ДНК pUC19/MspI.

II) 1 - фрагмент кДНК гена erbB1, 2 - стандарт розміру ДНК pUC19/MspI, 3 - продукти рестрикції HaeIII фрагмента кДНК гена erbB1.

Наступною задачею було дослідження динаміки змін рівня фосфорилювання як показника функціональної активності ЕФР-р за умов експресії гена hBD-2. Експерименти по визначенню рівня фосфорилювання ЕФР-Р в клітинах лінії А431, що інкубувалися з культурою B.subtilis, ЕФР чи ЛПС були проведені двома способами: протягом короткого проміжку часу (30 хв.), поки експресія гена hBD-2 ще не детектується, та протягом довготривалої експозиції (24 год), коли вже секретується b-дефенсин-2.

Було встановлено, що інкубація клітин лінії А431 з цими ефекторами на протязі 30 хв призводила до активації кінази ЕФР-Р в усіх випадках.

Другий експеримент продемонстрував, що в клітинах лінії А431, що інкубували добу з ЛПС чи стерилізованими кип'ятінням клітинами B.subtilis, а потім вносили на 30 хв ЕФР, рівень аутофосфорилювання ЕФР-Р є значно нижчим, ніж у контрольних клітинах, що росли 24 год без індукторів (трек 1-3). Показано, що довготривала експозиція клітин лінії А431 цим же чинникам (треки 2-6) призводить до накопичення одного й того ж білкового продукту, фосфорильованого по тирозину, що має молекулярну масу ”35-40 кДа. Даний фосфорильований інтермедіат швидше за все має спорідненність до р38 (МАРК38), оскільки останні дані літератури (Krisanaprakornkit et. al., 2002) свідчать, що наслідком інгібування р38 є блокування експресії гена hBD-2.

Отримані дані вказують на те, що інкубація клітин з бактеріальними агентами та лігандами ЕФР-рецептору має наслідком активацію ЕФР-рецептору, яка, в свою чергу, призводить до індукції транскрипції гена hBD-2. Натомість, ці дані свідчать, що секреція бета-дефенсину-2 пригнічує фосфокіназну активність ЕФР-р. В той же час з даних літератури відомо, що уповільнення проліферації клітин є наслідком пригнічення фосфокіназної активності ЕФР-рецептора (Mendelsohn J., Baseiga J., 2000). Таким чином, отримані факти дозволяють припустити, що експресія hBD-2 має безпосереднє відношення до регуляції проліферації клітин в умовах надлишку факторів росту.

Експресія генів дефенсинів в злоякісних новоутвореннях шийки матки та вульви людини.

Отримані результати стосовно експресії генів дефенсинів in vitro в пухлинних клітинах ліній А431 та М-НeLa спонукали до проведення експериментів по визначенню рівня експресії генів дефенсинів в злоякісних новоутвореннях шийки матки та вульви людини. З літературних даних відомо, що пухлинні клітини шийки матки та вульви людини характеризуються підвищеною продукцією факторів росту. Дані, отримані in vitro, свідчать про залежність експресії hBD-2 в пухлинних клітинах від дії ЕФР/ТФР-a. Тому було логічним проаналізувати експресію генів дефенсинів і, особливо, hBD-2 в пухлинних клітинах in vivo.

В даній серії експериментів було досліджено експресію генів дефенсинів hBD-1, hBD-2 та HD-6, а також гена ЕФР-р в хірургічно видалених пухлинах вульви та пухлинах шийки матки в порівнянні з такою ж в нетрансформованій тканині тих же паціентів, що видалялася під час операції, згідно правил проведення операцій такого типу.

В усіх досліджених зразках пухлин вульви та шийки матки виявлено високий рівень експресії гена hBD-2, на відміну від макроскопічно незмінених тканин де експресія гена hBD-2 не реєструється. В більшості випадків (”70%) в зразках пухлинної тканини рівень експресії гена hBD-1 був підвищеним у порівнянні з таким в зразках нормальних тканин. Достовірної закономірності рівня експресії гена НD-6 в пухлинній тканині в порівнянні з нормальною не виявлено.

