Размещено на http://allbest.ru

Министерство здравоохранения Республики Беларусь

УО «Витебский государственный медицинский университет»

Кафедра клинической микробиологии

Реферат на тему:

«Респираторно-синцитиальный вирус»

Подготовила:

студентка 3 -го курса 11группы

фармацевтического факультета

Лизогуб Н.С.

Проверила:

доцент Железняк Н.В

Витебск, 2013



• Оглавление

Введение

1. Свойства

2. Роль в патологии

2.1 Характеристика заболевания

2.1.1 Определение

2.1.2 Вирусные возбудители бронхиолита6

2.1.3 Группа риска

2.1.4 Путь инфекции

2.1.5 Патофизиология

2.1.6 Клиническая картина

2.1.7 Иммунитет

3. Лабораторная диагностика

3.1 Основные методы

3.1.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса

3.1.1.1 Чувствительные культуры клеток

3.1.1.2 Цитопатогенное действие

3.1.1.3 Методы повышения инфекционности

3.1.1.4 Методы стабилизации инфекционности

3.1.2 Методы определения инфекционности

3.1.3 Гемагглютинация

3.1.4 Гемадсорбция

3.1.5 Иммунофлуоресцентные методы

3.1.6. Твердофазный иммуноферментный анализ

3.2 Аналитические методы

3.2.1 радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация

3.2.1.1 Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках

3.2.1.2 Радиоиммуноанализ

3.2.1.3 Радиоиммунопреципитация

3.2.2 Метод выявления дефектных интерферирующих частиц

3.2.3 Электронная микроскопия

4. Лечение и профилактика

Заключение

Список использованной литературы



Введение

Респираторный синцитиальный вирус человека (англ. RSV, Human respiratory syncytial virus) -- вирус, вызывающий инфекции дыхательных путей. Респираторный синцитиальный вирус является основной причиной инфекций нижних дыхательных путей у новорожденных и детей. От данного вируса не существует вакцины. Лечение ограничено поддерживающей терапией, возможно применение кислородной маски.

В странах с умеренным климатом ежегодные эпидемии имеют место в зимние месяцы, в странах с тропическим климатом, заболевания респираторным синцитиальным вирусом как правило регистрируются в период дождей.

В США до 60 % младенцев заражаются респираторным синцитиальным вирусом во время первого эпидемического сезона, и практически все дети переносят инфекцию к возрасту двух-трех лет. Среди всех инфицированных респираторным синцитиальным вирусом лишь у 2-3% возникает капиллярный бронхит и имеются показания к госпитализации.

Инфекция респираторным синцитиальным вирусом активирует систему иммунной защиты, эффективность которой снижается со временем значительно быстрее, чем в случае других вирусных инфекций, таким образом, человек может быть заражен данным вирусом несколько раз. Некоторые новорожденные могут быть инфицированы несколько раз даже в период одного эпидемического сезона. Тяжелые инфекции значительно часто встречаются среди пожилых людей.



1. Свойства

В состав группы пневмовирусов входят респираторно-синцитиальный вирус человека, респираторно-синцитиальный вирус крупного рогатого скота и вирус пневмонии мышей. РСВ принадлежит роду Pneumovirus, который вместе с родами Paramyxovirus и Morbillivirus образует семейство Paramyxoviridae.

Однозначно доказана этиологическая роль РСВ при ежегодных вспышках респираторных заболеваний у детей. Уникальность биологических, биохимических и клинических характеристик этого вируса не позволяет объединить его с представителями рода Paramyxovirus.

Вирион сферической формы, диаметр его варьирует у отдельных частиц от 120 до 200 нм. Геном представлен однонитевой нефрагментированной негативной РНК с м. м. около 5,6 МД; она несет, очевидно, 10 генов, кодирующих 10 вирусспецифических белков, из которых 7 входят в состав вириона, а остальные являются неструктурными. RS-вирус отличается от других парамиксовирусов тем, что у него не обнаружены гемагглютинин и нейраминидаза, и он не обладает гемолитической активностью. Структура генома такова: 3'-lC-lB-N-P-M-lA-G-F-22K-L-5'.

Белки G и F -- гликопротеиды, которые входят в состав суперкапсида и образуют поверхностные шипы. Белок G обеспечивает фиксацию вируса на чувствительных клетках, а белок F обеспечивает слияние двух типов:

а) слияние мембраны вируса с мембраной клетки и ее лизосом;

б) слияние инфицированной клетки с прилегающими неинфицированными клетками, вследствие чего и образуется синцитий -- симпласт из клеток, связанных между собой цитоплазматическими отростками («сетчатая ткань»).

