Піоціанін як антибактеріальний та імуногенний субстрат синьогнійної палички

Размещено на http://www.allbest.ru/

Академія медичних наук України

інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова

УДК 579.84.1:615.012.6:615.281

03.00.07 - мікробіологія

Автореферат

дисертації на здобуття наукового

ступеня кандидата медичних наук

Піоціанін як антибактеріальний та імуногенний субстрат синьогнійної палички

Гейдеріх Ольга Григорівна

Харків - 2002

Дисертацією є рукопис

Робота виконана на кафедрі мікробіології Національного фармацевтичного університету (м. Харків), Міністерства охорони здоров`я України.

Науковий керівник: доктор медичних наук, професор Дикий Ігор Леонідович, Національний фармацевтичний університет, завідувач кафедри мікробіології, вірусології та імунології

Офіційні опоненти:

доктор медичних наук, професор Мінухін Валерій Володимирович, Харківський державний медичний університет,

професор кафедри мікробіології, вірусології та імунології доктор біологічних наук, професор Руденко Адель Вікторівна, Інститут урології АМН України, завідувач лабораторії мікробіології, вірусології та мікології

Провідна установа: Інститут епідеміології та інфекційних хвороб ім. Л.В. Громашевського АМН України

Захист відбудеться "18" грудня 2002 р. годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.618.01 при Інституті мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14).

З дисертацією можна ознайомитись у бібліотеці Інституту мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова (61057, м. Харків, вул. Пушкінська, 14).

Автореферат розісланий "15" листопада 2002 р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради Д.64.618.01 Бруснік С.В.

Анотації

Гейдеріх О.Г. Піоціанін як антибактеріальний та імуногенний субстрат синьогнійної палички.- Рукопис.

Дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 03.00.07 - мікробіологія. - Інститут мікробіології та імунології ім. І.І. Мечнікова, Харків - 2002.

Дисертація присвячена вивченню антибактеріальних та імуногенних властивостей піоціаніну, розробці імуногенного препарату для специфічної профілактики та імунотерапії синьогнійної інфекції.

Встановлено, що за антигенними властивостями піоціанін має універсальну відповідність до різних серо- і біоварів синьогнійної палички. При вивчені антигенної активності нативного піоціаніну виявлений обмежений імунологічний потенціал, що проявляється продукцією антипіоціанінових антитіл, володіючих діагностичною, а не лікувально-профілактичною активністю.

Розроблено спосіб одержання імуногенної форми піоціаніну у виді натрієвої солі сульфоксифеназину, яка поєднує імуногенні й антибіотичні властивості.

Доведено, що гіперімунні антисульфооксифеназинові сироватки виявляють виражені лікувально-профілактичні властивості при генералізованій синьогнійній інфекції білих мишей.

Ключові слова: синьогнійна інфекція, синьогнійна паличка, піоціанін, натрієва сіль сульфооксифеназину.

Гейдерих О.Г. Пиоцианин как антибактериальный и иммуногенный субстрат синегнойной палочки. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности

03.00.07 - микробиология. - Институт микробиологии и иммунологии им. И.И. Мечникова, Харьков - 2002.

Проблема борьбы с госпитальными инфекциями отнесена в разряд наиболее актуальных разделов современной клинической медицины, прежде всего потому, что осложняя течение основного заболевания эти инфекции нередко обусловливают возникновение трудно по ддающихся эффективному лечению септикопиемических процессов, которые в значительном большинстве случаев заканчиваются летальным исходом.

Среди возбудителей госпитальных инфекций особое значение принадлежит синегнойной палочке, которая, характеризуясь определенными уровнями природной устойчивости к антибиотикам, антисептикам и дезинфектантам, способностью к широкой эпидемиологической циркуляции в хирургических, урологических, ожоговых и других отделениях, злокачественностью обусловливаемых септикопиемических осложнений, выраженным донорским потенциалом передачи R-плазмидной лекарственной устойчивости. Все это определяет значительные сложности в предупреждении госпитальной циркуляции синегнойной инфекции и выборе эффективных методов ее химиотерапии.

С учетом недостаточной эффективности химиопрофилактики и химиотерапии пиоцианозов одним из перспективных направлений признано разработку эффективных иммунобиологических препаратов, пригодных как для обеспечения протективно-значимых поствакцинальных эффектов, так и для получения гипериммунных сывороток и иммуноглобулинов с отчетливыми лечебными свойствами.

Разработка иммуногенных препаратов на основе использования обезвреженных поливакцин, анатоксинов и химических вакцин показала, что наряду с определенными проявлениями иммуногенных свойств эти препараты имеют ряд существенных недостатков, которые в целом ограничивают их использование в экспериментальной иммунологии. Последнее прежде всего состоит в том, что такие иммуногены отличаются моноспецифичностью относительно штамма-продуцента и непригодны для получения гипериммунных сывороток и иммуноглобулинов с универсально выраженными лечебно-профилактическими свойствами в отношении всего многообразия био- и сероваров синегнойной палочки.

Впервые в повестку исследований вынесено экспериментальное доказательство возможности субстратного использования пигмента пиоцианина для получения универсального иммунобиологического препарата с выраженными иммуногенными и антимикробными свойствами. Доказано, что пиоцианин как классический представитель оксифеназиновых пигментов обладает гаптенными свойствами, реализуемыми при гипериммунизации получением диагностических сывороток, не отличается значимыми лечебно-профилактическими свойствами.

Разработан способ придания иммуногенных свойств пиоцианину за счет введения в технологию его выделения серной кислоты. Полученная натриевая соль сульфооксифеназина оказалась способной при активной иммунизации обеспечивать ограниченный защитный эффект при моделировании локализованной и генерализованной синегнойной инфекции белых мышей. Одновременно использование полученного препарата в схеме гипериммунизации кроликов показало, что получаемые сыворотки отличаются выраженными на уровне 80-100 % лечебно-профилактическими свойствами при локализованной и генерализованной синегнойной инфекции экспериментальных животных.

Ключевые слова: синегнойная инфекция, синегнойная палочка, пиоцианин, натриевая соль сульфооксифеназина.

Geyderich O.G. Pyocyanin as antibacterial and immunogenic substance of Pseudomonas aeruginosa. - the Manuscript.

