Роль ендотоксину грамнегативної мікрофлори в цитокіновій регуляції активності клітинних факторів неспецифічного імунного захисту, фібринолізу і протеолізу

Размещено на http://www.allbest.ru/

МІНІСТЕРСТВО ОХОРОНИ ЗДОРОВ'Я УКРАЇНИ

ТЕРНОПІЛЬСЬКА ДЕРЖАВНА МЕДИЧНА АКАДЕМІЯ ІМ. І.Я. ГОРБАЧЕВСЬКОГО

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук

РОЛЬ ЕНДОТОКСИНУ ГРАМНЕГАТИВНОЇ МІКРОФЛОРИ В ЦИТОКІНОВІЙ РЕГУЛЯЦІЇ АКТИВНОСТІ КЛІТИННИХ ФАКТОРІВ НЕСПЕЦИФІЧНОГО ІМУННОГО ЗАХИСТУ, ФІБРИНОЛІЗУ І ПРОТЕОЛІЗУ

Спеціальність: Патологічна фізіологія

КУЗНЄЦОВА ОЛЕКСАНДРА ВОЛОДИМИРІВНА

Тернопіль, 2002 рік

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Актуальність теми визначається тим, що грамнегативна ендотоксинемія має патогенетичне значення не тільки при тяжкий інфекційній патології - сепсисі та інфекційно-токсичному шоці, але і відіграє провідну роль у патогенезі імунопатологічних станів при алергічних та автоімунних процесах, дисбактеріозах, захворюваннях печінки серця, легень і нирок. Системна ендотоксинемія виникає при опіках (T. Suguira et al., 1995), антибіотикотерапії (F. Dalrt, 1996), важких фізичних навантаженнях (A.E. Jeukendrup et al., 2000).

Консервативно-еволюційний поліфункціоналізм молекули ліпіду А характеризується ушкоджуючими ефектами ліпополісахаридів (ЛП) грамнегативної мікрофлори (ГМ) на рівні ендотеліоцитів судинного русла (R. Motterlini et al., 1998, K. Matsumura et al., 1998), в механізмі ураження яких велике значення належить кисневим радикалам (R.P. Brandes et al., 1999, S. Basn, M. Ericson, 2000), що утворюються при активації iндуцибільної NO-синтази (A.C. Sharma et al., 1997, T. Kovalenko et al., 1999). Підсилення генерації макрофагами NO- під впливом ЛП ГМ лежить в основі ушкодження сурфактантної системи легень (W.W. Htain et al., 1997, P.R. Miles et al., 1999, J.R. Wright et al., 1999), астроцитів мікроглії кори головного мозку (V.A.M. Vincent et al., 1998), нефроцитів (M.M. Hellemeesch et al., 1999), кардіоміоцитів і гепатоцитів (K. Fukuzawa et al., 1998). Патологічні ефекти ендотоксину включають також активацію протеолізу з розвитком негативного азотистого балансу (T. Vary et al., 1998), порушення обміну ліпідів і вуглеводів (L. Balteskard et al., 1995), активацію тромбоцитарно-судинного і коагуляційного гемостазу за пригнічення плазмового і тканинного фібринолізу (В.Г. Лиходед и др., 1996). Генералізоване порушення мікроциркуляції за системної ендотоксинемії зменшує функціональні резерви нирок (N. Hiki et al., 1997), серця (Э.А. Бардахчьян и др., 1998, X. Meng et al., 1998), печінки (R.A. Memon et al., 1998, K. Toshima et al., 1998), тимуса і селезінки (Y.L. Pan et al., 1997, J. Kondrup, S. Froekjaer, 1999) та сприяє ушкодженню бар'єрних структур кишечника (S. Khalil et al., 1997, D.W. Vercer et al., 1998, N.B. Osman et al., 1998), що замикає порочне коло патологічних ефектів ліпополісахаридів грамнегативної мікрофлори.

Успіхи у вивченні біології ендотоксинів і патофізіології ендотоксинемії ознаменувалися відкриттям ролі цитокінів у реалізації ефектів ЛП ГМ. Установлено, що ендотоксин у здорових волонтерів збільшує вміст у крові інтерлейкіну (ІЛ)-1Я, фактора некрозу пухлин (ФНП) ? та ІЛ-6 (R. De Ryk et al., 1997). Показано, що активація протеолізу при сепсисі опосередкована ІЛ-6 (A. Williams et al., 1998). Ліпід А впливає на сироватковий рівень розчинних рецепторів ІЛ-2 (J. Hokl et al., 1996), діє на ЦНС через індукцію синтезу ІЛ-1Я (В.М. Клименко, О.Е. Зубарева, 1999), підвищує концентрацію в плазмі крові ІЛ-1Я, ФНП?, ІЛ-6, ІЛ-8, ІЛ-10 та ІЛ-12 за септичних станів (A. Boelen et al., 1996, M.G. Bouma et al., 1997, L.R. Leon et al., 1999, S.R. Chavali et al., 1998, U. Muller-Weidan, K. Wedan, 2000), дозозалежно стимулює синтез та секрецію ІЛ-2 та ІЛ-4 клітинами селезінки, брижових лімфовузлів і пеєрових бляшок (A. Estrada et al., 1998).

Крім того, ЛПГМ відіграють провідну роль у гемокоагуляційних порушеннях у пацієнтів з інфекціями (А.М. Полякова и др., 1999), володіють прямою імуносупресивною активністю (Е.В. Борисова, 1999), впливають на фагоцитарну активність макрофагів (Л.Г. Зайцева и др., 2000), мають імуногенні властивості, є ключовим фактором у патогенезі ендотоксинового шоку (И.М. Салахов и др., 1998), який нерідко завершується поліорганною недостатністю (Э.А. Бардахчьян и др., 1999).

Водночас, цілий ряд аспектів проблеми грамнегативної ендотоксинемії залишається не вирішеним. Перш за все, це питання, що пов'язані з визначенням ролі цитокінів в ендотоксин-індукованих порушеннях регуляції імунологічної реактивності.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація є фрагментом фундаментальної пріоритетної наукової роботи центральної науково-дослідної лабораторії Буковинської державної медичної академії (Чернівці) “Вивчити вікові особливості взаємозв'язку центральних і периферійних механізмів регуляції імунологічної реактивності та гемокоагуляційного потенціалу в нормі і при ендо- та екзогенних інтоксикаціях” (номер державної реєстрації 0199U004598), в якій дисертант безпосередньо розробила та патогенетично обґрунтувала спосіб спрямованої корекції порушень цитокінової регуляції неспецифічної імунної відповіді за умов кишкового дисбактеріозу на підставі вивчення впливу системної ендотоксинемії на функціональну активність фагоцитів крові, інтенсивність тканинного фібринолізу, протеолізу та ліпопероксидації.