Этот феномен и послужил основанием назвать вирус «респираторно-синцитиальным». Белки N, Р и L (полимеразный комплекс, содержащий транскриптазу) входят в состав нуклеокапсида.

Белки М и К связаны с внутренней поверхностью суперкапсида вириона. Функции остальных белков пока не известны. По антигенным свойствам различают два сероварианта вируса.

Вирус хорошо размножается в культурах многих штаммов перевиваемых клеток (HeLa, НЕр-2 и др.) с проявлением характерного цитопатического действия, а также с образованием бляшек; не культивируется на куриных эмбрионах. RS-вирус очень лабилен и легко разрушается при замораживании и оттаивании, при обработке жирорастворителями, детергентами, различными дезинфицирующими веществами; при нагревании до 55 градусов Цельсия погибает за 5--10 мин.



2. Роль в патологии

Источником инфекции является больной человек. Заражение происходит воздушно-капельным путем. Инкубационный период 3--5 дней. Вирус размножается в эпителиальных клетках дыхательных путей, процесс быстро распространяется и на их нижние отделы.

Особенно тяжело заболевание протекает у детей первых шести месяцев жизни в виде бронхита, бронхиолита, пневмонии. У 75% детей трехлетнего возраста обнаруживаются антитела к вирусу.

2.1 Характеристика заболевания

2.1.1 Определение

Бронхиолит - это воспалительно-обструктивное заболевание мельчайших бронхов и бронхиол.

Клинически оно определяется как заболевание с хрипами, вызываемое вирусной или бактериальной инфекцией, приводящей к воспалению мельчайших дыхательных путей. В клинических исследованиях оно часто определяется как первый эпизод Giemens у ребенка в возрасте до 24 месяцев с признаками вирусной инфекции.

2.1.2 Вирусные возбудители бронхиолита

RSV ответственно за 45-75% бронхиолитов в грудном возрасте, менее часто это связано с вирусами параинфлюецы 1-3 (14-33%), аденовирусами (3-10%), вирусами инфлюенцы (5-8%), риновирусами (3-8%), а также метапневмовирусами, энтеровирусами и Mycoplasma pneumoniae. У детей с пневмонией (50%), бронхитом (10-30%) и стенозирующим ларинготрахеитом (Krupp-Syndrome) (10%) RSV встречается реже.



2.1.3 Группа риска

Дети с основными заболеваниями такими, например, как иммунодепрессия, недоношенные, дети с бронхо-пульмональной дисплазией или заболеваниями сердца обладают несколько повышенным риском заболеть RSV- инфекцией с тяжелым течением.

Кроме того, риск считается повышенным у грудных детей мужского пола, грудных детей, имеющих братьев и сестер, посещающих детские учреждения, с экспозицией к сигаретному дыму, со стесненными жилищными условиями и низкими социально-экономическим статусом.

2.1.4 Путь инфекции

Распространение RSV происходит путем капельной инфекции и через контакт с дыхательным секретом, как грязевая инфекция. Время инкубации составляет 3-6 дней.

Как правило, инфицирование начинается через 1 день после заражения, то есть еще до начала симптомов.

Длительность инфицирования различная: у иммунокомпетентных взрослых она составляет до 7 дней, у новорожденных и недоношенных с тяжелыми RSV инфекциями до 4 недель. Иммуносупримированные могут выделять RSV до нескольких месяцев после инфекции RSV.

· На поверхностях вирус остается инфекционным до 6 часов, и до 30 минут на носовых платках и тканях.

Молодые люди и взрослые могут статься асимптоматичными или симптоматичными переносчиками. RSV часто заносится в семью одним из братьев или сестер школьного возраста.

2.1.5 Патофизиология

Входными воротами для RSV служит респираторный эпителий верхних дыхательных путей. RSV-инфекция может проявляться как ринит, фарингит, трахеобронхит или средний отит, или распространяться в нижних дыхательных путях и там вызывать брохиолит или пневмонию.

У первых возникает воспаление перибронхиальной ткани с образованием отека подслизистой и адвентиции, а также чрезмерное выделение слизи. В тяжелых случаях развиваются некрозы респираторного эпителия, которые усиливают обструкцию мелких бронхов и могут привести к образованию пробки.

Через механизм «air traspping» (захват воздуха), при котором во время инспирации воздух может попадать в дистальные отделы легких, а при экспирации плохо проникает через вентильный механизм, возникает перерастяжение легочной ткани. И как следствие, возможно развитие ателектазов при полной абсорбции воздуха из полностью заложенных участков легких. Грудные дети по причине относительно маленьких дыхательных путей особенно подвержены обструкции.

