Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції

Публікації. Результати досліджень опубліковані в 4 наукових статтях та 3 тезах конференцій.

Методика отримання культури клітин гіпокампу. Для приготування первинної культури нейронів гіпокампа використовували мозок новонародженних щурів лінії Вістар. Зрізи гіпокампа товщиною 200-300 мкм оброблялися ферментативно розчином 0.05% пронази Е (Sigma) протягом 18 хвилин при 32С. Для підтримання життєдіяльності клітин використовували мінімальне середовище Ігла (МЕМ, “Sigma”, США) з додаванням 10% кінської сироватки (Gibco, США). Дослідження проводили в культурі віком від 14 до 25 діб.

Електрофізіологічні вимірювання.Для реєстраціі іонних струмів крізь мембрану нейронів був застосований метод внутриклітинноі перфузіі (Неер Э., Сакман Б. (1992)). Внутришньопіпетковий розчин містив (в мМ): 70 Трис-фосфат, 40 TEA-Cl, 20 Трис-Cl, 5 ЕГТА, 5 Mg2+-АТФ, 1-3 ГТФ, pH=7.4. [206]. Позаклітинний розчин (у mM для L-типу кальцієвих струмів): 40 тетраетиламоній хлорид (TEA-Cl), 2 MgCl₂, 20 BаCl2, 100 Холін-хлорид, 20 Трис-Cl, pH=7.4. Позаклітинний розчин (у mM для P-типу кальцієвих струмів): 40 TEA-Cl, 2 MgCl₂, 2 BаCl2, 100 Холін-хлорид, 20 Трис-Cl, pH=7.4. Для дослідження спонтанних постсинаптичних потенціалів внутришньопіпетковий розчин мав такий склад (в мМ): Cs глюконат 100, CsCl 30, MgCl₂ 4, Na₂АТФ 4, EGTA 10, HEPES 10. Склад позаклітинного розчину - (у mM ): NaCl 140, KCl 4, CaCl₂ 2, MgCl₂ 1, HEPES 10, глюкоза 10, pH=7.4.

Обробка результатів експериментів. Результати статистичної обробки експериментальних даних представлені як середнє арифметичне ± стандартна похибка середнього арифметичного (n - кількість експериментів). Дані апроксимувались різними функціями із використанням програмного забезпечення Origin.

Результати досліджень

Модулювання злиття мембран під впливом латротоксинподібного білка. Для дослідження здатності латротоксин-подібного білка впливати на процес злиття мембран використовували систему, що містила синаптичні везикули та мембрани синаптосом. Було показано, що при додаванні латротоксинподібного білка до цієї системи відбувалося часткове пригнічення процесу злиття (Рис. 1 (крива 2)). Вже на другу хвилину інкубації гальмуюча дія латротоксинподібного білка на АТФ-індуковане злиття синаптичних везикул та мембран синаптосом становила близько 22% від контрольного рівня і далі зростала з часом інкубації . Ці результати дозволили нам припустити, що для латротоксинподібного білка може бути характерна поведінка подібна до таких білків родини ААА АТФаз, як р97 або Cdc48p; білків, що опосередковують злиття виключно гомотипових мембран. Для перевірки цього припущення ми використали систему що містила лише синаптичні везикули. Додавання латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища призводило до підвищення відносного проценту злиття мембран (рис. 2). За першу хвилину інкубації відбувалося збільшення ефективності злиття синаптичних везикул на 33% і потім, на протязі подальшої інкубації, відбувалося лише збільшення відносного проценту злиття пропорційно до контрольних значень (рис. 2). Так відносний процент злиття мембран в контролі та під впливом латротоксинподібного білка на першу хвилину інкубації становив 9% та 12 %, відповідно, і потім зростав до 12% та 16% на 2 хвилину, 14%/18% - на 3 хвилину і 15%/20% - на 4 хвилину інкубації. Постійна часу наростання процесу злиття становила ф=1.118 ± 0.06 хв. для контроля, та ф=1.126 ± 0.086 хв. при дії білка. Таким чином отримані нами результати дають змогу зробити припушення, що подібно білкам р97 та Cdc48p, латротоксинподібний білок може впливати на процес злиття гомотипових мембран.