The dissertation is on competition of a scientific degree of the candidate of medical sciences on a speciality 03.00.07 - microbiology. - Institute of microbiology and immunology by I.I. Mеtchnicov, Kharkov - 2002.

The dissertation is devoted to study antibacterial and immunogenic properties of рyocyanin, development immunogenic preparation for a specific prophylaxis and immunotherapy of pyocyanic infection.

It was established, that pyocyanin has universal conformity to any other business sero- and biovar of Pseudomonas aeruginosa by antigenic properties. At investigation of antigenic activity of native pyocyanin is revealed limited immunological potential, which is shown by production antipyocianin antibodies which have diagnostic, instead of treatment-and-prophylactic activity.

The way of reception of the immunogenic form pyocyanin as sodic salt sulfooxyphenazini is developed which unites immunogenic and antibiotical property.

It is proved, that hyperimmune antisulfooxyphenazini serum expresses treatment-and-prophylactic properties at generalized pyocyanic infection of white mice.

Key words: pyocyanic infection, Pseudomonas aeruginosa, pyocyanin, sodic salt sulfooxyphenazini.

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Синьогнійна паличка є основним етіологічним фактором виникнення і поширення госпітальних інфекцій у клініках хірургічного, опікового, акушерського, урологічного, пульмонологічного й іншого профілю, ускладнюючи плин основного захворювання гнійними процесами і септикопієміями, що нерідко закінчуються летальним результатом (Исхакова Х.И., Баженов Л.Г.,1991; G. Stamos, G. Petrikkos, P. Zoga,1991; Harris Anthony, Forres-Viera Carlos, Venkataraman Lata, 1999). Природна стійкість синьогнійної палички до антибіотиків, антисептиків і дезинфектантів, багаторазово посилювана аж до значень абсолютної резистентності при контакті з застосовуваними для лікування препаратами, негативно впливає на ефективність хіміопрофілактики і хіміотерапії госпітальних піоціанозів.

У зв'язку з цим актуальним визнане імунологічне рішення проблеми госпітальної синьогнійної інфекції шляхом розробки ефективних імунопрофілактичних препаратів і одержання на основі їх використання гіперімунних антисиньогнійних сироваток і імуноглобулінів з вираженими лікувально-профілактичними властивостями (Станиславский Е.С., Колкер И.И.,1978; Назарчук Л.В.,1991). Однак численні спроби створення імунопрофілактичних препаратів на основі використання знешкоджених, атенуйованих, хімічних вакцин і анатоксинів не дали задовільних клінічних результатів як через недостатню імуногенну активність, так і антигенну автентичність, обмежену штамом-продуцентом чи визначеним сероваром синьогнійної палички. Разом з цим у спектрі проведених досліджень відсутні дані про вивчення імунобіологічних властивостей піоціаніну. Відносячись до типових представників пігментоутворюючих мікроорганізмів, синьогнійна паличка продукує широкий спектр пігментів, серед яких піоціаніну, що має оксифеназинову природу, належить широкий спектр біологічних властивостей, включаючи, перш за все, функції пігменту дихання бактеріальної клітини і бактеріоцину з вираженими антибіотичними властивостями. Тому не виключено, що у випадку визначення антигенних властивостей у піоціаніну цей пігмент може використовуватися як вихідний субстрат для розробки ефективного протисиньогнійного імунобіологічного препарату. піоціанін імуногенний антибактеріальний синьогнійний

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація виконана відповідно до комплексної програми Національного фармацевтичного університету "Створення нових лікарських препаратів на основі рослинної і природної сировини" (№ державної реєстрації 1980007008). Тема дисертації затверджена на РПК "Мікробіологія" (протокол № 11 від 19 березня 2002 року).

Мета і завдання дослідження. Мета роботи - визначити антигенні властивості піоціанину, довести універсальність їх відповідності для різних серо- і біоварів синьогнійної палички і розробити імуногенний препарат для специфічної профілактики та імунотерапії синьогнійної інфекції.

Для виконання сформульованої мети дисертаційного дослідження визначене послідовне рішення таких завдань:

1. Провести відбір перспективних штамів-продуцентів на підставі порівняльного зіставлення піоціанінпродуктивної функції референтних і клінічних культур синьогнійної палички;

2. Установити вплив антибіотикорезистентності на здатність синьогнійної палички до продукції піоціаніну;

3. Модифікувати рецептурний склад середовища Кінг з метою підвищення пігментоутворюючої функції синьогнійної палички;

4. Визначити спектр антимікробних властивостей піоціаніну;

5. На підставі аналізу антигенно перспективних компонентів в оксифеназиновій структурі піоціаніну обґрунтувати імуногенний потенціал цього пігменту синьогнійної палички;

6. Розробити імуногенну форму піоціаніну і на моделі локалізованої і генералізованої синьогнійної інфекції білих мишей оцінити імунопрофілактичні властивості отриманого препарату;

7. З використанням натрієвої солі сульфооксифеназину в розробленій схемі гіперімунізації кроликів одержати антипіоціанінові сироватки і випробувати їхні лікувально-профілактичні властивості при локалізованій і генералізованій синьогнійній інфекції білих мишей.

Об'єкт дослідження. Експериментальна синьогнійна інфекція.

Предмет дослідження. Синьогнійна паличка, піоціанін.

Методи дослідження. В роботі використаний комплекс мікробіологічних, імунологічних і імунофармакологічних методів досліджень.

Наукова новизна отриманих результатів. Теоретично обґрунтована й експериментально підтверджена наявність у пігменту піоціаніну антигенних властивостей, універсально виражених для різних серо- і біоварів синьогнійної палички. З урахуванням фізіологічної участі в процесах дихання синьогнійної палички визначена перспективність розробки на основі піоціаніну імуногенного протисиньогнійного препарату, лікувально-профілактична дія якого при імунізації повинна виявлятися здатністю формувати специфічний антитілогенез, що блокує енергетичний обмін бактеріальної клітки на рівні бактерицидного ефекту. Розроблено спосіб одержання імуногенної форми піоціаніну у виді натрієвої солі сульфооксифеназину, що при вакцинації білих мишей забезпечує виражені профілактичні ефекти при моделюванні локалізованої і генералізованої синьогнійної інфекції, а при гіперімунізації кроликів - одержання лікувально-профілактичних протисиньогнійних сироваток.