Мета роботи.

Розробити та патогенетично обґрунтувати спосіб спрямованої корекції порушень цитокінової регуляції неспецифічної імунної відповіді за умов кишкового дисбактеріозу на підставі вивчення впливу системної ендотоксинемії на функціональну активність фагоцитів крові, інтенсивність тканинного фібринолізу, протеолізу та ліпопероксидації.

Для досягнення мети необхідно було вирішити такі задачі:

1. Вивчити зміни вмісту в крові прозапальних цитокінів (ІЛ-1Я та ФНП?), функціональної активності фагоцитів крові, інтенсивності тканинного фібринолізу та протеолізу за внутрішньо-очеревинного та внутрішньовенного введення ендотоксину грамнегативної мікрофлори;

2. Визначити зміни вмісту в крові прозапальних цитокінів (ІЛ-1Я та ФНП?), функціональної активності фагоцитів крові, інтенсивності тканинного фібринолізу, протеолізу та ліпопероксидації за внутрішньо-очеревинного та внутрішньовенного введення ЛПГМ сплен- і тимектомованим щурам;

3. Дослідити вплив спленіну і білкової фракції гомогенатів автоселезінки на вміст у крові прозапальних цитокінів (ІЛ-1Я та ФНП?), функціональну активність фагоцитів крові, інтенсивність тканинного фібринолізу, протеолізу та ліпопероксидації в спленектомованих щурів;

4. Визначити зміни вмісту в крові прозапальних цитокінів (ІЛ-1Я та ФНП?), функціональну активність фагоцитів крові, інтенсивність тканинного фібринолізу, протеолізу та ліпопероксидації в щурів з експериментальним дисбактеріозом;

5. Розробити і патогенетично обґрунтувати спосіб комплексної корекції порушень цитокінової регуляції (ІЛ-1Я та ФНП?) неспецифічної імунологічної реактивності в щурів з експериментальним дисбактеріозом з використанням спленіну та біфіформу.

Об'єкт дослідження: цитокінова регуляція неспецифічної імунологічної реактивності. Предмет дослідження: прозапальні цитокіни (ІЛ-1Я, ФНП?), функціональна активність моноцитів-макрофагів і нейтрофілів, протеоліз, фібриноліз, ліпопероксидація.

Методи дослідження:

- функціональну активність клітинних факторів неспецифічного імунного захисту досліджували шляхом визначення фагоцитарного числа, фагоцитарного індексу та здатності моноцитів-макрофагів і нейтрофілів до генерації активних форм кисню;

- активність гуморальних факторів визначали за інтенсивністю протеолітичної деградації низько-, високомолекулярних білків і колагену;

- для визначення змін фібринолізу досліджували інтенсивність сумарного, неферментативного та ферментативного плазмового і тканинного лізису азофібрину;

- інтенсивність ліпопероксидації в тканинах внутрішніх органів оцінювали за рівнем малонового діальдегіду;

- патогенетичне обґрунтування запропонованого способу корекції порушень неспецифічної імунологічної реактивності в щурів з дисбактеріозом проводили на підставі дослідження впливу біфіформу і спленіну на склад і популяційний рівень кишкової мікрофлори, вміст у крові ІЛ-1Я і ФНП?, функціональну активність мононуклеарних фагоцитів і поліморфноядерних нейтрофілів та інтенсивність фібринолізу і протеолізу;

- аналіз цитокінової регуляції неспецифічної імунної відповіді проводили шляхом визначення сироваткових рівнів ІЛ-1Я і ФНП? в інтактних, спленектомованих, тимектомованих, спленотимектомованих щурів, а також у тварин з дисбактеріозом.

Наукова новизна дослідження. Дістала подальшого розвитку теорія імуногенної ролі ендотоксину грамнегативної сапрофітної мікрофлори кишечника: вперше встановлено, що за портальної ендотоксинемії в крові зростає вміст ФНП?, тоді як системна ендотоксинемія характеризується одночасним збільшенням сироваткових рівнів ІЛ-1Я і ФНП?.

Уперше показано, що підвищення концентрації в крові ФНП? за внутрішньо-очеревинного введення ендотоксину супроводжується активацією системи мононуклеарних макрофагів, а підвищення вмісту в сироватці крові ІЛ-1Я асоційюється зі збільшенням активності поліморфноядерних лейкоцитів.

Установлена невідома раніше закономірність підвищення сироваткових концентрацій ІЛ-1Я і ФНП? після спленектомії, що відбувається за збільшення функціональної активності нейтрофілів і моноцитів-макрофагів, інтенсифікації фібринолізу, протеолізу і ліпопероксидації, а в разі розвитку системної ендотоксинемії змінюється зниженням вмісту в крові прозапальних цитокінів, активності фагоцитуючих клітин крові та пригніченням плазмового і тканинного протеолізу.

Порушення неспецифічного імунного захисту в тимектомованих тварин характеризуються зниженням здатності поліморфноядерних лейкоцитів до генерації активних форм кисню, що асоціюється зі зменшенням сироваткової концентрації ІЛ-1Я.

Уперше показано, що в щурів з експериментальним дисбактеріозом зміни порожнинної і мукозної мікрофлори тонкої і товстої кишок супроводжуються зниженням сироваткових рівнів ІЛ-1Я і ФНП? за пригнічення функціональної активності фагоцитуючих мононуклеарів і нейтрофілів, особливо в спленектомованих тварин.

Установлено, що білкова фракція гомогенату селезінки пригнічує функціональну активність фагоцитів крові і знижує інтенсивність плазмового і тканинного протеолізу та ліпопероксидації, тоді як спленін підвищує неспецифічну імунологічну реактивність.

Розроблений спосіб спрямованої корекції порушень мікробіоценозу кишечника та неспецифічного імунного захисту організму в щурів з експериментальним дисбактеріозом, ефективність якого патогенетично обґрунтована результатами дослідження впливу біфіформу і спленіну на кишкову мікрофлору та цитокінову регуляцію неспецифічної імунологічної реактивності.