Визначення експресії генів ЕФР-р в зразках нормальної та трансформованої тканини вульви і шийки матки виявило значне підвищення рівня експресії гена ЕФР-р у пухлинній тканині.

Таким чином, злоякісно трансформований епітелій вульви та шийки матки, на відміну від нормального епітелія тих же органів, характеризується підвищеним рівнем експресії генів hBD-1 та ЕФР-р і наявністю експресії гена hBD-2. Відомо, що пухлини цієї локалізації характеризуються підвищеною продукцією ЕФР, результатом чого і є гіперекспресія гена ЕФР-р. Результати, отримані нами in vitro та in vivo, дозволяють припустити, що експресія гена hBD-2 пов'язана з локальною відповіддю клітин на фактори росту, що в свою чергу є фізіологічним захисним механізмом проти неконтрольованої проліферації злоякісно трансформованих клітин.

Висновки

1. Встановлено, що культивовані пухлинні клітини епітеліального походження КВ, M-HeLa, А431та сублінія А431/1522 конститутивно експресують ген HD-6, а лінії КВ, А431та сублінія А431/1522 також і ген hBD-1; Т-лімфоїдні пухлинні клітини CCRF-CEM та Molt-4 експресують ген HD-6, а клітинна лінія гліобластоми U251 - гени HNP-1 та HNP-3.

2. Показано, що експресія гена hBD-2 в клітинах ліній M-HeLa та А431 індукується не лише внаслідок дії бактеріальних агентів, а й внаслідок дії на клітини факторів росту, а рівень експресії генів HD-6 та hBD-1 при дії вказаних чинників залишається незмінним.

3. Продемонстровано, що експресія гена hBD-2 в клітинах ліній А431 та M-HeLa не індукується у відповідь на аденовірусну інфекцію in vitro.

4. Встановлено, що інкубація клітин лінії А431 не лише з факторами росту, але й з бактеріальними агентами (B.subtilis, ЛПС) призводить до підвищення фосфокіназної активності рецептора ЕФР, що в свою чергу призводить до транскрипції гена hBD-2, а спільною ланкою цих процесів є накопичення інтермедіата з молекулярною масою 38-40 кД, фосфорильованого за тирозином.

5. Визначено, що індукція транскрипції гена hBD-2 призводить до зменшення проліферативного потенціалу злоякісно трансформованих клітин, за рахунок зниження фосфокіназної активності ЕФР-р.

6. Показано, що клітини пухлин вульви та шийки матки людини характеризуються в більшості випадків підвищеним рівнем експресії гена hBD-1 та наявністю експресії гена hBD-2, яка асоційована з гіперекспресією ЕФР-Р.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Лісовський І.Л., Хобта А.І., Солдаткіна М.А., Литвин Д.І., Маркеєва Н.В., Сидорик Л.Л., Погрібний П.В. Експресія гена дефенсину-6 (HD-6) у лініях пухлинних клітин людини// Биополимеры и клетка.- 2000.- Т.16, №6.- С.525-529. (Самостійно проводив виділення РНК та постановку реакції зворотньої транскрипції).

2. I.L. Lisovskiy, M.A. Soldatkina, D.I. Lytvyn, N.V. Markeeva, O.V. Turchak, S.V. Nespryad'ko, A.B. Vinnitskaya, P.V. Pogrebnoy. Expression of defensin genes in A431 and M-HeLa cell lines and in tumors of human vulval and cervical carcinoma// Эксперим. онкол.-2001.- Т.23, №2.- С. 119-122. (Самостійно провів дослідження спектру експресії генів дефенсинів методом ЗТ-ПЛР).

3. Hobta A.I., Lisovskiy I.L., Mikhalup S.V., Kolybo D.V., Romaniouk S.I., Soldatkina M.O., Markeeva N.V., Garmanchouk L.V., Sydorenko S.P., Pogrebnoy P.V. Epidermoid carcinoma derived antimicrobial peptide (ECAP) inhibits phosphorylation by protein kinases in vitro// Cell Biochem. Func.- 2001.- Vol. 19, №4.- P. 291-299. (Самостійно проводив аналіз бактерицидної активності препаратів культурального середовища клітин А431).