Практичне значення отриманих результатів. Запропоновано новий підхід до створення імунопрофілактичних протисиньогнійних препаратів на основі субстратного використання піоціаніну. Розроблено технологію одержання натрієвої солі сульфооксифеназину, обґрунтоване використання отриманого препарату для екстреної профілактики і ліквідації госпітальної інфекції. Крім того, розроблений препарат є перспективним для використання в якості імуногена при одержанні донорських гіперімунних сироваток і імуноглобулінів, призначених для імунотерапії опікової хвороби і септикопіємії синьогнійної етіології. Модифіковано рецептурну сполуку середовища Кінг, що дозволяє істотно підвищити піоціанінпродуктивні властивості синьогнійної палички.

Результати роботи впроваджені в навчальний процес на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Національного фармацевтичного університету, кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Харківського державного медичного університету, на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Дніпропетровської державної медичної академії МОЗ України.

Особистий внесок здобувача. В наукових працях, опублікованих зі співавторами Диким, І.Л., Філімоновою Н.І., Дикою О.М., Ковальовим В.М.,Заєць Т В.особисто автором:

- проведено запланований комплекс мікробіологічних, імунологічних і імунофармакологічних досліджень;

- виявлено антигенний потенціал пігменту піоціаніну;

- розроблена імуногенно активна натрієва сіль сульфооксифеназину;

- проведена статистична обробка одержаних результатів досліджень.

Апробація результатів дисертації. Основні фрагменти дисертації повідомлені в доповідях на V національному з'їзді фармацевтів України "Досягнення сучасної фармації та перспективи її розвитку в новому тисячолітті" (Харків, 1999), Міжнародній науковій конференції "Стратегія і тактика боротьби з інфекційними захворюваннями" (Харків, 2000), науковій конференції Національної фармацевтичної академії України (Харків, 2002).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 5 статей, у тому числі 3 у журналах, рекомендованих ВАК України. В публікаціях результатів досліджень в наукових виданнях з участю співавторів дисертанту належить основна частина внеску.

Обсяг і структура дисертації. Робота викладена на 139 сторінках машинописного тексту і складається з вступу, огляду літератури, розділу "Характеристика об'єктів і методів досліджень", 6 розділів власних досліджень, аналізу й обговорення результатів, висновків, практичних рекомендацій. Список літератури налічує 159 джерел вітчизняних і зарубіжних авторів. Матеріали дисертації ілюстровані 14 таблицями.

Основний зміст дисертації

Матеріали і методи дослідження. У роботі використані референс-штами синьогнійної палички "ІГН", РА-66-16, № 256, № 262 та культур грампозитивних і грамнегативних бактерій, одержаних з музею живих культур ДНДІСК ім. Л.А. Тарасевича та ІМІ ім. І.І. Мечнікова АМН України, а також клінічні штами, виділені від хворих з гнійно-запальними інфекційними захворюваннями.

При дослідженні хворих матеріал для бактеріологічних досліджень брали стерильним тампоном з ран та інших джерел залежно від локалізації вогнища запалення, після чого відповідно проводили посів на м'ясо-пептонний, цукровий бульйон, кров'яний агар, живильні середовища Ендо, Плоскирева й інші.

Клінічні штами ідентифіковані за тинкторіальними, морфологічними і біохімічними властивостями. Виділення чистих культур здійснювалося загальноприйнятими методами.

У роботі використано антибіотики різного механізму дії: серед інгібіторів синтезу клітинної стінки - азлоциллін, ампіциллін, ампіокс, бензилпеніцилін, карбеніцилін, оксацилін, цефазолін, цефотаксим, цефтриаксон; інгібіторів синтезу білка - амікацин, гентаміцин, доксициклін, канаміцин, кларитроміцин, лінкоміцин, стрептоміцин, тетрациклін, тобраміцин, хлорамфенікол, еритроміцин; інгібіторів клітинної мембрани - поліміксин; вибірково подавляючі синтез (обмін) нуклеїнових кислот - ДНК - офлоксацин, РНК - рифампіцин.

Визначення чутливості мікроорганізмів до антибіотиків проведено методом дворазових серійних розведень у рідкому живильному середовищі, методом паперових дисків, методом дифузії в агар. Для визначення селективного потенціалу досліджуваних препаратів використано методи послідовних пасажів у присутності їх постійних і зростаючих концентрацій, починаючи з вихідної субактивної дози в бульйоні Хоттингера.

Для визначення наявності синергізму за антимікробними властивостями між антибіотиками і піоціаніном використані дві методики. Відповідно до першої в живильному середовищі створювали сумарну бактеріостатичну концентрацію порівнюваних препаратів. Відповідно до другої методики в живильному середовищі створювали постійну субактивну концентрацію одного з порівнювальних препаратів, а другий - методом дворазових серійних розведень титрували в даному живильному середовищі.

Генералізовану гнійну інфекцію відтворювали за методом Г.Н. Першина (1972) шляхом внутрішньочеревного зараження білих мишей добовою культурою відповідного штаму синьогнійної палички в суміші з "голодним" агаром мінімальною смертельною дозою, що обумовлює загибель 80-100% тварин.

Ефективність лікування оцінювали по обліку кількості тварин, що вижили протягом терміну спостереження, і по тривалості життя, вираженої в мише-днях лікованих мишей у порівнянні з контрольними.

Для моделювання локалізованої гнійної інфекції білих мишей заражали підшкірно в область правого боку депільованої шкіри вірулентною культурою синьогнійної палички в дозі 40 млн мікробних тіл. Ефективність лікування оцінювали по кількості лікованих тварин, у яких гнійний процес не розвився і шляхом порівняння інтенсивності і ступеня ураження в групах лікованих і контрольних тварин.

Для відтворення експериментальної моделі інфікованого опіку в білих мишей обох статей вагою 25-30 г під ефірним наркозом викликали опік депільованої ділянки шкіри спини за допомогою спеціального пристрою - "п'яти". Через 3 години після травми опікову поверхню зрошували суспензією добової агарової культури синьогнійної палички в дозі 40 млн мікробних тіл. Ефективність лікування оцінювали по характеру гнійного ускладнення шляхом порівняння інтенсивності і ступеня поразки в групах лікованих і контрольних тварин.

Отриманий цифровий матеріал оброблено методом варіаційної статистики на IBM PC PENTIUM з використанням пакета програм "Excel-97", вірогідність розходжень визначали за t-критерієм Стьюдента.