Практичне значення отриманих результатів. Результати дисертаційного дослідження дозволяють науково обґрунтувати причинно-наслідковий зв'язок між процесами, які призводять до порушень неспецифічної імунологічної реактивності за системної ендотоксинемії, і є основою для клінічної розробки способів профілактики “післяспленектомічного гіпоспленізму” та лікування кишкових дисбактеріозів із застосуванням біфіформу і спленіну, спрямованих на покращання цитокінової регуляції системи неспецифічного імунного захисту організму.

Результати роботи впроваджені (акти впровадження) на кафедрах патологічної фізіології Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця, Одеського державного медичного університету, Тернопільської державної медичної академії ім. І.Я. Горбачевського, Вітебського державного університету, Буковинської державної медичної академії, на кафедрі нормальної фізіології Запорізького державного медичного університету, на кафедрі нормальної та патологічної фізіології Ужгородського національного університету, на кафедрі зоології та фізіології Чернівецького національного університету ім. Ю. Федьковича, в Чернівецькому ДП НДІ медико-екологічних проблем, у Буковинському інституті агропромислового виробництва, на кафедрі зоології Криворізького педагогічного університету, в ЦНДЛ Буковинської державної медичної академії.

Особистий внесок здобувача. Автором особисто здійснено розробку основних теоретичних і практичних положень роботи, проведено аналіз літературних джерел, патофізіологічні дослідження.

Самостійно провела набір і обробку фактичного матеріалу, написала всі розділи дисертації. Висновки і практичні рекомендації сформульовані сумісно з науковим керівником. У 6-ти наукових працях, опублікованих зі співавторами, самостійно зібрано матеріал, здійснено огляд літератури за темою, проведено статистичну обробку даних, зроблено узагальнення та сформульовані висновки. При підготовці 6-ти праць, які опубліковані у співавторстві, використано експериментальний матеріал, огляд літератури, статистичні дані автора.

Апробація матеріалів дисертації. Основні положення дисертації оприлюднені на науково-практичній конференції “Фізіологія та патофізіологія перекисного окислення ліпідів, гемостазу та імуногенезу” (Полтава, 1999), на ІV Міжнародному медичному конгресі студентів і молодих вчених (Тернопіль, 2000), на Міжнародному симпозіумі “Актуальні питання медичної допомоги населенню” (Чернівці, 2000), на науковій конференції студентів і молодих вчених Національного медичного університету ім. О.О. Богомольця з міжнародною участю (Київ, 2001), на VІ з'їзді Всеукраїнського лікарського товариства (Чернівці, 2001), на Всеукраїнській науково-практичній конференції “Ліки-людині” (Харків, 2001), на міжнародній конференції “Проблемы здоровья семьи” (Мармарис, Турция, 2001), на науково-методичній конференції “Практичне заняття у підготовці лікарів і провізорів” (Київ, 2001), на науковій конференції “Історія та сучасні досягнення фізіології в Україні” (Київ, 2001), на науковій конференції, присвяченій 100-річчю з дня народження Я.П. Склярова (Львів, 2001) на підсумкових наукових конференціях співробітників БДМА (Чернівці, 1999-2001).

Публікації. За темою дисертації опубліковано 15 наукових праць, з них 5 - у фахових виданнях, рекомендованих ВАК України.

Структура та обсяг дисертації. Робота викладена на 212 сторінках і складається з вступу, огляду літератури, опису методів дослідження, чотирьох розділів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, рекомендацій щодо наукового і практичного використання здобутих результатів, списку використаних джерел літератури, додатків. Основний зміст дисертації викладено на 139 сторінках машинописного тексту, робота ілюстрована 56 таблицями, 41 рисунком. Список літератури включає 323 джерел, з них 199 - іноземних авторів.

2. ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

У роботі використано 236 самців рендомбредних автобредних білих щурів від племядра 4 категорії (SPF) масою тіла 0,14-0,16 кг. (НДІ МЕП МОЗ України). Усі тварини відповідали 4 класу чистоти за мікробіологічним, вірусологічним та паразитологічним статусом і знаходилися на стандартному раціоні, в стабільних умовах утримання (ОСТ 1-88 “Тварини лабораторні. Технологічний процес”). Спленектомію виконували за Г.Ю. Стручко (1998), тимектомію - за Ю.В. Галкіним, В.Г. Добкіним (1975), декапітацію щурів здійснювали через 2 тижні після операції, під нембуталовим наркозом.

Експериментальний дисбактеріоз моделювали шляхом внутрішньо-шлункового введення тетрацикліну в дозі 5 мг/кг маси тіла впродовж 7 днів (В.Г. Лиходед и др., 1998). Грамнегативну портальну або системну ендотоксинемію моделювали шляхом внутрішньо-очеревинного (в/оч) або внутрішньовенного (в/в) - в яремну вену введення сальмонельозного ендотоксину (штам Salmonella typhimurium 1468 із колекції Київського НДІ епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського) в дозі 10 мкг на кг. маси за 4 і 2 год до декапітації щурів.

Для лікування дисбактеріозу та корекції порушень неспецифічної імунологічної реактивності використовували бактерійний препарат біфіформ (“Ferrosan”, Данія) та імуностимулятор спленін (“Дарница”, Україна). Біфіформ призначали по одній капсулі, вміст якої (107 Bifidobacterium longum та Enterococcus faecium) одноразово вводили внутрішньошлунково металевим зондом щоденно впродовж 7 днів. Спленін та білкову фракцію гомогенату селезінки, отриману шляхом екстракції на мікроколонках C2 AmprepTM (Велика Британія), вводили протягом тижня внутрішньом'язово в дозі 0,5 мл/кг маси тіла.