Дослідження АТФ-азної активності латротоксинподібного білка. З літератури відомо, що вищезгадані білки р97 та Cdc48p належать до ААА родини АТФаз. Це дозволило нам припустити, що латротоксинподібний білок також здатен проявляти АТФазну активність і може виконувати роль подібну до відомих білків родини ААА АТФаз. Дослідження показали, що латротоксинподібний білок дійсно проявляє АТФазну активність (рис. 3, крива 1). Додавання латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища, що містило АТФ, призводило до вивільнення неорганічного фосфату. Було показано, що при рН 7.4 процес гідролізу АТФ досягав максимальної швидкості, яка становила 0,140 мкмольP_i / мг латротоксинподібного білка / хв. Таким чином наші дослідження показали що АТФазна активність латротоксинподібного білка становить близько 4-6 мкмольР_і/мг білка/годину, що відповідає таким значенням для білків ААА родини АТФаз, що описані в літературі. Крім того, як відомо з літератури, рН середовища є фактором, який суттєво змінює активність білків. Так, максимум АТФазної активності для білків ААА родини проявляється при зсуві рН в бік лужного середовища. Дослідження впливу рН на активність латротоксинподібного білка показали, що так само як і в випадках р97 та NSF, підвищення рН до 8,1 призводило до значних змін АТФазної активності латротоксинподібного білка (рис. 3, 4). Максимальна швидкість гідролізу АТФ латротоксинподібним білком при рН 8,1 становила 0,132 мкмольP_i / мг білка / хв. Збільшення концентрації латротоксинподібного білка в інкубаційному середовищі призводило до пропорційного зростання кількості вивільненого фосфату за одиницю часу і мало лінійну форму. Таким чином, отримані нами результати свідчать, що латротоксинподібний білок має АТФазну активність і можливо належить до родини ААА-АТФаз, білків, які опосередковують злиття мембран.

Модулюючий вплив рН середовища на здатність латротоксинподібного білка викликати злиття негативно заряджених ліпосом. Найбільш зручною моделлю для досліджень модулювання здатності латротоксинподібного білка викликати злиття гомотипових мембран є система ліпосом. Нами було показано, що зміни рН середовища мають значний вплив на активність латротоксинподібного білка та його здатність викликати злиття від'ємно заряджених ліпосом. Як видно з рисунку 5, підвищення рН до 8.1 призводило до майже повної інактивації впливу білка. Інкубування на протязі 6 хвилин призводило лише до незначного злиття ліпосом, що становило близько 1,2%; тоді як в контрольних умовах при рН 7,4 відносний процент злиття вже на першу хвилину інкубації становив 3%, а до 6 хвилини збільшувався до 17%. Це свідчить про те, шо навіть при досить незначному зсуві рН в лужну область відбуваються значні конформаційні зміни в молекулі білка, що призводять до інактивації здатності латротоксинподібного білка викликати злиття штучних мембран. Однак зсув рН в бік кислого середовища мав зворотній ефект. Так при рН 6,0 додавання латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища призводило до того, що вже на самому початку інкубації відносна кількість ліпосом, що злилися, становила близько 35 %.

Вплив фосфорилювання латротоксинподібного білка на його здатність викликати злиття негативно заряджених ліпосом. Фосфорилювання білків може призводити до значних змін їх функціональних властивостей, і, відповідно, було цікавим з'ясувати, чи призведе фосфорилювання латротоксинподібного білка до модифікації його фузогенної активності. Фосфорилювання латротоксинподібного білка проводили з використанням каталітичної субодиниці цАМФ-залежної протеїнкінази за стандартною методикою. Нами було показано, що за умов фізіологічного рН фосфорилювання латротоксинподібного білка призводить до значного зниження його здатності викликати злиття негативно заряджених ліпосом(рис.6). Додавання нефосфорильованого латротоксинподібного білка до інкубаційного середовища призводило до лінійного збільшення відносного проценту мембран, що злилися, і після 6 хвилин інкубації швидкість цього процесу не зменшувалась. Злиття ліпосом під дією нативного латротоксинподібного білка приймали за контроль. Ефективність впливу фосфорильованого латротоксинподібного білка знижувалась майже на 65%. При зсуві рН в бік кислого середовища (рис. 7) фосфорилювання білка додатково збільшувало його здатність викликати злиття негативно заряджених ліпосом. За цих умов ефективність дії латротоксинподібного білка зростала майже на 43 відсотки, в порівнянні з контролем. В обох випадках наростання кількості ліпосом, що злилися, мало лінійну залежність. Таким чином, отримані нами результати дали нам змогу припустити, що латротоксинподібний білок здатен змінювати свою активність під впливом різних факторів, що опосередковують модуляцію активності інших білків, зокрема білків синаптичної передачі в умовах in vivo.