Результати досліджень

Піоціанінпродуктивні властивості штамів синьогнійної палички

Виходячи з мети дисертаційного дослідження, що принципово підпорядковано розробці імунобіологічного препарату на основі піоціаніну, вважалося за доцільне на першому етапі досліджень вивчити піоціанінпродуктивні властивості референс- та клінічних штамів синьогнійної палички.

При цьому встановлено, що рекомендоване для пігментоутворення середовище Кінг, хоча і сприяє підвищенню цієї екскреторної функції синьогнійної палички, але супроводжується рівноцінним накопиченням не тільки піоціаніну, а й піорубіну, піомеланіну, a-оксифеназину (геміпіоціаніну). Останнє складає певні труднощі для ізольованого вилучення з поживного середовища піоціаніну. У зв'язку з цим нами проведені пошукові дослідження, що підпорядковані підвищенню спрямованої продукції піоціаніну культивуємими штамами синьогнійної палички. Показано, що додавання до рецептурного складу середовища Кінг аспарагінової кислоти у дозі 0,2-0,3 об/% сприяє вибірковому накопиченню піоціаніну, а також скороченню термінів отримання максимальної кількості цього пігменту у поживному середовищі.

Скринінгова оцінка здатності обраних штамів до пігментоутворення на універсальних та елективних поживних середовищах показала, що найбільш ефективно цей пігмент продукували антибіотикочутливі референс-штами "ІГН", РА-66-16, № 262. Одночасно клінічні штами, що відповідно виділені від хворих на синьогнійні пієлонефрити і аденоміти, характеризуються зменшеною здатністю до пігментоутворення. Порівняне дослідження показало, що більшість використаних в роботі клінічних штамів характеризуються вираженою полірезистентністю до 24 антибіотиків. Однак виявити вплив реєструємої лікарської стійкості на пігментоутворення клінічних штамів до неефективних антибіотиків не вдалося. Між тим показано, що піоціанінутворення пропорційно корелює з рівнями набуття штамами синьогнійної палички стійкості до поліміксину - чим чутливіший штам до поліміксину, тим більше виражена в нього здатність до піоціанінутворення і навпаки. На підставі цього запропоновано використання оцінки поліміксинорезистентності як індикаційного тесту, прогнозуючого вираженість піоціанінутворення.

Принципове значення для подальших досліджень становило розробка способу ефективного вилучення піоціаніну з поживного середовища. На першому етапі досліджень використано спосіб В.С. Деркача (1946 г.), який заснований на одержанні кристалічного піоціаніну в вигляді довгих голок темно-синього кольору шляхом екстракції дихлоретаном, переводу в солянокислий піоціанін, підлуження аміаком та вилучення хлороформом. При цьому встановлено, що середній вихід кристалічного піоціаніну становив 32,5 мг/100 мл. Отримані піоціаніни характеризувалися обмеженою водорозчинністю на рівні 4 мг/мл.

В зв'язку з тим, що свого часу піоціанін був охарактеризований як пігмент з вираженими антибіотичними властивостями, вважалось за доцільне підтвердити наявність цих біологічних властивостей у отриманих зразків цього пігменту. Проведені дослідження показали, що вилучені від культивування різних штамів синьогнійної палички зразки піоціанінів не відрізнялися за своїми антимікробними властивостями і виявляли бактеріостатичну дію відносно піогенних коків на рівні МІК 7,8-26,3 мкг/мл, сінної палички - 14,7-17,2 мкг/мл, кишкової палички - 15,6-18,8 мкг/мл, шигелл - 7,7-9,8 мкг/мл, сальмонел - 53,7-70,8 мкг/мл, клебсієл - 27,4-32,8 мкг/мл та кандіди - 233,7-267,7 мкг/мл. Відносно кишкової палички та клебсієл зразки досліджуваних піоціанінів виявляли вибіркову бактерицидну дію, а відносно інших - дозозалежні бактеріостатичну та бактерицидну активність. Крім того, вперше виявлено, що досліджуємі зразки піоціанінів виявляють виражену здатність по відношенню до спорогенних та неспорогенних анаеробів, включаючи C. perfringens, C. novyi, C. hystoliticum, B. fragis, C. sporogenes, P. melaninogenus, P.anaerobicus, F.necrophorym.

Проведені дослідження дали змогу дійти висновку про те, що спектр антимікробної активності піоціаніну відповідає антагоністичним властивостям синьогнійної палички і, таким чином, окрім виконання фізіологічної функції пігменту дихання для штама-продуцента самостійно або компонентно визначає конкурентні взаємовідносини синьогнійної палички з мікробами-антагоністами. Одночасно встановлено, що рівень антимікробної здатності дослідних піоціанінів зворотно залежить від показників антибіотикорезистентності мікробів-антагоністів.

Антигенні властивості піоціаніну

Ставлячи до дослідження наявності у піоціаніну можливих антигенних та імуногенних властивостей, перш за все враховано те, що маючи оксифеназиновую природу, піоціанін за своєю хіміко-біологічною структурою антигенно відповідає хімічній структурі гаптенів і в зв'язку з цим потенційно здатний до активізації антитілоутворення або імунних функцій Т-лімфоцитів.

Для підтвердження цього теоретичного посилання у вихідній позиції дослідження вивчено наявність антипіоціанінових антитіл, аглютинінів та антитоксинів у хворих на пієлонефрити та аденоміти з підтвердженою етіологічною відповідальністю синьогнійної палички. Встановлено, що середні титри аглютинінів сягають 1:59-1:64, титри до екзотоксину - 1:71-1:78, а титр антипіоціанінів - відповідно 1:36-1:45. Таким чином, було підтверджено, що піоціанін відрізняється відповідною антигенною здатністю, що свідчить про його участь в обтяженні патогенезу основного захворювання. В зв'язку з отриманими результатами актуальним для подальших досліджень визнано вивчення імуногенних властивостей піоціаніну шляхом отримання гіперімунних сироваток та випробуванням їх лікувально-профілактичних властивостей.