2.1.6 Клиническая картина

После продромальной стадии с кашлем и насморком проявляется бронхиолит с хрипами и слабой ли-хорадкой, а также, в зависимости от степени тяжести, проблемами с питьем, тахипное и диспное. При обследовании выявляются интер- и субкостальные втяжения, перерастянутая грудная клетка и иногда цианоз. При аускультации могут быть слышны Knisterrasseln, экспираторные хрипы и удлиненный выдох.

Апное, особенно у маленьких грудных детей, может оказаться первым клиническим признаком бронхиолита.

Гипоксемия (<95% насыщения кислородом) часто может быть установлена с помощью пульс-оксиметрии. При соответствующей клинике диагноз RSV-бронхиолита у грудного ребенка во время RSV-сезона устанавиливается с большой вероятностью.

Радиологические изменения легких при бронхиолите вариабельны и проявляются перерастяжениями легких, перибронхиальными уплотнениями и редкими ателектазами.

2.1.7 Иммунитет

Иммунитет к RSV не полный, часты реинфекции и в настоящее время развивающиеся в тот же сезон. Во время сезона RSV чаще всего поддаются выделению два штамма вируса RS (A и B), однако от сезона к сезону преобладают меняющиеся подтипы.

Штаммы отличаются в основном по антигенной структуре G-поверхностных протеинов. Другие поверхностные протеины очень похожи. Так штаммы А и В дают 90% соответствие по протеиновой структуре F-протеинов. Антитела, такие как Palivizumab, направленные против F-протеинов, считаются перекрестно-активными, то есть они действенны против различных штаммов.



3. Лабораторная диагностика

Лабораторная диагностика основана на быстром обнаружении вирусных антигенов в отделяемом носоглотки (у погибших исследуют ткани легких, трахеи, бронхов) с помощью иммунофлуоресцентного метода, выделении и идентификации вируса и определении специфических антител.

Для выделения вируса исследуемым материалом заражают культуры клеток, о его размножении судят по характерному цитопатическому эффекту; вирус идентифицируют с помощью иммунофлуоресцентного метода, РСК и реакции нейтрализации в культуре клеток.

3.1 Основные методы

3.1.1 Культивирование респираторно-синцитиального вируса

3.1.1.1 Чувствительные культуры клеток

Имеется большой набор клеточных линий, чувствительных к РСВ. В диагностических лабораториях чаще всего используют линию гетероплоидных клеток человека Нер-2, поскольку ее легко поддерживать.

Тем не менее для выделения РСВ более подходят диплоидные линии клеток человека, например эмбриональных клеток легких WI-38, HeL-1, L-4, L-49, HLDC-1, - 4, - 6 и эмбриональных клеток мозга НВС-1 и НВС-4.

РСВ размножается и в разнообразных культурах клеток животных, в частности в клетках почек кошек, норок и кенгуровой крысы. Степень чувствительности разных линий клеток, по-видимому, зависит от схемы пассирования используемого штамма вируса.

Например, после трех пассажей через, индивидуальные бляшки на культуре клеток WI-38 полученный изолят вируса давал на этих клетках в 50 раз более высокий титр, чем вирус, пассируемый на клетках BS-C-1.

РСВ может быть адаптирован и к росту в некоторых первичных культурах клеток холоднокровных животных, например черепахи Testudo graced, но он не размножается в клетках земноводных и беспозвоночных, в частности комаров. В отличие от многих других парамиксовирусов РСВ не размножается в куриных эмбрионах и культуре клеток куриного эмбриона. Кроме того, в отличие от вируса пневмонии мышей он не размножается в клетках ВНК-21.

При серийном пассировании РСВ с высокой частотой образуются дефектные интерферирующие частицы. Разработан простой колориметрический метод обнаружения и количественного определения ДИЧ.

Для размножения РСВ в культуре клеток можно использовать основную минимальную среду Игла, желательно с дополнительными аминокислотами. Лучший выход вируса, как правило, дают активно делящиеся клетки.

Можно использовать и другие среды, например среду Лейбовича, для поддержания рН которой не требуется газообразная СОг. Температура размножения РСВ составляет 25-39 °С; максимальный выход получают при температуре около 37°С.

3.1.1.2 Цитопатогенное действие

Характерное для РСВ цитопатогенное действие - это образование синцития. В синцитиях ядра клеток часто образуют агрегаты, окружающие центральную полость. Однако формирование синцития наблюдается далеко не всегда; характер ЦПД определяется многими факторами, в том числе штаммом вируса, условиями культивирования и типом клеток. Например, при заражении клеток почек африканской зеленой мартышки образуются фокусы агрегированных клеток.