Вплив N-етилмалієміду на здатність латротоксинподібного білка викликати злиття негативно заряджених ліпосом. З літературних даних відомо, що білки родини ААА-АТФаз, що опосередковують злиття мембран, дуже чутливі до впливу N-етилмалієміду. Дослідження впливу N-етилмалієміду на активність латротоксинподібного білка проводили з використанням системи ліпосом. Латротоксинподібний білок попередньо обробляли розчином N-етилмалієміду. Наши дослідження показали, що за таких умов фузогенна активність латротоксинподібного білка значно знижується (рис. 8), але не зникає зовсім. Варто відмітити, що в обох випадках математично процес злиття ліпосом під дією обробленого N-етилмаліємідом та нативного латротоксинподібного білка описувався одноекспоненційними кривими з постійною часу наростання ф=3,6 ± 0,59 хв., для білка обробленого N-етилмаліємідом, і ф = 3,397 ± 0,55 хв. для нативного білка. Таким чином, ці результати також підтверджують наше припущення, що латротоксинподібний білок може належати до родини синаптичних білків, що мають N-етилмаліємід-чутливі властивості, а саме - ААА родини АТФаз, що забезпечують транспортні реакції та комплексні перетворення на протязі синаптично-везикулярного циклу.

Дослідження впливу латротоксинподібного білка на роботу потенціалзалежних кальцієвих каналів. Дослідження здатності латротоксинподібного білка впливати на роботу кальцієвих каналів проводили на свіжоізольованих нейронах гіпокампа та клітинах Пуркіньє мозочка щурів лінії Вістар віком 17 та 13 днів, відповідно. Нейрони виділяли за стандартними методиками з використанням слабкої ферментативної обробки з подальшим механічним диспергуванням тканини з допомогою пастерівської піпетки. Експерименти проводили з використанням стандартної методики фіксації потенціалу в умовах внутрішньоклітинного діалізу {Kostyuk P.G. 1981}. Кальцієвий струм Р-типу реєстрували в нейронах Пуркінь'є мозочка. В цьому випадку застосовували позаклітинний розчин, що містив (в мМ): TEA-Cl - 40, MgCl₂ - 2, BаCl₂ - 2, Холін-хлорид - 100, Трис-Cl - 20, (pH=7.4); та внутрішньопіпетковий, що містив (в мМ): Tріс-фосфат - 70, TEA-Cl - 40, Трис-Cl - 20, ЕГТА - 5, MgАТФ - 5, ГТФ - 1-3, (pH=7.4). Підтримуваний потенціал становив -70 мВ. Після прориву мембрани нейрон перфузували внутрішньопіпетковим розчином на протязі 3 хв до початку стимуляції. Струм викликали ступінчастою деполяризацією мембрани клітини до -25 мВ тривалістю 200 мс з інтервалом 15 с. Після досягнення струмом стаціонарного рівня до зовнішнього розчину додавали латротоксинподібний білок в концентрації 0,1 мкМ. За таких умов відбувалося швидке збільшення амплітуди кальцієвого струму на 72 4 % (Рис. 9). При цьому, аплікація латротоксинподібного білка не призводила до достовірних змін кінетичних параметрів струму. Як видно з рисунків 9 А, В, кінетика наростання та спаду кальцієвого струму залишалася незмінною, а відбувалося лише збільшення амплітуди струму. Відмивання латротоксинподібного білка із зовнішньоклітинного розчину призводило до часткового усування його дії, яке становило близько 29 6 % від його максимального значення(n=4) (Рис.9, А; 10). Також було перевірено вплив латротоксинподібного білка на потенціал-залежні характеристики кальцієвих струмів Р-типу. Вольт-амперну характеристику отримували при ступінчастій деполяризації мембрани нейронів від підтримуваного потенціалу -70 мВ до різних рівнів з інкрементом 10 мВ, тривалістю 200 мс. На рис. 9 Б представлено узагальнену вольт-амперну характеристику для кальцієвих каналів Р-типу нейронів Пуркін'є мозочка щурів в контролі (крива 1), при дії латротоксинподібного білка в концентрації 10 мкг/мл (крива 2); у всіх випадках n=4).