Гіперімунні антипіоціанінові сироватки отримували шляхом підшкірної гіперімунізації кролів піоціанінами, отриманими від штамів синьогнійної палички"ІГН", РА-66-16, №262 за схемою 4 мг-8 мг-12 мг-16 мг-20 мг з інтервалом між ін'єкціями 2-3 діб. Встановлено, що внаслідок проведеної імунізації в сироватках кролів накопичувались антипіоціанінові преципітини в середніх титрах 1:168-1:208. У зв'язку з тим, що метою дисертаційного дослідження визначено отримання універсального для різних серо- та біоварів синьогнійної палички імунобіологічного препарату, актуальним ставало підтвердження однотипності антигенних властивостей піоціанінів, що виділені при культивуванні різних штамів синьогнійної палички. Останнє досягнуто шляхом перехресного виснаження гіперімунних сироваток піоціанінами, що отримані від використаних штамів синьогнійної палички. За отриманими результатами встановлено, що досліджувані піоціаніни є антигенно ідентичними і здатні повністю виснажувати гетерогенні антипіоціанинові преципітини з отриманих гіперімунних сироваток. Це є об'єктивним підтвердженням антигенної універсальності піоціанінів як прогнозуємого профілактичного препарату при синьогнійній інфекції.

Впродовж досліджень вивчено лікувально-профілактичні властивості отриманих антипіоціанінових сироваток при генералізованій синьогнійній інфекції білих мишей. Генералізовану синьогнійну інфекцію білих мишей відтворювали шляхом внутрішньочеревного зараження добовими агаровими культурами різних штамів синьогнійної палички у дозі 5Ч 106 мікробних тіл в суміші з "голодним" агаром, що відповідає DL80-100. Лікувально-профілактичну здатність антипіоціанінових сироваток оцінювали шляхом щодобового, починаючи за добу до зараження, внутрішньосудинного введення їх тваринам в об'ємі 0,5 мл. Ефективність проведеного лікування оцінювали шляхом обліку кількості білих мишей, що пережили встановлений термін клінічного спостереження, порівняльного урахування мише-днів в дослідній та контрольній групах тварин а також по оцінці інтенсивності індукованих патоморфологічних змін в органах і тканинах тварин.

Проведені досліди показали, що отримані гіперімунні сироватки не виявляють реєструємих лікувально-профілактичних властивостей в порівнянні з контрольними тваринами. Однак слід відзначити деякі тенденції, які свідчать про деякий захисний вплив цих сироваток на перебіг генералізованої синьогнійної інфекції. Так, показники кількості мише-діб в контрольних та дослідних групах мишей відповідно склали 2,1 та 3,8, а патоморфологічний індекс враженості - відповідно 3,1 та 2,7.

Таким чином, згідно з отриманими результатами правомірно дійти висновку про те, що за антигенними властивостями піоціаніни відносяться до гаптенов, здатних при гіперімунізації формувати відповідні титри антипіоціанінових реагінів, що не відрізняються лікувально-профілактичними властивостями.

Потенціювання імуногенних властивостей піоціаніну

Встановлені позитивні характеристики піоціанінів, щодо активування при імунізації та гіперімунізації продукції антипіоціанінових преципітинів, що не відрізняються лікувально-профілактичною здатністю, визначають доцільність пошуків надання їм потрібних імуногенних властивостей. При цьому враховано, що відсутність лікувально-профілактичних проявів у піоціаніну пов'язано з тим, що цей пігмент, відносячись до оксифеназинових похідних, не відрізняється вміщенням білку та характеризується низькою молекулярністю, що сукупно негативно впливає на його імуногенну здатність. Одночасно, відсутність реєструємих протективних властивостей у гіперімунних сироваток може бути пов'язана з вибірковою блокуючою взаємодією відповідних антитіл і піоціаніну на позаклітинному, екстрацелюлярному рівні. Природно, що в такому випадку результатом спрямованої взаємодії поміж антигеном і антитілом може бути зниження пігментоутворення синьогнійної палички поза інгибуючого впливу на життєздатність бактеріальної клітини.

Визначаючи можливу перспективу "відкриття" імуногенних властивостей у піоціаніну, слід особливо підкреслити, що за своїм фізіологічним призначенням він відноситься до пігментів дихання синьогнійної палички. Тому припустимо, що в разі надання цьому пігменту властивостей повного антигену, або здатності відповідним гіперімунним сироваткам взаємодіяти з піоціаніном на внутрішньоклітинному рівні, їх лікувально-профілактичний ефект повинен досягатися за рахунок незворотної інгібіції нітратного механізму процесів анаеробного дихання синьогнійної палички.

Визначаючи напрямки удосконалення імуногенних властивостей піоціаніну як антигенного препарату доцільно виходити з визнаних в експериментальній імунології методологічних і методичних підходів щодо активації імуногенного потенціалу у гаптенів. Останнє може бути досягнуто двома основними шляхами. Перший з них передбачає підвищення вихідного рівня антигенної активності гаптена за рахунок використання у комплексній схемі гіперімунізації ад'юванта Фрейнда, або таких імуномодуляторів як метилурацил, продигіозан, імунал, ехінацея, пірогенал та інш. Іншим вірогідним вирішенням цього питання може бути модифікаційне змінення хімічної формули піоціаніну за рахунок спрямованого введення в оксифеназинову структуру пігменту компонентів або радикалів, що відрізняються властивостями шлеппер-білку (трактор-антигену) і, таким чином, здатні на протективно значущому рівні реалізувати імуногенний потенціал цього пігменту синьогнійної палички.

Для гіперімунізації кролів з метою отримання гіперімунних антипіоціанінових сироваток було використано повний ад'ювант Фрейнда, що виготовлений з водної емульсії піоціаніну, отриманого від культивування штамів синьогнійної палички "ІГН", РА-66-16, №262, мінерального масла, ланоліну і мікробних клітин вакцини БЦЖ. Співвідношення піоціанін/ад'ювант Фрейнда становило 1:5. Імунізацію кролів проведено підшкірно, у дозах 4 мг-8 мг-12 мг-16 мг-20 мг з інтервалом між ін'єкціями 2-3 доби.

Клінічними спостереженнями за імунізуємими тваринами встановлено, що у відповідь на перше введення цього препарату у кролів на фоні формуючого статусу лихоманки спостерігалось розвиток у зоні ін'єкції обмеженого інфільтрату щільної консистенції, що досягав максимуму розвитку до 3-4 доби і зберігався на весь термін проводимої гіперімунізації. При цьому кожне послідуюче введення випробуємого антигену також супроводжувалось розвитком запальних інфільтратів, розміри яких пропорційно відповідали використаній дозі.