4. I.L. Lisovskiy, M.A. Soldatkina, D.I. Lytvyn, N.V. Markeeva, O.V. Turchak, S.V. Nespryad'ko, A.B. Vinnitskaya, L.N. Nosach, O.U. Povnitsa, P.V. Pogrebnoy. Pattern of expression of b-defensin-2 (hBD-2) and EGFR mRNA in malignant cells of human cervix and vulvae// Эксперим. онкол.-2001.- Т.23, №4.- С. 248-252. (Самостійно проводив визначення експресії гена hBD-2 методом ЗТ-ПЛР).

5. Лісовський І.Л., Солдаткіна М.О., Погрібний П.В. Експресія генів дефенсинів в пухлинах генітальної системи людини / Матеріали 10 з'їзду онкологів України, Крим, 10-12 жовтня, 2001.- С. 45.

6. Lisovskiy I.L., Hobta A.I., Soldatkina M.I., Pogrebnoy P.V. Detection of expression of beta defensin gene in human tumor cells / “Онкология 2000”: Тезисы II съезда онкологов стран СНГ, Украина, Киев, 23-26 мая, 2000.// Exp. Oncol.- Vol. 22 (Suppl.).- №145.

7. Lisovskiy I., Hobta A., Soldatkina M., Garmanchouk L., Markeeva N., Lytvyn D., Pogribnyi P. Detection of mRNA for beta-defensin 2 in human cell lines of epithelial origin / 18th International Congress of Biochemistry and Molecular Biology, UK, Birmingham, 16-20 July, 2000.- № 525.

8. Lisovskiy I.L., Soldatkina M.A., Lytvyn D.I., Markeeva N.V., Nosach L.N., Povnitsa O.U., Pogrebnoi P.V. Expression pattern of defensin genes in cervical and vulval cancer cells / International Symposium Intracellular Signalling in Plant and Animal Systems, Ukraine, Kyiv, 9-14 September, 2001.- P. 76.

9. Лісовський І.Л., Солдаткіна М.О., Литвин Д.І., Шніцар В.М., Маркеєва Н.В., Сєров С.М., Погрібний П.В. Гіперекспресія трансформуючого фактору росту a та механізми контролю росту клітин лінії А431/1522 / “Шляхи та перспективи розвитку експериментальної онкології в Україні” під. ред. Чехуна В.Ф.// “Діа”, Київ, 2001.- С. 70-77.

Анотація

Лісовський І.Л. Експресія генів дефенсинів в клітинах злоякісних пухлин людини. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія. - Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАН України, Київ, 2002.

Дисертацію присвячено вивченню конститутивної експресії генів дефенсинів в клітинах злоякісних пухлин людини різного гістогенезу, умов індукції експресії гена hBD-2 в клітинах ліній А431 та М-HeLa та впливу таких умов на функціональний стан ЕФР-рецептору.

В експериментальних дослідженнях встановлено, що злоякісно трансформовані клітини різного гістогенезу характеризуються певним спектром конститутивної експресії генів дефенсинів. Встановлено, що в пухлинних клітинах епітеліального походження експресія гена hBD-2 індукується у відповідь на бактеріальну інфекцію та дію ЕФР/ТФР-a, але не індукується у відповідь на вірусну інфекцію. Показано, що внаслідок пролонгованого впливу бактеріальної інфекції та факторів росту активується один і той же внутрішньоклітинний сигнальний каскад, результатом чого є індукція експресії гена hBD-2. Виявлено, що за умов довготривалої дії на клітини лінії А431 як факторів росту, так і бактеріальних агентів, фосфокіназна активність ЕФР-рецептору помітно знижується. Можливим чинником цього ефекту може бути активована продукція hBD-2.

Встановлено, що в пухлинному епітелії вульви та шийки матки, на відміну від нормального епітелію, гіперекспресовано ген hBD-1 та активовано транскрипцію гена hBD-2, яка асоційована з гіперекспресією ЕФР-рецептору.