Як видно з рисунку латротоксинподібний білок не впливав на потенціал-залежні характеристики кальцієвого струму Р-типу. Для перевірки, чи такий ефект на Р тип кальцієвого струму, не був обумовлений лише зміною зовнішнього розчину, що містив певну кількість білка, були проведені експерименти, в ході яких використовували відповідну кількість інактивованого латротоксинподібного білка. Інактивований латротоксинподібний білок не впливав на кальцієвий струм Р-типу нейронів Пуркін'є мозочка щурів (Рис. 9). Подальші дослідження властивостей латротоксинподібного білка проводили на високопорогових кальцієвих каналах L-типу. Кальцієвий струм L-типу реєстрували в свіжоізольованих нейронах гіпокампа. В цьому випадку застосовували позаклітинний розчин, що містив (в мМ): TEA-Cl - 40, MgCl₂ - 2, BаCl₂ - 20, Холін-хлорид - 100 , Трис-Cl - 20, (pH=7.4); та внутрішньопіпетковий, що містив (в мМ): Трис-фосфат - 70, TEA-Cl - 40, Трис-Cl - 20, ЕГТА - 5, АТФ -Mg2+- 5, ГТФ - 1-3 Трис, (pH=7.4). Підтримуваний потенціал становив -55 мВ. Після прориву мембрани нейрон перфузували внутрішньопіпетковим розчином на протязі 3-х хв до початку стимуляції. Струм викликали ступінчастою деполяризацією мембрани клітини до 0 мВ тривалістю 50 мс з інтервалом 15с. Після досягнення струмом максимального рівня до зовнішнього розчину додавали латротоксинподібний білок в концентрації 0,1 мкМ. Це викликало збільшення кальцієвого струму L-типу в середньому на 33 5 %, яке повністю усувалося при відмиванні білка із зовнішнього розчину (n=4) (Рис.11 А, Рис.12). Також було досліджено вплив латротоксинподібного білка на потенціал-залежні характеристики кальцієвих струмів L-типу. На рис. 11 Б представлено узагальнену вольт-амперну характеристику для кальцієвих каналів L-типу нейронів гіпокампу щурів в контролі (1), при дії латротоксинподібного білка в концентрації 10 мкг/мл (2) та при відмиві білка із зовнішнього розчину (3); у всіх випадках n=4. Таким чином, отримані нами результати свідчать про те, що аплікація латротоксинподібного білка на L-тип кальцієвого струму також призводила до збільшення амплітуди струму, а кінетичні та потенціалзалежні характеристики струму залишалися незмінними.

Дослідження впливу латротоксинподібного білка на спонтанну постсинаптичну активність. Для дослідження можливого впливу латротоксинподібного білка на вивільнення нейромедіатора, ми вивчали спонтанні ГАМК-ергічні постсинаптичні струми в нейронах гіпокампа в контролі та після аплікації 0.3 мкМ білка до зовнішнього розчину. Для виділення гальмівних спонтанних постсинаптичних струмів (“мініатюрна активність“) до зовнішнього розчину додавали 10 мкM CNQX та 50 мкM APV, для блокування іонотропних глутаматних рецепторів, та 1 мкМ ТТХ для блокування натрієвих каналів (Рис. 13, 14) За таких умов в контролі спостерігалась незначна спонтанна активність, частота якої становила близько 0,37 0,07 Гц (n=3)(Рис. 13, 14). Аплікація 0,3мкМ латротоксинподібного білка призводила до значного зростання частоти спонтанної активності, яка становила близько 3,8 0,45 Гц (n=3)(Рис. 13, 14, 15 А).

На рисунку 13 представлений частотно-амплітудний розподіл спонтанних постсинаптичних відповідей в контролі та під дією 0,3мкМ латротоксинподібного білка. Як видно з рисунку, додавання латротоксинподібного білка викликало швидке зростання частоти спонтанних постсинаптичних відповідей, яке дещо спадало з часом(рис. 13, 14). В середньому, зростання частоти спонтанних відповедей відбувалося майже в 10 разів. При цьому також відбувалося зростання їх амплітуди, яке становило близько 44,6 24,56% (рис. 15 Б).