Под агаровым покрытием они выглядят как интенсивно окрашенные сгустки клеток, напоминающие фокусы трансформации, индуцируемые онкогенными вирусами. Однако индуцируемые РСВ фокусы окружены слабо окрашенной областью (рис.2). Ее образование обусловлено миграцией клеток к формирующемуся скоплению. Фокусы состоят из увеличившихся в размерах разбухших клеток, которые затем дают начало синцитию. Несмотря на внешнее сходство фокусов, индуцируемых онкогенными вирусами и РСВ, клетки последних не сохраняют способность к делению.

3.1.1.3 Методы повышения инфекционности

Обработка вируса или клеток ДЭАЭ-декстраном повышает чувствительность клеток к РСВ. При оптимальной концентрации, равной 40 мкг/мл, ДЭАЭ-декстран в 2 раза повышает выход вируса; имеются данные и о том, что число клеток, зараженных РСВ крупного рогатого скота, возрастает в этих условиях в 11 раз. Нисевич и др. сообщили о 100-кратном увеличении числа клеток, зараженных РСВ человека, в присутствии 15 мкг/мл ДЭАЭ-декстрана.

3.1.1.4 Методы стабилизации инфекционности

Инфекционность РСВ стабилизируется в присутствии высоких концентраций сахарозы или ионов магния. Ферни и Герин сообщили, что в присутствии 1 М MgS04 стабильность РСВ возросла в 30 раз и период полужизни инфекционного вируса при 4°С увеличился до 12 нед. Добавление MgS04 до концентрации 1 М облегчает очистку РСВ для физико-химических исследований, однако при выделении вируса и определении его инфекционной активности добавление MgS04 нежелательно, поскольку высокая ионная сила оказывает отрицательное воздействие на культуры клеток.



3.1.2 Методы определения инфекционности

Инфекционность препаратов РСВ можно определить методом бляшек. Метод, описываемый здесь для клеток BS-C-1, пригоден и для работы с большинством других клеточных культур.

1. Высевают по 106 клеток в чашки Петри диаметром 60 мм. Чашки инкубируют в течение ночи при 37 °С и используют клетки сразу же после образования плотного монослоя.

2. Культуральную среду удаляют и вносят в чашки по 0,2 мл последовательных 10-кратных разведений вирусного препарата. Для приготовления разведений можно использовать буферный раствор, например PBS, или, предпочтительно, среду MEM.

В обоих случаях используемый для разведения вируса раствор должен содержать 0,5% ЭТС и антибиотики.

3. Культуру инкубируют 1 ч при 31 °С для адсорбции вируса.

4. В каждую чашку вносят по 5 мл покрытия. Удаление инокулята необязательно. В качестве покрытия можно использовать среду MEM, содержащую 1-2% ЭТС, антибиотики и 0,9% агара. Эту среду готовят, смешивая равные объемы нагретой до 37 °С среды MEM в двойной концентрации и расплавленного 1,8% -ного агара Нобль. При температуре 43-46 °С агар не застывает, и покрытие можно наносить на слой клеток без их повреждения.

5. Клетки инкубируют 3-5 сут. при 31-39°С; время инкубации зависит от температуры: чем выше температура, тем короче время инкубации.

Для приготовления стабильных препаратов, в которых можно подсчитывать бляшки через длительное время после опыта, в каждую чашку добавляют 2 мл 1%-ного раствора глутарового альдегида в PBS и оставляют при комнатной температуре по крайней мере на 4 ч для фиксации. Фиксирующий раствор и агаровое покрытие удаляют и добавляют в чашки раствор подходящего красителя, окрашивают в течение 5 мин, затем тщательно промывают водой и сушат.

Для максимально точного подсчета бляшек необходим бинокулярный микроскоп с небольшим увеличением. Для окрашивания можно использовать и 0,01%-ный раствор нейтрального красного в PBS или в среде, содержащей 0,9% агара.

Обычно для усиления контраста из состава агарового покрытия исключают феноловый красный, но это не имеет принципиального значения. Окрашивание раствором нейтрального красного проходит быстрее, однако такие препараты нестабильны и подвержены фотохимическому повреждению под действием света.

Окрашивание с помощью твердого нейтрального красного, входящего в состав агарового покрытия, происходит медленнее, однако в тех случаях, когда необходимо выделить инфекционный вирус из индивидуальных бляшек, данный метод явно предпочтительнее.

3.1.3. Гемагглютинация

В культуральной жидкости инфицированных РСВ клеток гемагглютинин не обнаруживается. Гемагглютинация с эритроцитами человека, африканской зеленой мартышки, макаки-резуса, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, гуся, овцы, свиньи, курицы и цыпленка не отмечена.