Дослідження вмісту прозапальних цитокінів - інтерлейкіну-1Я (ІЛ-1Я) і фактора некрозу пухлин ? (ФНП?) в сироватці крові проводили на імуноферментному аналізаторі “Униплан-М” (Росія) за допомогою наборів реагентів “РrоСоn IL-1Я” для визначення ІЛ-1Я та “РrоСоn ТNF?” для визначення ФНП? (OOO “Протеиновый контур”, Росія). Протеолітичну активність плазми крові і тканин внутрішніх органів визначали за лізисом азоальбуміну, азоказеїну та азоколу (К.Н. Веремеенко и др., 1988), інтенсивність фібринолізу - за лізисом азофібрину (О.Л. Кухарчук, 1996). Вміст у тканинах внутрішніх органів малонового діальдегіду (МДА) досліджували за методикою І.Д. Стальної, Т.Г. Гарішвілі (1975). Для виділення нейтрофілів і макрофагів використовували пробірки “Vacutainer CPTTM” фірми “BECTON DICKINSON” (США). Фагоцитарне число (ФЧ) і фагоцитарний індекс (ФІ) визначали загальноприйнятими методами (А.В. Караулов, 1999). Окислювальний метаболізм нейтрофілів і моноцитів-макрофагів досліджували методом хемілюмінесценції (J.A. Metcalf et al., 1986) на хемілюмінометрі “ПХЛ-1” (Росія).

Ентеробактерії вирощували на середовищах Ендо, Левіна, Плоскірєва. Ідентифікацію чистих культур проводили за стандартними методиками (W.N. Ewing, 1972, W.N. Ewing, W.J. Martin, 1974, И.Н. Блохина и др., 1992). Патогенні варіанти ешерихій визначали за здатністю продукувати гемолізин, а також серологічним методом. Виділення дріжджеподібних грибів роду Candida здійснювали на середовище Сабуро, біфідобактерій - на середовищі “Бактофок-МП” (И.В. Критская и др., 1995). Анаеробні аспорогенні бактерії вирощували на середовищі “КДБ” у стаціонарному анаеростаті “СО2 - incubator Т-125” фірми “ASSAB Medicin AB” (Швеція) за стандартними методиками (М.Э. Микельсаар и др., 1990). Анаеробні спорогенні мікроорганізми культивували в середовищі Кітта-Тароцці та на кров'яно-цукровому агарі Цейсслера (М.О. Биргер, 1982).

Результати досліджень опрацьовували методами варіаційного статистичного аналізу з визначенням критерію Стюдента за програмою “BioStat” (С. Гланц, 1999) на PC PENTIUM II. У контрольних тварин рівень у крові ІЛ-1Я більш ніж у 2 рази перевищував вміст ФНП? - відповідно: 37,45 ± 2,87 та 17,91 ± 1,82 пг/мл (p < 0,001, n = 22).

Введення ендотоксину в/оч достовірних змін сироваткової концентрації ІЛ-1Я не викликало (40,14 ± 4,07 пг/мл, p > 0,05, n = 22), тоді як рівень ФНП? зростав відносно контролю майже в 3 рази (52,71 ± 5,39 пг/мл, p < 0,001, n = 22). За введення ендотоксину в яремну вену вміст у крові ІЛ-1Я зростав до 152,43 ± 16,26 пг/мл (p < 0,001, n = 22), ФНП? - до 66,14 ± 2,87 пг/мл (p < 0,001, n = 22). Нейтрофіли щурів, яким ендотоксин вводили в/оч, не змінювали хемілюмінесценцію (ХМЛ) у системі люменофору (в контролі - 4,56 ± 0,56, у досліді - 4,91 ± 0,72 мВт/ хв, p > 0,05, n = 22), тоді як нейтрофіли тварин, що отримували ліпополісахарид (ЛПС) в/в збільшували її до 19,61 ± 1,45 мВт/хв (p < 0,001, n = 22). Моноцити (Мц) контрольних тварин викликали ХМЛ, яка становила 3,36 ± 0,45 мВт/хв (n = 11), Мц щурів, що отримували ендотоксин в/оч, підвищували інтенсивність ХМЛ до 8,75 ± 1,12 мВт/хв (p < 0,001, n = 22), а Мц щурів, яким ЛПС вводили в/в - до 9,68 ± 1,35 мВт/хв (p < 0,001, n = 22).

Функціональна активність фагоцитів зростала в обох випадках: ФЧ у контролі становило 43,52 ± 3,71% (n = 11), а після введення ендотоксину в/оч та в/в зростало відповідно до 64,22 ± 4,28 (p < 0,001, n = 22) та 69,50 ± 5,03% (p < 0,001, n = 22).

Фагоцитарний індекс у контролі складав 3,22 ± 0,31 ум. од. (n = 11), за введення ендотоксину в черевну порожнину - 6,78 ± 0,35 ум. од. (p < 0,001, n = 22), в яремну вену - 7,12 ± 0,42 ум. од. (p < 0,001, n = 22).

Після в/оч введення ендотоксину сумарна фібринолітична активність (СФА) плазми крові (табл.) зростала в 2,8 разу внаслідок підвищення інтенсивності як неферментативного, так і ферментативного фібринолізу. Лізис низькомолекулярних білків (НМБ) достовірних змін не зазнавав, казеїнолітична активність плазми крові зменшувалася на 17,8%, а лізис колагену підвищувався в 5,5 разу.

За введення ендотоксину в/в СФА плазми крові зростала за рахунок збільшення неферментативної фібринолітичної активності (НФА). Інтенсивність протеолітичної деструкції НМБ збільшувалася на 61,7%, лізис високомолекулярних білків (ВМБ) - на 56,5%, а колагенолітична активність (КА) плазми крові перевищувала контрольний рівень в 1,7 разу.

Табл. - Характеристика змін плазмового фібринолізу і протеолізу за внутрішньо-очеревинного та внутрішньовенного введення щурам ендотоксину грамнегативної мікрофлори (х ± Sx):

Примітки:

рк - ступінь достовірності різниці показників відносно контролю;

р1 - ступінь достовірності різниці показників відносно даних першої групи тварин;

n - кількість спостережень.