Таким чином, отримані нами результати свідчать про те, що латротоксинподібний білок здатен викликати спонтанне вивільнення нейромедіатора, що призводить до зростання частоти та амплітуди спонтанних постсинаптичних відповідей в порівнянні з контрольними значеннями.

ОБГОВОРЕННЯ РЕЗУЛЬТАТІВ ДОСЛІДЖЕНЬ

З літературних даних відомо, що в пресинаптичному закінченні є велика кількість білків, які виконують роль посередників в процесі злиття мембран {Meyer, H. H., et. al.1998}{Meyer, H. H., et. al. 2000}{Yuan, X., et.al. 2001}{Barnard, R. J., et.al. 1997}{Hanson, P. I.,et.al.1997}. Це білки так званої родини ААА АТФаз - NSF, що опосередковує злиття мембран синаптичних везикул з плазматичними мембранами; р97 - посередник злиття мембран в апараті Гольджі та ендоплазматичному ретикулюмі, та інші{Meyer, H. H., et. al. 2000}{Kondo, H. et. al. 1997}{Roy, L.et. al. 2000}. Їх основна роль полягає в тому, що вони забезпечують дисоціацію білкового SNARE комплексу, який зв`язує мембрани синаптичних везикул з пресинаптичними мембранами в активній зоні, наближаючи їх одну до одної так, щоб за умови усунення запобіжного механізму могло відбутися їх спонтанне злиття. Такий розвиток подій пропонують автори однієї з гіпотез, що описує злиття мембран в процесі синаптичної передачі {Mayer, Wickner, et al. 1996 }. Отримані нами результати показали, що латротоксинподібний білок підвищував АТФ-ініційоване злиття між собою переважно мембран синаптичних везикул. Це можна пояснити тим, що за цих умов білковий комплекс злиття, який формується між синаптичними везикулами, дещо відрізняється по структурі від комплексу злиття активної зони {Weber, Parlati, et al. 2000}. Ймовірно, це є визначальним для здатності латротоксинподібного білка викликати злиття мембран. Наші результати показали, що латротоксинподібний білок здатен викликати злиття переважно гомотипових мембран, а факторами, які модулюють активність латротоксинподібного білка, є його фосфорилювання та зміна рН середовища. Як відомо з літературних даних, саме цими факторами модулюється функціональна активність синаптичних білків{Greengard, Valtorta, et al. 1993}{Greengard & Browning 1988}{Greengard, Browning, et al. 1987}{Greengard 1978}{Nielander, Onofri, et al. 1995}. Отримані нами результати узгоджуються з даними літератури і свідчать про те, що латротоксинподібний білок здатен змінювати свою активність за рахунок ендогенних модуляторних факторів за тих самих умов, при яких відбувається модулювання активності інших білків активної зони. АТФазна активність латротоксинподібного білка за своєю величиною подібна до описаної раніше для інших білків родини ААА АТФаз {Meyer, Kondo, et al. 1998}. Більш того, дослідження залежності ферментативної активності латротоксинподібного білка від зсуву рН в бік лужного середовищя (умови, що підвищують АТФазну активність білків родини ААА до максимального рівня), показали, що її величина також зростає. При досліджені АТФазної активності р97 було показано, що його максимальна активність проявляється при рН середовища 9,0 {Meyer, Kondo, et al. 1998}. Окрім того, також було показано, що в умовах моделі штучних мембран р97 викликає злиття ліпосом {Otter-Nilsson, Hendriks, et al. 1999}. Таким чином, отримані нами результати і дані літератури дають можливість припустити, що латротоксинподібний належить до родини ААА АТФаз, ферментних білків, які виконують вирішальну роль в злитті мембранних структур. В свою чергу, модулювання