С другой стороны, ВПМ агглютинирует эритроциты мыши и хомячка. Методические аспекты постановки реакции гемаглютинации описаны в работе Компанса и др.

3.1.4. Гемадсорбция

Адсорбция эритроцитов на клетках, зараженных РСВ, не описана. Негативные результаты получены с эритроцитами африканской зеленой мартышки, шимпанзе, обезьяны гелады, морской свинки, крысы, хомячка, мыши, утки, гуся, голубя, курицы и цыпленка. Однако клетки, зараженные ВПМ, связывают эритроциты мыши; технические детали описаны Ком-пансом и др. .

3.1.5 Иммунофлуоресцентные методы

Иммунофлуоресцентное окрашивание с помощью поликлональной антисыворотки представляет собой удобный и точный метод подсчета зараженных клеток и выявления места размножения вируса при анализе фиксированных срезов зараженных тканей. Используя моноклональные антитела против индивидуальных вирусных полипептидов, иммунофлуоресцентным методом можно изучать и внутриклеточную локализацию вирусных антигенов.

Иммунофлуоресцентное окрашивание применяется также для быстрой диагностики вирусных инфекций. Это направление недавно рассмотрено в исчерпывающих обзорах, а конкретные методы обнаружения РСВ в клиническом материале описаны в работе Гарднера и др. Иммунофлуоресценция - более точный метод выявления РСВ в организме больного, чем непосредственное выделение вируса, поскольку в период реконвалесценции после вызванного РСВ заболевания зараженные клетки бывают покрыты противовирусными антителами.

Непрямая иммунофлуоресценция более чувствительна, чем прямая, однако при ее использовании возникает проблема неспецифической флуоресценции. Ее можно устранить предварительным истощением антисыворотки и антииммуноглобулинового конъюгата обработанной ацетоном культурой клеток или гомогенатом печени животных. Обработка клеток ацетоном проводится следующим образом:

1. 10s-109 клеток снимают со стекла и получают суспензию.

2. Клетки концентрируют центрифугированием и ресуспендируют в 0,01 М PBS; эту процедуру повторяют трижды.

3. Осадок клеток ресуспендируют: 5 мин в 10-кратном объеме ацетона и вновь осаждают клетки.

4. Клетки ресуспендируют в 0,01 М PBS и проводят 6 циклов осаждения для полного удаления ацетона. После этого клетки можно хранить до употребления в 0,01 М PBS при - 20 °С.

Ниже приведена стандартная методика для выявления антигенов РСВ в зараженных клетках методом непрямой иммунофлуоресценции.

1. В пластиковые чашки диаметром 50 мм помещают тщательно вымытые и дегидратированные этанолом покровные стекла и высевают по ЫО6 клеток BS-C-1. Инкубируют клетки 24 ч, промывают и заражают РСВ с множественностью инфекции около 1 БОЕ/кл.

2. После адсорбции вируса в течение 2 ч покровные стекла с зараженными клетками тщательно промывают средой MEM, содержащей 2,5% ЭТС, и инкубируют при 31 или 39 °С.

3. Через 40-48 ч после заражения клетки фиксируют на 5 мин в охлажденном до 4°С ацетоне, высушивают на воздухе 30 мин и хранят при - 20 °С.

4. Антивирусную сыворотку истощают обработанными ацетоном клетками BS-C-1 при 4°С и используют в подобранном оптимальном разведении. Кроличья сыворотка против глобулинов нескольких видов животных, конъюгированная с изотиоцианатом флуоресцеина, имеется в продаже. Конъюгат истощают обработанным ацетоном гомогенатом печени мыши или клетками BS-C-1 при 4°С.

5. Покровные стекла инкубируют с антивирусной сывороткой 1 ч при 37 °С, промывают и инкубируют еще 45 мин при 37 °С с соответствующим конъюгатом.

6. После промывки препараты заключают в забуференный глицерин и исследуют под флуоресцентным микроскопом. Рис.3 иллюстрирует разрешение, которое может быть получено при использовании данного метода.

Доказательствами специфичности иммунофлуоресценции могут служить:

1) отсутствие флуоресценции незараженных клеток BS-C-1;

2) отсутствие флуоресценции при использовании ЭТС вместо специфической с зараженными РСВ клетками;

3) отсутствие флуоресценции после истощения противовирусной сыворотки зараженными клетками.

Высокой чувствительностью обладает и иммунопероксидазный метод; его преимущество состоит в том, что он не требует использования микроскопа с ультрафиолетовой оптикой.