Активація тканинного фібринолізу в печінці за введення ендотоксину в/оч відбувалася внаслідок інтенсифікації не ензиматичного лізису фібрину, який зростав у 2,5 разу. Лізис НМБ і ВМБ відповідав контролю, а КА печінкової тканини збільшувалася на 41,9%. За введення ендотоксину в/в НФА в печінці підвищувалася лише на 26,3%, а інтенсивність ферментативного і сумарного фібринолізу достовірних змін не зазнавала, так само, як і лізис НМБ і ВМБ. Підвищення тканинного колагенолізу становило 19,4%. У легенях за введення ендотоксину в/оч СФА зростала в 1,6 разу, що було зумовлено збільшенням НФА на 68,7% і ферментативного фібринолізу - на 49,8%. Інтенсивність протеолітичного розпаду НМБ достовірних змін не зазнавала, тоді як лізис ВМБ підвищувався на 21,1%, а КА легеневої тканини зростала в 2,2 разу. Після введення ендотоксину в яремну вену збільшення СФА в легенях відбувалося внаслідок інтенсифікації не ферментативного фібринолізу, який перевищував контрольні показники в 3,2 разу. Водночас спостерігалося зменшення ферментативної фібринолітичної активності (ФФА) на 24,7%. Інтенсивність лізису НМБ і ВМБ зростала відповідно на 47,4 та 57,3%, що супроводжувалося пригніченням КА легеневої тканини на 18,9%. За введення ендотоксину в/в СФА в наднирниках різко зменшувалася внаслідок дворазового пригнічення ензиматичного лізису фібрину та зниження НФА на 29,7%. Крім того, відбувалося тотальне зниження інтенсивності тканинного протеолізу: відносно контролю лізис азоальбуміну зменшувався в 2,5 разу, лізис азоказеїну - в 2,1 разу, лізис азоколу - в 1,7 разу. У спленектомованих тварин (СЕТ) вміст у крові ІЛ-1Я у 2,6 разу перевищував контрольний рівень - відповідно: 37,45 ± 2,87 та 95,89 ± 11,91 пг/мл (p < 0,001, n = 20), а сироваткова концентрація ФНП? виявилася в 3,4 разу більшою за контрольні показники (17,91 ± 1,82 та 60,11 ± 3,92 пг/мл, відповідно, p < 0,001, n = 20). Введення ендотоксину в/оч призводило до зниження вмісту в крові ІЛ-1Я до 35,73 ± 2,08 пг/мл (p < 0,001, n = 20), тобто у 2,7 разу, тоді як сироватковий рівень ФНП? зменшувався у 4,6 разу (до 13,00 ± 0,83 пг/мл, p < 0,001, n = 20). За введення ЛПС в/в вміст у крові ІЛ-1Я складав 71,00 ± 3,33 пг/мл (p < 0,001, n = 22), ФНП? - 56,86 ± 3,75 пг/мл (p < 0,001, n = 22). Отже, в разі введення ендотоксину в/в сироватковий рівень ІЛ-1Я був у 2,2 разу нижчим (p < 0,001, n = 22), а ФНП?, навпаки, - у 4,4 разу вищим (p < 0,001, n = 22), ніж за введення ЛПС у черевну порожнину.

У СЕТ в крові значно зростала СФА, що було зумовлено підвищенням не ензиматичного лізису фібрину на 58,6% (p < 0,001, n = 30) і збільшенням ФФА в 2,2 разу (p < 0,001, n = 30). Лізис НМБ зростав на 55,6% (p < 0,001, n = 30), ВМБ - у 2 рази (p < 0,001, n = 30), КА плазми - на 45,6% (p < 0,01, n = 30). У серці спостерігалося підвищення як НФА - на 48,3% (p < 0,001, n = 30), так і ФФА - на 51,5% (p < 0,001, n = 30).

Збільшення лізису ВМБ, НМБ і колагену складало відповідно 30,0 (p < 0,001, n = 30), 44,0 (p < 0,001, n = 30) та 42,8% (p < 0,001, n = 30). У легенях підвищення СФА досягало 31,5% (p < 0,001, n = 30), НФА - 29,8% (p < 0,001, n = 30), ФФА - 33,3% (p < 0,001, n = 30), лізису НМБ - 54,8% (p < 0,001, n = 30), ВМБ - 54,0% (p < 0,001, n = 30), колагену - 19,8% (p < 0,001, n = 30). У печінці СФА зростала на 80,8% (p < 0,001, n = 30) внаслідок інтенсифікації як неферментативного, так і ферментативного фібринолізу. Інтенсивність протеолітичної деградації НМБ підвищувалася на 36,4% (p < 0,001, n = 30), ВМБ - на 57,2% (p < 0,001, n = 30), колагену - на 76,1% (p < 0,001, n = 30). У наднирниках СФА збільшувалася на 51,3% (p < 0,001, n = 30), НФА - на 54,5% (p < 0,001, n = 30), ФФА - на 43,9% (p < 0,001, n = 30), а підвищення протеолітичної деструкції НМБ, ВМБ і колагену складало відповідно 35,1 (p < 0,001, n = 30), 38,9 (p < 0,001, n = 30) та 26,8% (p < 0,001, n = 30). СФА ниркової тканини зростала лише на 27,1% (p < 0,001, n = 30), що було зумовлено збільшенням інтенсивності виключно ензиматичного лізису фібрину. Лізис НМБ і ВМБ у тканині нирок зростав відповідно на 53,2 (p < 0,001, n = 30) та 30,5% (p < 0,001, n = 30), а КА підвищувалася на 25,2% (p < 0,001, n = 30). У тимусі відбувалося підвищення СФА на 35,2% (p < 0,001, n = 30) за рахунок збільшення як НФА, так і ФФА - на 37,1 (p < 0,001, n = 30) та 33,2% (p < 0,001, n = 30), відповідно.

Інтенсивність протеолітичної деструкції НМБ зростала на 66,3% (p < 0,001, n = 30), ВМБ - на 28,3% (p < 0,001, n = 30), колагену - на 56,0% (p < 0,001, n = 30). У тканині тонкої кишки СФА підвищувалася в 1,6 разу (p < 0,001, n = 30), НФА - на 70,4% (p < 0,001, n = 30), ФФА - на 58,6% (p < 0,001, n = 30), лізис НМБ - на 85,5% (p < 0,001, n = 30), ВМБ - на 58,9% (p < 0,001, n = 30), колагену - майже в 2 рази (p < 0,001, n = 30).