активності латротоксинподібного білка може відбуватися за рахунок роботи внутрішньоклітинних механізмів, таких як зміна рН та процеси фосфорилювання-дефосфорилювання, які за фізіологічних умов забезпечують активацію-деактивацію білків активної зони синаптичного закінчення. В попередніх дослідженнях було показано, що латротоксинподібний білок може проявляти властивості, які характерні для б-латротоксину. Дослідження, проведені на штучній ліпідній мембрані, показали, що додавання білка викликає поступове зростання мембранного струму за рахунок утворення каналів в мембрані. Вбудовування латротоксинподібного білка до мембрани уповільнюється в присутності моновалентних катіонів, а додавання 5 мM CaCl₂ значно активує цей процес. Саме така поведінка характерна для -латротоксина, про що свідчать результати досліджень Міронов С. та співавтори [Mironov & Richter 2000]. Окрім цього значний вплив на вбудовування білка, має поляризація мембрани. Ця властивість також притаманна -латротоксину. Це може свідчити про те, що латротоксинподібний білок не тільки має структурну подібність до нейротоксину, але його функціональні властивості також відповідають характеристикам отрути павука каракурта. З огляду на вищезгадане нами було припущено, що латротоксинподібний білок здатен впливати на роботу Са каналів. Для ескпериментальної моделі ми використали два типи каналів P-тип Са каналів нейронів Пуркін'є мозочка щурів, які приймають безпосередню участь в процесі синаптичної передачі і зв'язані із специфічним рецептором для б-латротоксину - нейрексином; та L-тип Са каналів з нейронів гіпокампу щура, які обумовлюють повільну збуджуючу синаптичну передачу, але не залежать від б-латротоксинових рецепторів. Показано, що латротоксинподібний білок, дійсно впливає на роботу Са каналів, при цьому його дія на Р тип кальцієвих каналів була більш специфічною, ніж на L тип. Окрім цього, одержані дані дали змогу припустити, що латротоксинподібний білок може впливати на спонтанне вивільнення нейромедіатора з пресинаптичного закінчення завдяки своєму потенціюючому впливу на Са канали активної зони. В подальших наших дослідженнях ми підтвердили це припущення і показали, що аплікація латротоксинподібного білка призводила до значного зростання частоти спонтанної активності, яка становила близько 3,8 Гц (Рис. 17, 18), а також до збільшення амплітуди струмів. Таким чином, отримані нами результати показали, що ефект латротоксинподібного білка на спонтанні постсинаптичні струми має риси подібні до дії б-латротоксину{Capogna 1998}. Подібно до б-латротоксину латротоксинподібний білок значно збільшує частоту спонтанних ІПСС. Загалом подібність інших властивостей цих білків дозволила нам зробити припущення, що вплив латротоксинподібного білка відбувається за рахунок механізмів, що опосередковують дію б-латротоксина. Це може включати в себе дію білка через 1) високоспецифічні рецептори до б-латротоксину - нейрексин та латрофілін {Geppert, Khvotchev, et al. 1998}, {Bittner, Krasnoperov, et al. 1998}, 2) шляхом формування катіон-селективних пор в плазматичній мембрані {Zhukareva, Shatursky, et al. 1992}, {Khvotchev & Sudhof 2000}, 3) або безпосередньо впливаючи на злиття синаптичних везикул. Оскільки концентрація латротоксинподібного білка в наших експериментах була значно нижчою, ніж необхідно для формування пор, можна припустити що його дія реалізувалася за рахунок роботи б-латротоксин-специфічних рецепторів.