3.1.6. Твердофазный иммуноферментный анализ

ELISA - еще один иммунологический метод быстрого обнаружения и количественного определения РСВ. Ниже приведена типичная методика.

1. Лунки планшета для иммунологических реакций покрывают зараженными или незараженными клетками, или РСВ, очищенным центрифугированием в градиенте. Это делается одним из следующих методов:

а) клетки выращивают в лунках планшета и через ряд заражают РСВ. Когда в лунках с зараженными клетками проявляется ЦПД, клетки промывают, фиксируют раствором, содержащим этанол и уксусную кислоту, и хранят при - 20 °С;

б) в лунки планшета вносят РСВ, очищенный центрифугированием в градиенте, и высушивают в течение ночи при 37°С.

Если имеются клетки, персистентно инфицированные РСВ, их можно использовать в качестве источника антигена вместо литически инфицированных клеток.

2. Перед началом анализа все лунки планшета покрывают 5% -ным раствором БСА в PBS. В каждый опыт следует включать негативный контроль и позитивный контроль. В лунки планшета вносят образцы вируса и инкубируют в течение ночи при 4°С. Планшет промывают и добавляют овечьи антитела против иммуноглобулинов мыши, конъюгированные с пероксидазой хрена в рекомендуемом разведении. Планшет инкубируют 1 ч при 37 °С, промывают, добавляют субстрат, о-фенилендиамин, и инкубируют при 37 °С еще 30 мин. Реакцию останавливают добавлением 4,5 М H2SO4 и учитывают результаты с помощью ридера "Мультискан".

Хиерхольцер и др. описали методику, позволяющую с помощью ELISA количественно выявлять белковые полосы после электрофореза и переноса белков на нитроцеллюлозные мембраны, так называемый метод "вестерн-блотинга". Преимущество этого метода состоит в том, что он не требует использования радиоактивных изотопов.

3.2 Аналитические методы

3.2.1 Радиоактивное лечение, радиоиммуноанализ и радиоиммунопреципитация

3.2.1.1 Введение радиоактивной метки в вирусные белки в зараженных РСВ клетках

1. Оптимальные условия для мечения вирусных белков достигаются при добавлении к зараженным клеткам через 18 ч после заражения актиномицина D в концентрации 2,5 мкг/мл.

Белки РСВ удается эффективно пометить смесью - Meтионина и - цистеина по следующей методике.

2. Через 2 ч после внесения актиномицина D культур ал ьную среду заменяют на среду, содержащую 50 мкКи/мл L--Meтионина и 25 мкКи/мл Ь--цистеина.

3. Клетки инкубируют 16 ч при 37 °С или до проявления выраженного ЦПД.

4. Монослой промывают, солюбилизируют клетки и экстрагируют белки лизирующим буфером.

5. После инкубации в течение 2 ч при комнатной температуре лизат используют для электрофореза или хранят при - 20 °С.



3.2.1.2 Радиоиммуноанализ

Метод прямого RIA с использованием в качестве вторых антител меченных 1251 гамма-глобулинов сыворотки козы против глобулинов мыши, а в качестве субстрата - фиксированных метанолом персистентно инфицированных РСВ клеток описан Коутом и др. .

3.2.1.3 Радиоиммунопреципитация

Радиоиммунопреципитация проводится стандартным методом, описанным, например, Ферни и Герином и Уордом и др. Для РСВ применяют следующую методику.

1. "Монослойные культуры клеток в чашках Петри диаметром 50 мм заражают РСВ с множественностью инфекции более 1 БОЕ/кл. Через определенные промежутки времени после заражения проводят импульсное мечение. Для этого культуральную среду в чашках заменяют на 1 мл PBS, содержащего 30 мкКи - метионина и 25 мкКи - цистеина, и инкубируют чашки при 31 °С 1 ч.

2. Радиоактивный раствор сливают и монослой промывают охлажденным PBS.

3. Клетки снимают со стекла с помощью стерильной резиновой палочки и осаждают центрифугированием.

4. Клетки ресуспендируют в 200 мкл лизирующего буфера, инкубируют суспензию 30 мин в ледяной бане, затем интенсивно перемешивают.

5. Ядра и клеточный дебрис удаляют центрифугированием 5 мин при 10 000 g.

6. Лизат осветляют инкубацией с 50 мкл 10% -ной суспензии фиксированных формалином стафилококков или с 50 мкл суспензии покрытых белком-А гранул 30 мин при 0°С.

7. Стафилококки удаляют центрифугированием. К 50 мкл лизата добавляют 10 мкл гипериммунной сыворотки, перемешивают и инкубируют 3 ч во льду.