Отримані гіперімунні сироватки характеризувалися наявністю титрів антипіоціанінових преципітинів на рівні 1:673 та аглютинінів до синьогнійної палички на рівні 1:183. Розглядаючи появу при використаному методі гіперімунізації кролів аглютинінів до синьогнійної палички, було встановлено, що перші ознаки цих антитіл простежуються на третю підшкірну ін'єкцію у дозі 12 мг, мають відповідний титр 1:22, а при використанні дози 20 мг сягають максимальних рівней накопичення в титрах 1:183. Виходячи з цього сформульовано припущення, що в даному випадку мова іде не надання за допомогою ад'юванта Фрейнда нових аглютиногенних властивостей піоціаніну, а за рахунок того, що при гіперімунізації цим препаратом досягається значно перевищуючі титри антипіоціанінових преципітинів. Таким чином, виникають умови для специфічної взаємодії антипреципітинових антитіл з піоціаніном не тільки на екзоцелюлярному, але й внутрішньоклітинному рівнях. Це імітує аглютиноційні властивості отриманих за допомогою ад'юванта Фрейнда антипіоціанінових сироваток. Останнє було підтверджено шляхом виснаження сироваток відповідними піоціанінами, коли разом зі зникненням антипіоціанінових преципітинів одночасно зникали і їх аглютинацій ні властивості.

В цілому задовільні результати від використання гіперімунізіції кролів ад'ювантною формою піоціаніну не свідчать про можливість використання такої форми препарату в клінічній медицині у зв'язку з невідповідністю за показниками біосумісності для організму. Тому до порядку подальших досліджень було включено вивчення можливої модифікації хімічної структури нативного пігменту з метою надання йому відповідних імуногенних властивостей.

Вирішення цього питання досягнуто шляхом включення в технологічний процес виділення піоціаніну з поживного середовища сірчаної кислоти Обґрунтуванням для такої модифікації класичного способу виділення піоціаніну служило те, що включений на етапі виділення сульфітний радикал, окрім надання оксифеназиновому пігменту синьогнійної палички корпускулярного укрупнення, несе в собі і певну імунологічну доцільність. Відомо, що сірка є обов'язковим неорганічним компонентом в хімічній структурі білків та амінокислот. Це стало обґрунтуванням для припущення, що, завдяки включенню сульфогрупи, модифікована структура піоціаніну повинна набути нові імунобіологічні властивості, що імітують для імунної системи білкову природу синьо-зеленого пігменту синьогнійної палички (схема 1).

При характеристиці основних властивостей отриманої натрієвої солі сульфооксифеназина принципове значення набувало підтвердження його відповідності біологічним властивостям нативного пігменту. В зв'язку з цим було вивчено наявність антимікробних властивостей у отриманого препарату по відношенню до 18 представників різних родів грампозитивних і грамнегативних патогенних та умовно-патогенних мікроорганізмів.

Схема одержання натрієвої солі сульфооксифеназину

Флакон з середовищем Кінг

висів пігментутворюючого штаму синьогнійної палички

культивування протягом 10-12 діб при t 370С в умовах штучного освітлення і шюттелювання

Зафарбований бульйонний фільтрат в темно-синій колір

центрифугування (8-10 тис. об/хв, 30 хв)

Бульйонний фільтрат, звільнений від мікробної маси

додавання 40% розчину H2SO4 з розрахунку 0,8-1,0 мл на 100 мл бульйонного фільтрату

Бульйонний фільтрат з осадом в виді червоно-бурих пластівців

центрифугування (8-10 тис. об/хв, 30 хв)

Осад - сульфооксифеназин

нейтралізація 0,01% розчином NaOH до повного розчинення сульфокислоти піоціаніну

ліофілізація

Натрієва сіль сульфооксифеназину

За результатами проведених досліджень встановлено, що комплексоутворення з сульфогрупою негативно не впливає на вихідний антимікробний потенціал піоціаніну. Більш того, порівняно з нативним пігментом отримана натрієва сіль сульфооксифеназину виявила антимікробну здатність, що проявлялася переважною бактерицидною дією на використані референс- і клінічні штами мікроорганізмів. При цьому середня кратність посилення бактерицидної здатності модифікованої форми піоціаніну відносно антибіотикочутливих мікроорганізмів становила 2,5 рази, а відносно резистентних - 8,4 рази. Слід наголосити на тому, що отриманий препарат виявив порівняно з нативним пігментом 22-кратне посилення бактерицидної дії відносно антибіотикорезистентних штамів кишкової палички, 4-кратне відносно сінної палички, а також не характерну для нативного піоціаніну бактерицидну дію на клінічний штам вульгарного протею та на референс- і клінічні штами кандіди.

Таким чином, проведені дослідження дають змогу дійти висновку про те, що розроблений спосіб отримання натрієвої солі сульфооксифеназину не виявляє негативного впливу на антимікробні властивості цього бактеріального пігменту. Останнє може розглядатися як прогностичний показник збереження або підсилення антигенних властивостей піоціаніну у формі натрієвої солі сульфооксифеназину.

Імунобіологічні властивості натрієвої солі сульфооксифеназину синьогнійної палички

Основною метою досліджень визнано підтвердження наявності у натрієвої солі сульфооксифеназина імуногенної здатності формувати в експерименті антимікробний та антитоксичний імунітет до синьогнійної інфекції.

При вивченні імунопрофілактичних властивостей отриманого препарату досліди проведені на білих мишах середньою вагою 18-20 г, яких перед зараженням підшкірно імунізували в дозах 40 мкг і 80 мкг з інтервалом 20 діб. Вивчення імунопрофілактичної здатності натрієвої солі сульфооксифеназина при локалізованій синьогнійній інфекції проведено на двох експериментальних моделях:

1. Підшкірне відтворення вогнища гнійного запалення шляхом введення вірулентної культури синьогнійної палички в дозі 40 млн мікробних тіл.

2. Зрошення відтвореної опікової поверхні змивом добової агарової культури синьогнійної палички в дозі 40 млн мікробних тіл.

Проведені дослідження показали, що в разі підшкірного зараження білих мишей імунізація натрієвою сіллю сульфооксифеназина попереджує у 25 % тварин виникнення процесу запалення, у 60 % - доброякісний розвиток інфільтратів запалення зі зворотним розвитком на протязі 2-3 діб і лише у 15 % - розвиток вогнища запалення з некрозами, розміри яких не перевищували 3-5 мм. При цьому середній показник ушкодження в розрахунку на 1 мишу становив 0,9, а середній термін заживлення в групі не перевищував 3 діб.