Висновки

З використанням біохімічних та електрофізіологічних методів було досліджено функціональні властивості латротоксинподібного білка та встановлено, що він може бути віднесений до родини ААА АТФаз - білків, які опосередковують злиття мембранних структур.

Латротоксинподібний білок здатен викликати злиття штучних та біологічних гомотипових мембран.

Показано, що властивості латротоксинподібного білка можуть модулюватися ендогенними факторами, такими як зміна рН середовища та фосфорилювання.

Для латротоксинподібного білка характерна АТФазна активність, величина якої становить 6 мкмольР_і/мг білка/год.

Латротоксинподібний білок здатен потенціювати Са струм через канали P- та L-типу без зміни їх кінетичних та потенціал-залежних параметрів. Приріст амплітуди Са струму P-типу в нейронах Пуркін'є мозочка щура становив 72%, а Са струму L-типу в нейронах гіпокампу щура - 40%, при аплікації латротоксинподібного білка ззовні в концентрації 10 мкг.

Дослідження на нейронах гіпокампа в культурі показали, що частота та амплітуда постсинаптичних струмів значно зростають при дії латротоксинподібного білка. Ці дані вказують на те, що цей білок може виступати в ролі фактора, що бере участь в вивільненні нейромедітора.

ПЕРЕЛІК СТАТЕЙ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА МАТЕРІАЛАМИ ДИСЕРТАЦІЇ

Trikash I., Terletskaya M. Malysheva M. Kolchinskaya L. Kactrykina T. Glyvuk N., Membrane fusion in model system (1997). Neirofiziologia/Neurophysiology, 29, 283-285

М.К.Малишева, Л.І.Колчинська, Я.Т.Терлецька, І.О.Трікаш, Н.В.Гливук Деякі характеристики фузогенної активності цитоплазматичного латротоксинподібного білка мозку (1998). Нейрофизиология, 30, № 4/5, 294-296

Н.В.Гливук, Л.И.Колчинская, М.К.Малышева АТФазная активность латротоксинподобного белка (2002). Нейрофизиология 34, № 1, pp. 3-6.

Glyvuk N.V., Storozhuk M.V. Effect of latrotoxin-like protein on spontaneous postsynaptic activities in hippokampal cell cultures (2002) Neirofiziologia/Neurophysiology, 34, № 2/3, 152-154.

Перелік тез доповідей, опублікованих за матеріалами дисертації:

Н.В.Гливук, І.О.Трікаш, Я.Т.Терлецька, Л.І.Колчинська, М.К.Малишева Вплив латротоксинподібного білка на злиття ліпосом і його можлива участь в нейросекреції (1995). Експериментальна та клінічна фізіологія,4, 68

Trikash I., Terletskaya M. Malysheva M. Kolchinskaya L. Kactrykina T. Glyvuk N. Latrotoxin-like brain protein and its fusogenic activity (1997). Biophis.J., 2, 72

АНОТАЦІЇ

Гливук Н.В. Дослідження функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції.-Рукопис. Дисертація на здобуття вченого ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.02 - біофізика.- Інститут фізіології ім. О.О. Богомольця НАН України, Київ, 2002.

Дисертаційна робота присвячена дослідженню функціональних властивостей латротоксинподібного білка як можливого учасника процесу нейросекреції. В роботі показано, що латротоксинподібний білок збільшує ступінь АТФ - викликаного злиття гомотипових мембран. Ця властивість латротоксинподібного білка може модулюватися процесами фосфорилювання-дефосфорилювання, зміною рН середовища та шляхом обробки білка N-этилмаліємідом. Встановлено, що латротоксинподібному білку притаманна АТФазна активність, характерна для білків ААА родини АТФаз. Показано, що аплікація 0,1мкМ латротоксинподібного білка призводила до значного збільшення амплітуди кальцієвого струму Р-типу (біля 72%) та дещо меньшому зростанню струму L-типу (біля 33%). Дослідження впливу латротоксинаподібного білка на спонтанні постсинаптичні відповіді показали, що аплікація 0,3мкМ білка призводила до деякого зростання амплітуди (44.6 24.6 %) та значного збільшення частоти (1027 121,2 %) GABAергічних IPSC. Таким чином латротоксинподібний білок можливо здатен брати участь в процесі синаптичної передачі.

Ключові слова: латротоксинподібний білок; синаптична передача; кальцієві канали; АТФазна активність; злиття мембран.

АННОТАЦИЯ

Гливук Н.В. Исследования функциональных свойств латротоксинподобного белка как возможного участника процесса нейросекреции.-Рукопись. Диссертация на соискание учёной степени кандидата биологических наук по специальности 03.00.02.- биофизика.- Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Киев, 2002.

Диссертационная работа посвящена изучению функциональных свойств латротоксинподобного белка как возможного участника процесса нейросекреции. В работе было показано, что латротоксинподобный белок увеличивает степень АТФ-вызванного слияния гомотипичных мембран. Это свойство латротоксинподобного белка может модулироваться процессами фосфорилирования-дефосфорилирования, изменением рН среды и обработкой латротоксинподобного белка N-этилмалиемидом. Установлено, что латротоксинподобный белок обладает АТФ-азной активностью, характерной для белков ААА семейства АТФ-аз. Показано что апликация 0,1мкМ латротоксинподобного белка приводила к значительному увеличению амплитуды кальциевого тока Р- типа (около 72%) и несколько меньшему увеличению тока L-типа (около 33%). Исследования влияния латротоксинподобного белка на спонтанные постсинаптические ответы показали, что приложение 0,3мкМ белка приводило к значительному увеличению частоты (1027 121,2 %) и небольшому увеличению амплитуды (44.6 24.6 %) GABAергических IPSC ответов. Таким образом, латротоксинподобный белок, возможно, способен принимать участие в процессе синаптической передачи.