8. Добавляют 100 мкл суспензии стафилококков, перемешивают и инкубируют смесь 30 мин при комнатной температуре.

9. Иммунные комплексы осаждают центрифугированием 20 с при 10 000 g.

10. Осадок 3 раза промывают раствором, содержащим 500 мМ LiCl, 100 мМ трис-HCl, рН 8,5.

11. Осадок после промывки ресуспендируют в 50 мкл смеыг для диссоциации, кипятят 2 мин и либо немедленно наносят на гель для электрофореза, либо хранят при - 20 °С.

3.2.2 Метод выявления дефектных интерферирующих частиц

Дефектные интерферирующие частицы и стандартные вирионы РСВ не удается разделить физическими методами, на проявление устойчивой к ультрафиолетовому облучению и чувствительной к нейтрализующим антителам интерферирующей активности при пассировании вируса с высокой множественностью инфекции свидетельствует о накоплении ДИЧ. Разра-Зотзн колориметрический метод количественного определения ДИЧ в препаратах РСВ.

Он основан на измерении интенсивности окрашивания, обусловленного поглощением нейтрального красного клетками, которые выживают при заражении стандартным вирусом в результате защиты ДИЧ. Приводятся данные о том, что колориметрический метод чувствительнее, чем метод, основанный на определении снижения выхода вируса. Колориметрический анализ проводят следующим образом.

1. Монослойные культуры клеток Нер-2, выращенные в лунках планшета диаметром 16 мм, инкубируют с содержащим ДИЧ материалом 2 ч при 37 °С.

2. Содержащий ДИЧ иннокулят удаляют и заражают клетки стандартным вирусом, полученным в результате пассирования с низкой множественностью, и продолжают адсорбцию 2 ч при 37 °С.

3. В каждую лунку вносят по 1 мл культуральной среды и инкубируют клетки 72 ч при 37 °С.

4. Среду удаляют и вносят в каждую лунку по 0,5 мл нейтрального красного в растворе Эрла; инкубацию клеток продолжают еще 2 ч при 37 °С.

5. Краситель удаляют и клетки дважды промывают PBS.

6. Краситель экстрагируют из клеток 1 мл 50% -ного этанола, содержащим 0,1 М NaH2P04, и определяют его количество спектрофотометрически при 540 нм. Полученные данные сравнивают с количеством красителя, экстрагированного из незараженных клеток и из клеток, зараженных стандартным вирусом.

Концентрацию ДИЧ можно рассчитать следующим образом, предполагая, что их распределение по клеткам подчиняется закону Пуассона:

число ДИЧ/мл= 1/разведение, обеспечивающее выживание 63% клеток Х общее число клеток X 1/объем иннокулята.

3.2.3 Электронная микроскопия

Пневмовирусы исключительно многообразны по форме; кроме того, их вирионы и нуклеокапсиды нестабильны и легко повреждаются при обычных процедурах концентрирования вирусов. Поэтому точный подсчет вирусных частиц практически невозможен.

Трансмиссионная электронная микроскопия удобна для идентификации вирусов и изучения морфологии и морфогенеза вирионов. Сканирующая электронная микроскопия используется для изучения морфологии поверхности зараженных клеток, а также для количественного определения поверхностных антигенов на основе специфического связывания бактериальных клеток.

бронхиолит вирус иммуноферментный

4. Лечение и профилактика

Симптоматическое лечение

Мероприятия при стационарном лечении RSV- бронхиолита :

·«Minimal handling» ;

Клиническое наблюдение;

· Мониторинг (насыщение кислородом, частота сердечных сокращений);

· Дача кислорода (увлажненного, подогретого) при насыщении кислородом ниже 92% , с капиллярным контролем pCO2;

· Очищение назофаринкса с помощью назофарингеального отсасывания, снижающие отек капли в нос, промывание носа 0,9% NaCl .

В зависимости от степени тяжести дополнительно применяется:

·СРАР-вспоможение дыханию, интубация и искусственное дыхание;

·Достаточное поступление жидкости, иногда внутривенно;

· Прекращение приема пищи через рот только при тяжелой симпттоматике.

Каузальное лечение

Ribavarin

Эффективность дорогого ингаляционного лечения острого RSV- бронхиолита виростатиком Ribavarin до сих не имеет достаточных подтверждений. Ингаляция исходного раствора 60 mg Ribavarin/ml проводится с помощью генератора аэрозолей 2 раза 2 часа через eine Haube.

· Так как имеется существенная озабоченность в отношении потенциальной мутагенности, то это затрудняет применение ингалятивного рибаварина в практике.