Одночасно підшкірне зараження тварин контрольної групи виявило у 90 % розвиток вогнища некротичного запалення з обтяженими проявами виникнення значних за розмірами некрозів та абсцесів.

Враховуючи те, що в клінічних умовах синьогнійна паличка виступає як визначаючий етіологічний фактор інфекційного ускладнення опікової хвороби, оцінка лікувально-профілактичних властивостей натрієвої солі сульфооксифеназина при цьому методі зараження білих мишей максимально наближає умови експерименту до відповідної клінічної патології. На підставі проведених досліджень встановлено, що у

15 % імунізованих білих мишей зрошувальне інфікування опікової поверхні не знайшло свого клінічного вирішення. У інших тварин визначені ознаки гнійного ускладнення опікової поверхні. Однак, в порівнянні з контролем, їх прояви були більш доброякісними. Так у 50% тварин на поверхні інфікованого опіку виявлялося утворення мілкоточечних, множинних вогнищ мікронекрозів, що супроводжувалось незначним ексудатом серозно-геморагічного або гнійного характеру. На 3-4 добу після виникнення поверхня опіку очищалася від некротичних ускладнень, відкривала активні грануляції, що виповнювали тканевий дефект з формуванням рубця на період 12-15 доби. У 30 % імунізованих білих мишей характер гнійних ускладнень опікової поверхні за інтенсивністю своїх проявів відповідав контрольним показникам.

Таким чином встановлено, що при моделюванні локалізованої гнійно-запальної та опікової синьогнійної інфекції натрієва сіль сульфооксифеназина виявляє достатні лікувально-профілактичні властивості.

Для відтворення генералізованої синьогнійної інфекції зараження білих мишей дослідної імунізованої та контрольної груп проводили внутрішньочеревним введенням агарової культури штаму синьогнійної палички "ІГН" в дозі 40 млн мікробних тіл. Результати проведених досліджень показали, що в дослідній групі показник виживаємості становив 15 %, а в контрольній - 0,5 %. Порівняно з групою контрольних тварин встановлено, що сумаційна кількість становила 72 мише-дні, а в контрольній - 39. Це співвідношення простежено і для усередненого показнику мише-днів в порівнюваних групах. В дослідній він склав 3,5, а в контрольній - 1,9 мише-дні, тобто імунізовані тварини гинули в середньому на 1,6 дня пізніше ніж контрольні.

Узагальнюючи результати вивчення лікувально-профілактичних властивостей натрієвої солі сульфооксифеназина при відтворенні локалізованої та генералізованої синьогнійної інфекції можна дійти висновку про те, що двократна підшкірна імунізація в дозі 40 мкг і 80 мкг з інтервалами 20 діб супроводжується розвитком гуморального імунітету, достатнього як часткового попередження, так і більш доброякісного перебігу модельованої експериментальної інфекції.

За виключенням шпитального розповсюдження синьогнійна інфекція не має виразних епідеміологічних характеристик і в клінічній практиці реєструється як спорадичне гнійно-запальне захворювання. З цього виходить, що масова, тим паче обов'язкова профілактика синьогнійної інфекції епідеміологічно не обґрунтована. Разом з тим, піоціанози в значній кількості випадків протікають обтяжено у виді септикопіємії. Останнє вимагає створення відповідних серологічних препаратів з вираженими лікувально-профілактичними властивостями. З урахуванням цього, проведено порівняне вивчення антигенних властивостей нативного, ад'ювантного піоціаніну і натрієвої солі сульфооксифеназина при підшкірній імунізації кролів в дозах 4 мг-8 мг-12 мг-16 мг-20мг. Результати проведеної імунізації показали, що нативний піоціанін у своїх антигенних властивостях орієнтований на індукцію антипіоціанінових преципітинів. Ад'ювантний піоціанін і натрієва сіль сульфооксифеназину забезпечують накопичення в сироватках імунізованих кролів преципітинів та аглютинінів відповідно в титрах 1:679-1:732 та 1:170-1:319.

Вивчення лікувально-профілактичних властивостей отриманих антипіоціанінових сироваток проведено на моделі генералізованої синьогнійної інфекції, відтвореної з використанням суміші добових агарових культур штамів "ІГН", РА-66-16, №262. Лікування заражених тварин проводили за слідуючими схемами:

1. Одноразове внутрішньочеревне введення відповідних сироваток в дозі 0,5 мл/миші за добу до зараження.

2. Одноразове внутрішньочеревне введення відповідних сироваток в дозі 0,5 мл/миші одночасно з зараженням.

3. Дворазове щодобове внутрішньочеревне введення сироваток у разовій дозі 0,5 мл/миші, починаючи з другої доби після зараження.

Результати проведених досліджень дали можливість дійти принципового висновку про те, що використана гіперімунна сироватка, яка отримана від використання піоціаніна з ад'ювантом Фрейнда забезпечує достатньо виражений лікувально-профілактичний ефект при генералізованій синьогнійній інфекції білих мишей. При цьому встановлено, що їх протективна здатність не залежить від розбіжностей біоварної належності штамів синьогнійної палички, але корелює з використаним методом серотерапії.

Так, при одноразовому внутрішньочеревному введенні сироватки за добу до зараження виживаємість в порівнюваних дослідних групах мишей становила в середньому 57 %, в той час як у контролі летальність сягала 100 %. При одночасному з зараженням внутрішньочеревному введенні гіперімунної сироватки її захисний ефект становив 52 %, а при двократному внутрішньочеревному введенні, починаючи через добу після зараження, - відповідно 66 %.

Підтвердження достатньості імуногенного потенціалу у ад'ювантої форми піоціаніну тим не менше не має перспектив для отримання відповідних серопрепаратів, здатних для клінічного використання, перш за все тому, що для отримання таких імунобіологічних препаратів використовуються донори-добровольці. Виходячи з цього ставало доцільним в порівнянні з ад'ювантою формою піоціаніну дослідити імуногенний потенціал натрієвої солі сульфооксифеназину при отриманні відповідних гіперімунних сироваток. Результати проведених досліджень показали, що за рівнями лікувально-профілактичної здатності отримана антисульфооксифеназинова сироватка не тільки не поступається, але і дещо перевищує захисну здатність свого аналогу.