Ключевые слова: латротоксинподобный белок; синаптическая передача; кальциевые каналы; АТФазная активность; слияние мембран.

ABSTRACT

Glyvuk N.V. The investigation of fun ctional properties of the latrotoxin-like protein as a possible participator of the process of neurosecretion.- Manuscript. Thesis for Ph.D. degree on specialty 03.00.02 - biophysics.- , O.O.Bogomoletz Institute of Physiology National Academy of Sciences of Ukraine, Kyiv, 2002.

The dissertation work is devoted to the investigation of functional properties of latrotoxin-like protein as a possible participator of process of neurosecretion. For the investigation of latrotoxin-like protein`s ability to affect membrane fusion we used system which contained SM and SV. Our experiments revealed that the application of latrotoxin-like protein led to partial inhibition of ATP-induced membrane fusion. But these data let us to suggest that the behavior of this protein could possibly differ in the system of homotypic membranes (for example in system which contains only SV). Experiments made in such conditions showed that indeed the application of latrotoxin-like protein led to the increase of ATP-induced fusion comparing to control. Taking into account literature data and our results we could suggest that latrotoxin-like protein is similar by its action to some other proteins, namely р97, Sec18 and Cdc48p, which mediate processes of membrane fusion. From the other hand it is known that above mentioned proteins belong to the AAA-family of APTases. Our experiments revealed that Latrotoxin-like protein has ATPase activity and its value is actually the same as in other APTases from AAA-family. This feature of latrotoxin-like protein likewise р97 and NSF greatly depends on pH. We showed that the increase of pH to 8,1 led to increase of ATPase activity of latrotoxin-like protein. Thus, these data let us to suggest that latrotoxin-like protein can be considered as a member of ААА-family АТР-аses - group of proteins, which mediate processes of membrane fusion. On the next stage of our work we tried to investigate in more details possible mechanisms of the regulation of latrotoxin-like protein activity. We showed that increase of pH to 8.1 led to almost complete loss of the ability of latrotoxin-like protein to evoke membrane fusion while the decrease рН to 6.0 significantly amplified this feature. Phosphorilation of latrotoxin-like protein also affected its activity. We showed that at physiological рН phosphorilation of latrotoxin-like protein led to decrease of its fusogenic activity, while at рН 6.0 this value increased. These data shows that latrotoxin-like protein likewise other synaptic proteins can modulate its activity by the factors, which provide efficiency of proteins in native conditions. On the next part of our work we decided to investigate the influence of latrotoxin-like protein on the Ca²⁺ channels. Our investigations showed, that application of 0.1мM of latrotoxin-like protein led to enhance of P-type Ca current for about 72% without any effect on kinetic or potential-dependent parameters of this current. Effect of latrotoxin-like protein could be partly washed out (about 29%). In case of L-type of Ca current application of latrotoxin-like protein in the same concentration also led to increase of current amplitude, but this value was less comparing to P-type Ca current and average was about 33%. This effect could be abolished by the washout of protein from the bath solution. Kinetic and potential-dependent parameters of this current were also unaffected. This data let us to suggest, that latrotoxin-like protein action was more specific for P-type Ca channels than for L-type. To examine possible effect of latrotoxin-like protein on transmitter release, we compared spontaneous GABA-ergic inhibitory postsynaptic currents (IPSC) in hippocampal neurons before and after bath application of the protein (0.3 M) to the external solution. It can be seen that the frequency of spontaneous GABA-ergic IPSC dramatically increased following application of the latrotoxin-like protein. A pronounced increase in the IPSC frequency was observed in all experiments with no exception. Under control conditions, “miniature” currents were detected with the mean frequency of about 0.37 Hz, while after application of 0.3 M latrotoxin-like protein to the external solution the respective frequency of the spontaneous activity reached about 3.8 Hz. The normalized IPSC frequency increased more than 10 times, as compared with the control. The amplitude of spontaneous responses also tended toward increase in the presence of latrotoxin-like protein. The effect also was observed in all experiments, but was significantly smaller than that on the IPSC frequency (the mean increase was only about 44.6 %).

Thus latrotoxin-like protein may be involved into process of synaptic transmission.

Key words: latrotoxin-like protein; synaptic transmission; calcium channels; ATPase activity; membrane fusion.

Размещено на Allbest.ru