Он должен приберегаться для пациентов высокого риска с тяжелейшим течение RSV- инфекции. При RSV- инфекциях у иммунносупримированных пациентов, например, после транплантации стволовых клеток, сегодня рибаварин отчасти применяется внутривенно.

Рекомендация. Широкое применение рибаварина при недостаточном проявлении эффективности и высокой стоимости может не рекомендоваться, применение у пациентов с существенными предсуществующими заболеваниями или у тяжело пораженных пациентов может проводиться после взвешивания всех за и против врачом.

Целью профилактики RSV должно быть снижение общей заболеваемости и смертности. Наибольшее значение отводится общим гигиеническим мероприятиям, направленным на предотвращение инфек-ции. Кроме того, существует возможность пассивной RSV-иммунопрофилактики Palivzumab.

Активная вакцинация RSV до сих отсутствует. Прежде всего, целью превентивных мероприятий являются дети с высоким риском тяжелых RSV-заболеваний, так как они, с одной стороны, чаще заболевают тяжелыми RSV-инфекциями, а с другой стороны, чаще всего по причине их основных заболеваний несут большую нагрузку в связи с заболеванием и частыми госпитализациями. Другой важной задачей профилактики является предотвращение нозокомикальных RSV-инфекций, составляющими большую часть наиболее тяжелых RSV-инфекций.

Общие мероприятия.

Для профилактики RSV-заболеваний у детей с повышенным риском тяжелых RSV-инфекций служат :

1.Предотвращение экспозиции к сигаретному дыму;

2.Грудное вскармливание;

3.Предотвращение экспозиции к RSV путем:

а) тщательного мытья рук персонала контактирующего с инфекциями дыхательных путей

б) избегание окружения с высокой экспозицией к RSV (детские сады и ясли, большие собрания персонала) во время сезона RSV.

Профилактика нозокомикальных инфекций в больницах.

Для этого проводятся следующие мероприятия:

· Ранее тестирование на RSV при клиническом подозрении на RSV и планируемый прием в стационар,

· Когортизация RSV-положительных в больницах,

· Перед переводом контроль данных антигенов (из-за продолжительности выделения).

При близком контакте с больным обращать внимание на:

· Дезинфекцию рук;

· Ношение халата;

· Одноразовых перчаток;

· Защиту рта;

· Защиту носа;

· Поверхностную дезинфекция.

Активная вакцинация против RSV

В настоящее время она отсутствует. Разработка активных вакцин связана с трудностями. В идеале новорожденные должны по возможности вакцинироваться как можно раньше постпартально, так как существует возрастной пик заболевания.

К этому времени иммунная система новорожденных еще не сформировалась, и материнские антитела могут препятствовать успеху вакцинации. В настоящее время идет разработка ген-технологичной аттенюированной вакцины. Доступность активной вакцины однако в обозримом будущем маловероятна.



Заключение

В терапии бронхиолита должны последовательно применяться хорошо подтвердившие свою эффективность симптоматические мероприятия: «minimal handling», клиническое и пульс-оксиметрическое наблюдение, очищение назофаринегеальных дыхательных путей, достаточное поступление жидкости.

В зависимости от тяжести заболевания бывает необходимо проводить ограничения в приеме пищи, своевременное вспоможение дыханию с помощью CPAP, но очень редко интубацию и искусственное дыхание.

Возможно применение бронходилататоров, стероидов и Ribavarin в рамках попыток лечения по специальным показаниям, широкое применение этих препаратов при RSV-бронхиолите не рационально. У детей с риском общие инфекционно гигиенические мероприятия по предотвращению RSV-инфекции очень просты, экономичны и рациональны. Инфекционно гигиенические мероприятия и последующая когортизация могут также способствовать профилактике протекающих с высокой морбидностью нозокомикальных инфекций.

Пассивная иммунопрофилактика с Palivizumab по предотвращению тяжелых RSV-инфекций ограничена по эффективности и рекомендуется преимущественно для недоношенных <28 SSW, новорожденных с бронхопульмональной дисплазией и для детей с гемодинамически значимыми пороками сердца.



Список использованной литературы

1. Медицинская вирусология. Учебное пособие. Под ред. Д.К. Новикова.- Витебск: ВГМУ, 2002.-с. 52-53

2. Популярная медицинская энциклопедия. Гл. ред. Б.В.Петровский. - М.: «Советская энциклопедия», 1987 г.

3. Дикий И. Л., Стегний М. Ю. «Микробиология»-- Х.:НФАУ, 2001 г.

4. Мотузный В. О. «Биология». Учебное пособие.-- К.: «Выща школа»,1997г.

5. Древо познания. Организм человека.

Размещено на Allbest.ru