Введення ендотоксину СЕТ в/оч призводило до зменшення вмісту МДА в серці з 0,351 ± 0,017 до 0,216 ± 0,010 нмоль/г білка (p < 0,001, n = 22), тобто на 38,5%, а за введення ЛПС в/в відбувалося додаткове зниження рівня МДА - на 13,9% (0,186 ± 0,008 нмоль/г білка, p < 0,001, n = 22). У легенях вміст МДА у СЕТ становив 0,429 ± 0,019 нмоль/г білка, після введення ендотоксину в черевну порожнину - 0,325 ± 0,012 нмоль/г білка (p < 0,001, n = 22), в яремну вену - 0,214 ± 0,011 нмоль/г білка (p < 0,001, n = 22). У печінці, навпаки, спостерігалося більш ніж дворазове підвищення рівня МДА: 0,168 ± 0,013, 0,328 ± 0,022 (p < 0,001, n = 22) та 0,393 ± 0,021 нмоль/г білка (p < 0,001, n = 22), відповідно.

У наднирниках достовірне зменшення вмісту МДА відбувалося лише за введення ЛПС в/в: 0,613 ± 0,042 нмоль/г білка у СЕТ, 0,536 ± 0,025 нмоль/г білка після введення ендотоксину в/оч (p > 0,05, n = 22) та 0,465 ± 0,022 нмоль/г білка за введення ендотоксину в яремну вену (p < 0,01, n = 22). У нирках СЕТ рівень МДА під впливом ендотоксину значно зростав і складав відповідно 0,144 ± 0,011, 0,275 ± 0,013 (p < 0,001, n = 22) та 0,324 ± 0,015 нмоль/г білка (p < 0,001, n = 22). У тимусі і тонкій кишці достовірних змін вмісту МДА не спостерігалося. Тимектомія не впливала на рівень у крові ІЛ-1Я (37,45 ± 2,87 пг/мл у контролі, 39,05 ± 3,61 пг/мл у не справжніх оперованих щурів і 42,03 ± 3,84 пг/мл після тимектомії, p > 0,05, n = 21) та ФНП? (17,91 ± 1,82, 16,88 ± 1,53 та 15,00 ± 1,18 пг/мл, відповідно, p > 0,05, n = 21). Після введення ендотоксину тимектомованим тваринам (ТТ) в/оч у сироватці крові зростала концентрація ФНП? (55,57 ± 4,99 пг/мл, p < 0,001, n = 20), тоді як вміст ІЛ-1Я залишався сталим (38,43 ± 4,16 пг/мл, p > 0,05, n = 20), а за введення ЛПС в яремну вену відбувалося підвищення рівня ІЛ-1Я - на 56,3% (65,71 ± 7,71 пг/мл, p < 0,001, n = 20) та ФНП? - у 4,1 разу (61,14 ± 3,25 пг/мл, p < 0,001, n = 20). Нейтрофіли ТТ, яким ЛПС вводили в/оч, не викликали змін інтенсивності ХМЛ (у контролі - 4,56 ± 0,56 мВт/хв, за тимектомії - 4,72 ± 0,69 мВт/хв, у досліді - 4,48 ± 0,29 мВт/хв, p > 0,05, n = 21), так само, як і нейтрофілів щурів, що отримували ендотоксин в/в - 4,51 ± 0,36 мВт/хв (p > 0,05, n = 21). Водночас, Мц ТТ, яким ендотоксин вводили в черевну порожнину, підвищували інтенсивність ХМЛ до 7,98 ± 0,88 мВт/хв (p < 0,001, n = 21), а Мц шурів, яким ЛПС вводили в яремну вену, викликали ХМЛ, що досягала 8,12 ± 0,79 мВт/хв (p < 0,001, n = 21), тоді як за тимектомії ХМЛ складала лише 4,35 ± 0,52 мВт/хв (n = 10). ФЧ у контролі становило 43,52 ± 3,71% (n = 11), у ТТ - 41,00 ± 4,15% (n = 10), а після в/оч та в/в введення ендотоксину зростало відповідно до 68,00 ± 4,73 (p < 0,001, n = 10) та 71,42 ± 4,66% (p < 0,001, n = 11) проти 47,45 ± 3,96% у тварин групи зовнішнього контролю (n = 9). ФІ в контролі складав 3,22 ± 0,31 ум. од. (n = 11), у ТТ - 3,30 ± 0,42 ум. од. (n = 10), за введення ендотоксину в черевну порожнину - 6,92 ± 0,39 ум. од. (p < 0,001, n = 10), за введення ЛПС у системний кровотік - 7,25 ± 0,47 ум. од. (p < 0,001, n = 11). Інтенсивність плазмового протеолізу в ТТ зростала і не змінювалася після введення ендотоксину як в/оч, так і в/в. СФА плазми крові також зростала, але після введення щурам ендотоксину НФА зменшувалася, тоді як ФФА достовірно перевищувала таку в ТТ незалежно від шляхів введення ЛПС.

У СЕТ білкова фракція гомогенату селезінки (БФГС) зменшувала рівень ІЛ-1Я у сироватці крові в 3,3 разу (95,89 ± 12,91 пг/мл у СЕТ та 29,50 ± 2,96 пг/мл після введення БФГС, p < 0,01, n = 20), тоді як вміст ФНП? залишався сталим (60,11 ± 3,92 та 64,50 ± 4,45 пг/мл, відповідно, p > 0,05, n = 20). Водночас, спленін (0,5 мл на кг. маси тіла) викликав підвищення сироваткової концентрації ІЛ-1Я до 174,28 ± 11,56 пг/мл (p < 0,001, n = 20), а рівень у крові ФНП? зростав до 92,74 ± 6,18 пг/мл (p < 0,001, n = 20). Нейтрофіли СЕТ, яким вводили БФГС, не змінювали інтенсивність ХМЛ (4,55 ± 0,33 мВт/ хв, p > 0,05, n = 20), тоді як нейтрофіли тварин, яким вводили спленін, збільшували її до 14,78 ± 0,92 мВт/хв (p < 0,001, n = 20). Подібні зміни спостерігалися і з боку ХМЛ, індукованої Мц спленектомованих щурів: у разі введення БФГС ХМЛ становила 5,39 ± 0,75 мВт/хв (p > 0,05, n = 20), а Мц тварин, яким вводили спленін, підвищували її до 19,45 ± 1,06 мВт/хв (p < 0,001, n = 20). Функціональна активність моноцитів-макрофагів зростала тільки в разі введення щурам спленіну: ФЧ після введення БФГС становило 48,35 ± 3,58% (p > 0,05, n = 20), спленіну - 73,65 ± 3,29% (p < 0,001, n = 20). ФІ складав 3,16 ± 0,21 (p > 0,05, n = 20) та 7,81 ± 0,52 ум. од. (p < 0,001, n = 20), відповідно. БФГС знижувала НФА в плазмі крові СЕТ і різко пригнічувала лізис азоальбуміну, азоказеїну і азоколу. Спленін не впливав на КА крові, але зменшував інтенсивність протеолітичної деструкції НМБ, ВМБ і фібрину. Усі показники плазмового фібринолізу і протеолізу в разі введення спленіну суттєво перевищували такі в щурів, яким вводили БФГС. Подібні зміни спостерігалися з боку фібрино- і протеолітичної активності тканин серця, легень, печінки, нирок, наднирників, тимуса і тонкої кишки.