При порівняльному аналізі звертає увагу те, що антисульфооксифеназинова сироватка забезпечує перевищуючий і рівноцінно виражений захисний ефект при моделюванні генералізованої синьогнійної інфекції у білих мишей, що перевищує порівнювальний показник ад'ювантних сироваток в 1,2 рази, а групові значення мише-днів на 22 доби відповідно.

Ще більш вираженими виявилися лікувально-профілактичні переваги цієї гіперімунної сироватки при використанні схеми двократного внутрішньочеревного введення через добу після зараження білих мишей. Так в групі білих мишей інфікованих штамом "ІГН" захисний ефект склав за показниками виживаємості 100 %, а в групі мишей, що відповідно заражені штамами синьогнійної палички РА-66-16, № 263 - відповідно 85,7% (табл.1).

Примітки: х/ - враховуємий термін виживаємості тварин дослідних груп обмежений періодом 100% загибелі тварин контрольної групи;

хх/ - у дужках представлений середній термін тривалості життя тварин у групі;

ххх/ - цифрове вираження ураженості органів при патоморфологічному дослідженні.

Таким чином проведені дослідження показали, що натрієва сіль сульфооксифеназина характеризується лікувально-профілактичними властивостями і здатна при гіперімунізації забезпечувати одержання високоактивних гіперімунних сироваток, здатних до попередження розвитку генералізованої синьогнійної інфекції у білих мишей.

Висновки

Піоціанози відносяться до основних збудників госпітальних, опікових, хірургічних і урологічних інфекцій, що характеризуються обтяженим клінічним плином, високими рівнями смертності і складністю адекватного вибору ефективних засобів хіміотерапії. У цьому зв'язку перспективним визначено розробку імунобіологічних препаратів для специфічної профілактики і лікування синьогнійної інфекції.

1. Установлено, що продукуємий синьогнійною паличкою піоціанін володіє універсально вираженою для різних серо- і біоварів антигенною активністю.

2. У зв'язку з оксифеназиновою структурою піоціанін за антигенною здатністю характеризується як гаптен, імунологічний потенціал якого обмежується індукцією антипіоціаніновіх антитіл, що не відрізняються лікувально-профілактичною активністю. Останнє обумовлено недостатньою антигенною активністю нативного пиоцианину у формуванні напружених антипіоціанінових сироваток, здатних взаємодіяти з продукуємим пігментом не тільки на позаклітинному, але і на внутрішньоклітинному рівнях.

3. Перспективність використання піоціаніну як універсального імунобіологічного препарату визначається його фізіологічним призначенням як пігменту, що приймає участь у визначенні процесів дихання синьогнійної палички. Тому у випадку надання піоціаніну достатньої антигенної активності, одержувані специфічні сироватки, крім взаємодії з пігментом на позаклітинному рівні повинні блокувати енергетичний обмін мікробної клітини і забезпечувати тим самим в інфікованому організмі лікувально-профілактичні ефекти.

4. Розроблено спосіб одержання імуногенної форми піоціаніну у виді натрієвої солі сульфооксифеназину. Суть способу складається в накопиченні пігменту при культивуванні штаму-продуценту синьогнійної палички на модифікованому додаванням аспарагінової кислоти середовищі Кінг, переводу піоціаніну в нерозчинний сульфооксифеназин дозованим додаванням концентрованої сірчаної кислоти, відділенні сульфооксифеназину від культурального середовища центрифугуванням і одержанням розчинної солі сульфооксифеназину шляхом титрування їдким лугом.

5. Натрієва сіль сульфооксифеназину при імунізації забезпечує серологічну відповідь у виді напружених титрів преципитинів до піоціаніну й аглютинінів до синьогнійної палички.

6. У зв'язку зі збереженням властивої піоціаніну антимікробної активності натрієва сіль сульфооксифеназину являє собою оригінальний імунобіологічний препарат, що поєднує імуногенні й антибіотичні властивості.

7. Імунопрофілактичний потенціал натрієвої солі сульфооксифеназину при локалізованій синьогнійній інфекції виявляється попередженням захворювання в 25%, а при осередковій опіковій і генералізованій - відповідно в 15 % тварин. У тварин із проривом імунітету відзначена більш доброякісна, у порівнянні з контролем, клінічна і патоморфологічна картина прояву синьогнійної інфекції.

8. Гіперімунні антисульфооксифеназинові сироватки відрізняються вираженими лікувально-профілактичними властивостями при генералізованій синьогнійній інфекції білих мишей. При однократному внутрішньочеревному введенні до- і одночасно з зараженням виживаність інфікованих тварин складає 57-72%, а при дворазовому внутрішньочеревному введенні через добу після зараження - 85,7-100%.

Практичні рекомендації

1. Запропоновано для впровадження у практику бактеріологічних лабораторій модифікованого поживного середовища Кінг, що суттєво поліпшує культуральні властивості синьогнійної палички та сприяє максимальному накопиченню піоціаніну.

2. Рекомендовано для індикаційної оцінки піоціанінпродуктивних спроможностей дослідження чутливості синьогнійної палички до поліміксину.

3. Розроблено спосіб отримання натрієвої солі сульфооксифеназину, що перспективний для отримання ефективних за лікувально-профілактичними властивостями гіперімунних антисиньогнійних сироваток.

Список праць, опублікованих за темою дисертації

1. Піоціанін як імуногенна субстанція синьогнійної палички / І.Л.Дикий, Н.І.Філімонова, О.Г. Гейдеріх, О.М. Дика, В.М. Ковальов // Вісник Фармації. - 1999.- №2/20.- С.137-140. (Особиста участь - розроблено спосіб виділення піоціаніну з середовища вирощування синьогнійної палички, модифіковано поживне середовище, обґрунтувано імунологічні властивості та одержано натрієву сіль сульфооксифеназину - 70 %).

2. Дикий И.Л., Гейдерих О.Г. Пиоцианин. Антимикробные свойства и синергизм с антибиотиками // Лекарства - человеку. - 2001. - Т. ХV, №1-2. - С. 158-164. (Особиста участь - розроблено технологію вилучення піоціаніну з поживного середовища, вивчено його технологічні властивості, обґрунтовано доцільність використання піоціаніну при створенні мазі з антимікробними властивостями - 80 %).