Ключові слова: дефенсини, ген hBD-1, ген hBD-2, епідермальний фактор росту, ЕФР-рецептор, пухлинний епітелій вульви та шийки матки, експресія генів, фосфокіназна активність ЕФР-рецептору.

Аннотация

Лисовский И.Л. Экспрессия генов дефенсинов в клетках злокачественных опухолей человека. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07. - онкология. - Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им. Р.Е. Кавецкого НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертация посвящена изучению экспрессии генов дефенсинов, которые постоянно экспрессируются в опухолевых клетках человека различного гистогенеза, а также условий индукции экспрессии гена hBD-2 в клетках линий A431 и M-HeLa и влияния этих условий на функциональное состояние ЭФР-рецептора.

В экспериментальных исследованиях установлено, что опухолевые клетки человека характеризируются постоянной экспрессией определенного спектра генов дефенсинов. Установлено, что в опухолевых клетках эпителиального происхождения линий А431 и M-HeLa экспрессия гена hBD-2 индуцируется в ответ на бактериальное воздействие, но не в ответ на действие вирусной инфекции. Продемонстрировано, что в клетках линий А431 и M-HeLa экспрессия гена hBD-2 индуцируется не только вследствие бактериального воздействия, но и в ответ на стимуляцию клеток факторами роста (ЭФР, ТФР-a). Полученные результаты свидетельствуют о том, что воздействие на клетки как бактериальной инфекции, так и факторов роста приводит к инициации одного и того же внутриклеточного сигнального каскада, результатом чего является индукция экспрессии гена hBD-2. Установлено, что воздействие на клетки линий А431 и M-HeLa как бактериальной культуры, так и факторов роста на протяжении длительного времени приводит к заметному снижению фосфокиназной активности ЭФР-рецептора, следствием чего может быть активированная продукция бета-дефенсина-2.

Установлено, что в злокачественно опухолевом эпителии вульвы и шейки матки человека, в отличие от нормального эпителия того же гистогенеза, экспрессирован ген hBD-2 и гиперэкспрессирован ген hBD-1, что коррелирует с повышенной экспрессией гена ЭФР-рецептора.

Ключевые слова: дефенсины, ген hBD-1, ген hBD-2, эпидермальный фактор роста, опухолевый эпителий вульвы и шейки матки, экспрессия генов, фосфокиназная активность ЭФР-рецептора.

Summary

Lisovskiy I.L. Expression of defensin genes in the cells of human malignant tumors.- Manuscript.

Dissertation for the degree of Candidate of Biological Sciences on speciality 14.01.07 - oncology.- R.E. Kavetsky Institute of Experimental Pathology, Oncology and Radiobiology NAS of Ukraine, Kyiv, 2002.

The dissertation is devoted to the study of the constitutive expression of defensin genes in malignantly transformed human cells of different origin, pattern of induction of hBD-2 gene expression in A431 and M-HeLa cells and its influence on the functional status of EGF receptor.

The experimental research revealed that malignantly transformed human cells of different origin may be characterized by special spectrum of constitutively expressed defensin genes. It was shown that upon the challenge of epithelial cells with bacterial but not viral agents or EGF/TGF-a the of hBD-2 gene expression was induced. The experimental data revealed also that prolongated incubation of A431 cells with growth factors or bacteria activates the same signal transduction pathway which results in the induction of hBD-2 mRNA expression. It was found out also that after prolongated incubation of A431 cells with bacterial agents or growth factors the phosphokinase activity of EGF receptor is significantly decreased. It was hypothetized that this phenomenon may be caused by activated hBD-2 production.

It was demonstrated that the expression of hBD-2 gene, and overexpression of hBD-1 mRNA is typical for the cells of human cervical and vulval tumors but not for normal cells of that origin and those patterns of beta-defensin gene expression are associated with overexpression of EGFR mRNA.

Key words: defensin, hBD-1 gene, hBD-2 gene, epidermal growth factor, tumor of cervix and vulvae, gene expression, phosphokinase activity of EGF receptor.

Размещено на Allbest.ru