Порушення колонізаційної резистентності слизової оболонки кишечника (СОК) в щурів з експериментальним дисбактеріозом (ЕДБ), особливо спленектомованих, характеризувалося різким зниженням популяційного рівня лактобактерій, бактероїдів, превотел, аеробних кишкових паличок та ентерококів з елімінацією зі слизової біфідобактерій, а в частини тварин - лактобактерій, ентерококів і кишкових паличок. Відбувалася контамінація СОК пептококами, клостридіями, едвардсіелами, аеробними стрептобацилами та автохтонними факультативними мікроорганізмами. Концентрація ІЛ-1Я у сироватці крові щурів з ЕДБ зменшувалася на 22,2% (37,45 ± 2,87 пг/мл у контролі та 29,14 ± 1,47 пг/мл у досліді, p < 0,05, n = 22), а вміст ФНП? виявляв тенденцію до зниження (17,91 ± 1,82 та 14,14 ± 0,51 пг/мл, відповідно, p > 0,05, n = 22). Дисбактеріоз у СЕТ характеризувався зменшенням сироваткового рівня ІЛ-1Я у 4,4 разу (95,89 ± 12,91 пг/мл у СЕТ і 21,88 ± 2,72 пг/мл у СЕТ з ЕДБ, p < 0,01, n = 22), а концентрація ФНП? у крові знижувалася майже в 5 разів (відповідно: 60,11 ± 3,92 та 12,29 ± 0,52 пг/мл, p < 0,001, n = 22). Інтенсивність ХМЛ, індукованої нейтрофілами щурів з ЕДБ, знижувалася відносно контролю на 30,9% (4,56 ± 0,56 та 3,15 ± 0,17 мВт/хв, відповідно, p < 0,05, n = 22) за відсутності достовірних змін ХМЛ, індукованої Мц (відповідно: 3,36 ± 0,45 та 3,08 ± 0,12 мВт/хв, p > 0,05, n = 22).

У СЕТ дисбактеріоз супроводжувався суттєвим пригніченням генерації активних форм кисню нейтрофілами - інтенсивність індукованої ними ХМЛ зменшувалася в 2,1 разу (5,11 ± 0,26 мВт/хв у СЕТ і 2,49 ± 0,11 мВт/хв у СЕТ з ЕДБ, p < 0,001, n = 22). Спостерігалося зниження ХМЛ, індукованої Мц - на 32,8% (4,05 ± 0,16 та 2,72 ± 0,13 мВт/хв, відповідно, p < 0,001, n = 22). За ЕДБ ФЧ зменшувалося з 43,52 ± 3,71 до 31,25 ± 1,44% (p < 0,01, n = 22), а ФІ знижувався з 3,22 ± 0,31 до 1,83 ± 0,07 ум. од. (p < 0,001, n = 22). У СЕТ з ЕДБ ФІ зменшувалося з 47,92 ± 3,65 до 26,10 ± 1,22% (p < 0,001, n = 22), ФІ - з 3,46 ± 0,17 до 1,62 ± 0,06 ум. од. (p < 0,001, n = 22).

За ЕДБ у легенях щурів з інтактною селезінкою рівень МДА зростав з 0,416 ± 0,021 до 0,591 ± 0,023 мкмоль/г білка (p < 0,001, n = 22), тоді як за ЕДБ у СЕТ відбувалося його зменшення з 0,429 ± 0,019 до 0,318 ± 0,015 мкмоль/г білка (p < 0,001, n = 22).

У печінці щурів з ЕДБ вміст МДА зростав на 42,1% (0,124 ± 0,013 мкмоль/г білка в контролі та 0,196 ± 0,009 мкмоль/г білка в досліді, p < 0,001, n = 22) і не змінювався за ЕДБ у СЕТ. У тонкій кишці щурів з ЕДБ рівень МДА зростав на 70,3% (0,138 ± 0,011 мкмоль/г білка в контролі та 0,235 ± 0,016 мкмоль/г білка в досліді, p < 0,001, n = 22), а за ЕДБ у СЕТ, навпаки, дещо зменшувався (0,165 ± 0,007 та 0,148 ± 0,007 мкмоль/г білка, відповідно, p > 0,05, n = 22).

Комплексне лікування тварин з ЕДБ спленіном і біфіформом призводило до селективної деконтамінації гемолітичних ешерихій, протеїв, клебсієл, стафілококів, пептострептококів, пептококів та клостридій із порожнини товстої і слизових товстої та тонкої кишок. Відбувалося заселення кишечника біфідобактеріями, лактобактеріями, ентерококами, еубактеріями за зростання їх популяційного рівня і мікроекологічних показників при нормалізації колонізаційної резистентності СОК.

Введення щурам з ЕДБ спленіну і біфіформу призводило до збільшення концентрації ІЛ-1Я у сироватці крові з 29,14 ± 1,47 до 45,65 ± 3,66 пг/мл (p < 0,001, n = 21) і вмісту ФНП? - з 14,14 ± 0,51 до 38,21 ± 2,53 пг/мл (p < 0,001, n = 21). Інтенсивність ХМЛ, індукованої нейтрофілами щурів з ЕДБ, яким вводили спленін і біфіформ, зростала з 3,15 ± 0,17 до 11,88 ± 1,13 мВт/хв (p < 0,001, n = 21) за підвищення ХМЛ, індукованої Мц з 3,08 ± 0,12 до 9,16 ± 0,72 мВт/хв (p < 0,001, n = 21). ФЧ збільшувалося з 31,25 ± 1,44 до 53,18 ± 3,90% (p < 0,001, n = 21), а ФІ зростав з 1,83 ± 0,07 до 6,22 ± 0,58 (p < 0,001, n = 21). СФА плазми крові в щурів з ЕДБ під впливом спленіну і біфіформу зростала, що було зумовлено збільшенням як неферментативного, так і ферментативного фібринолізу - в 1,9 та 2,3 разу, відповідно. Лізис НМБ підвищувався на 43,9%, протеолітична деструкція ВМБ зростала на 91,7%, а КА зменшувалася на 38,6%.

ВИСНОВКИ

1. У дисертації наведене теоретичне узагальнення результатів вивчення ролі ендотоксину грамнегативної мікрофлори в цитокіновій регуляції активності клітинних факторів неспецифічного імунного захисту та нове вирішення наукової задачі, що виявляється в розробці та патогенетичному обґрунтуванні способу спрямованої корекції порушень цитокінової регуляції неспецифічної імунної відповіді за умов кишечного дисбактеріозу на підставі вивчення впливу спленіну і біфіформу на вміст у крові ІЛ-1Я і ФНП?, функціональну активність фагоцитів крові, інтенсивність тканинного фібринолізу, протеолізу та ліпопероксидації;

2. При введенні ендотоксину грамнегативної мікрофлори в черевну порожнину збільшення сироваткового вмісту ФНП? відбувається за відсутності змін рівня в крові ІЛ-1Я, що асоціюється з підвищенням функціональної активності моноцитів та помірним збільшенням інтенсивності плазмового фібринолізу і протеолізу за значного зростання фібрино- і протеолітичної активності в тканинах печінки, наднирників і легень;

3. Системна ендотоксинемія значно підвищує вміст у крові ІЛ-1Я і ФНП?, що супроводжується активацією систем генерації активних форм кисню в нейтрофілах, підвищенням функціональної активності моноцитів-макрофагів та різким збільшенням інтенсивності плазмового фібринолізу і протеолізу, тоді як в наднирниках відбувається тотальне пригнічення фібрино- і протеолітичних систем;

4. Спленектомія різко підвищує концентрацію в сироватці крові ІЛ-1Я та ФНП?, що асоціюється з інтенсифікацією фібринолізу і протеолізу в крові і тканинах серця, легень, печінки, наднирників, нирок, тимуса і тонкої кишки. За внутрішньо-очеревинного і внутрішньовенного введення ендотоксину грамнегативної мікрофлори спленектомованим щурам тканинний вміст малонового діальдегіду знижується в органах, які не мають спеціалізованих фіксованих тканинних макрофагів (серце, легені і наднирники), зростає в разі їх наявності (печінка та нирки) і залишається сталим в органах імунної системи (тимус і тонка кишка);

5. За внутрішньовенного введення ендотоксину тимектомованим щурам сироватковий вміст ФНП? та ІЛ-Я зростає, але інтенсивність генерації нейтрофілами активних форм кисню не змінюється, тоді як функціональна активність моноцитів-макрофагів збільшується за підвищення плазмового фібринолізу і протеолізу; патогенетичний медичний дисбактеріоз

6. У спленектомованих щурів введення білкової фракції гомогенату селезінки зменшує вміст ІЛ-1Я у сироватці крові та пригнічує плазмову і тканинну протео- та фібринолітичну активність. Спленін суттєво збільшує сироваткову концентрацію ІЛ-1Я і ФНП?, підвищує утворення кисневих радикалів нейтрофілами і моноцитами, збільшує функціональну активність моноцитів-макрофагів, а також інтенсивність плазмового і тканинного протеолізу та фібринолізу;

7. Зниження сироваткового вмісту ІЛ-1Я і ФНП? у щурів з дисбактеріозом, особливо в спленектомованих тварин, асоціюється з пригніченням функціональної активності моноцитів-макрофагів і нейтрофілів за активації процесів ліпопероксидації в тканинах легень, печінки і тонкої кишки. Спленін і біфіформ викликають селективну деконтамінацію патогенної і умовно патогенної мікрофлори та нормалізують колонізаційну резистентність слизових оболонок кишечника, сприяють підвищенню сироваткового вмісту ІЛ-1Я і ФНП?, що асоціюється з активацією моноцитів і нейтрофілів та інтенсифікацією плазмового фібринолізу і протеолізу.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ ПРАЦЬ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Кухарчук О.Л., Кузнецова О.В., Філіпова Л.О. Акцидентальна інволюція тимуса, стан тканинного протеолізу і фібринолізу у вилочковій залозі // Буковинський медичний вісник. - 1999. - Т. 3, №4. - С. 178-181.

2. Кузнецова О.В. Вплив спленектомії на обмежений і необмежений протеоліз в плазмі крові і тканинах у білих щурів // Вісник наукових досліджень. - 2001. - №1. - С. 96-98.

3. Кухарчук О.Л., Кузнецова О.В. Селезінковий інгібітор інтерлейкіну-1Я у білих щурів // Український медичний альманах. - 2000. - Т. 3, №2. - С. 86-89.

4. Кузнецова О.В. Вплив ендотоксину Sl.Typhimurium на систему регуляції агрегатного стану крові у білих щурів // Буковинський медичний вісник. - 2000. - Т. 4, №2. - С. 181-185.

5. Боднар Б.М., Кухарчук О.Л., Брожик В.Л., Кузнецова О.В. Вплив ентеросорбції на систему регуляції агрегатного стану крові у щурів з експериментальним сальмонельозним ендотоксикозом // Буковинський медичний вісник. - 2000. - Т. 4, №2. - С. 153-157.

6. Кузнецова О.В. Роль цитокінів у механізмах розвитку післяспленектомічної А-клітинної гіпоергічної імунної реакції // Буковинський медичний вісник. - 2001. - Т. 5, №3-4. - С. 177-179.

7. Кузнецова О.В., Кухарчук О.Л., Крещук Л.М. Вплив ендотоксину грамнегативної мікрофлори на систему регуляції агрегатного стану крові у білих щурів // Праці наукової конференції “Фізіологія і патологія перекисного окислення, гемостазу та імуногенезу”. - Полтава, 1999. - С. 13.

8. Кузнецова О.В. Вплив спленектомії на вміст цитокінів і протеолітичну активність плазми крові у білих щурів // Праці 4-го міжнародного медичного конгресу студентів і молодих вчених. - Тернопіль, 2000. - С. 275.

Размещено на Allbest.ru