Коопераційні моноклональні антитіла проти фактора некрозу пухлин людини

Размещено на http://www.allbest.ru

Размещено на http://www.allbest.ru

Вступ

Актуальність теми. Важливою перевагою поліклональних антитіл (пкАт) над моноклональними (мкАт) є поліепітопна специфічність та кооперативність, тобто адаптація антитіл різної епітопної специфічності до взаємопідсилюючого зв'язування молекул антигену. Саме тому пкАт залишаються незамінними в методах по кількісному визначенню й нейтралізації цитокінів, де потрібно їх найбільш повне зв'язування незалежно від присутності цитокінзв'язуючих факторів.

Для підвищення ефективності мкАт в методах по кількісному визначенню й нейтралізації цитокінів і більш повного використання переваг гібридомної технології виявляється актуальним отримання мкАт, які здатні подібно до пкАт зв'язувати молекули цитокінів з ефектом коопераційного підсилення. Оскільки коопераційні мкАт адаптовані до високоефективного зв'язування цитокінів в умовах in vivo, їх використання в імуноферментному аналізі (ІФА) і функціональній нейтралізації цитокінів може значно підвищити ефективність даних методів і бути перспективним підходом в стандартизації ІФА-систем для визначення цитокінів. Отримання і характеристика коопераційних мкАт також дозволить вивчити механізми коопераційного зв'язування цитокінів, епітопну специфічність і нейтралізуючу активність коопераційних мкАт, що важливо для розуміння їх функціонального значення в регуляції активності цитокінів in vivo.

Як об'єкт дослідження по отриманню і характеристиці коопераційних мкАт значний інтерес являє фактор некрозу пухлин (ФНП), оскільки: ФНП відіграє провідну роль у розвитку запальних процесів різної етіології, і його визначення являє значний клінічний інтерес; ФНП в умовах in vivo знаходиться у складі комплексів з розчинними формами ФНП-рецепторів (рФНП-Р), і його коректне визначення можливе лише за допомогою ІФА, який виявляє рецепторзв'язаний ФНП; дослідження комерційних ІФА-наборів експертною групою ВООЗ продемонструвало значну варіабельність визначення ФНП у контрольних зразках і поставило першочерговою задачею відпрацювання стандартних критеріїв, які визначають придатність мкАт для використання в ІФА; нейтралізація ФНП при деяких системних аутоімунних захворюваннях має терапевтичний ефект і визначає актуальність вивчення механізмів нейтралізації ФНП препаратами мкАт.

Meта і завдання дослідження. Отримати коопераційні мкАт до ФНП, вивчити їх імунохімічні і функціональні властивості та оцінити практичне значення коопераційних мкАт для вдосконалення методів нейтралізації і кількісного визначення ФНП.

Для досягнення поставленої мети вирішувались наступні завдання:

1. Отримати панель анти-ФНП мкАт у кількості не менше 20-ти, включаючи не менше 5-ти нейтралізуючих мкАт;

2. Дати імунохімічну характеристику анти-ФНП мкАт по ізотипах Ig, епітопній специфічності та афінності;

3. Визначити нейтралізуючу активність мкАт кількісним методом і оцінити ступінь впливу епітопної специфічності та афінності мкАт на ефективність нейтралізації ФНП;

4. Провести епітопне картування рецепторзв'язуючої ділянки ФНП і вивчити механізми його нейтралізації мкАт різної епітопної специфічності;

5. Виявити пари коопераційних анти-ФНП мкАт і оцінити умови їх отримання і функціональне значення;

6. Розробити на основі коопераційних мкАт тест-систему типу ІФА для визначення ФНП в крові та інших тканинних рідинах з повним описом аналітичних характеристик і визначенням нормальних показників вмісту ФНП в крові та амніотичній рідині;

7. Провести апробацію розробленої тест-системи у клінічних дослідженнях по визначенню ФНП в крові при різних нозологічних формах дифузної хвороби сполучної тканини у дітей і в амніотичній рідині при аномаліях розвитку плаценти і плоду.

1. Матеріали та методи дослідження

Рекомбінантний ФНП людини (чистота >95%, питома активність 4 Ч 107 од/мг) отриманий від Fermentas MBI (Вільнюс, Литва) і НВО “Вектор” (Бердськ, Росія). Біологічний стандарт ФНП людини (№ 87/650) отримано з NIBCS (National Institute for Biological Standards and Control, Hertfordshire, Еngland). Високоочищені препарати р55 і р75 рФНО-Р, мкАт проти р55 (mAb №20) і р75 (mAb №13), а також анти-р55 і анти-р75 пкАт люб'язно надані проф. Wallach D. (Weizmann Institute of Science, Rehovot, Israel). Всі біохімічні реагенти отримані від Sigma Chemical Co., США.

Клітинні лінії мишиної мієломи Sp2/0 і фібросаркоми L929 отримані з інституту цитології РАН (Санкт-Петербург, Росія). Лінії епітеліальної карциноми людини НЕр-2 і гістіоцитарної мієломи U937 отримані з інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім. Р.Є. Кавецького НАНУ. Клітини Sp2/0 та гібридоми культивувалися на повному середовищі IMDM з 10% ембріональної телячої сироватки (ЕСТ; Bio-Mark Inc., Львів). Клітини L929, НЕр-2 і U937 культивувалися на повному середовищі RPMI-1640 з 5% ЕСТ.

Імуноферментний аналіз виконували на спеціалізованому обладнанні фірм Wallac (Фінляндія) і Labsystems (Фінляндія). Включення 3Н-тимідину вимірювали на приладі Betaplate (Wallac). Вимірювання флуоресценції хелатів європію проводили на флуориметрі з часовим розподіленням ARCUS 1230 (Wallac). Проточну цитофлуориметрію виконували на приладі FACScan (Becton-Dickinson, США).

Миші BALB/c були імунізовані ФНП за типовою для розчинних антигенів схемою (Campbell, 1991) у варіантах підшкірної або внутрішньочеревної ін'єкції ФНП на повному ад'юванті Фрейнда. Титри анти-ФНП Ат у сироватці визначали непрямим ІФА. Спленоцити мишей з титром >1/32000 зливали 50%-м розчином поліетиленгліколю з мієломою Sp2/0. Отримання гібридом проводили за методом Kцhler і Milstein (1975) з урахуванням деяких модифікацій (Fazekas de St. Groth, Scheidegger D, 1980; Goding, 1980). Гібридоми нарощували в асцитній формі у сенсибілізованих пристаном BALB/c мишей. Препарати мкАт отримували з асцитної рідини методом послідовної преципітації каприловою кислотою та сульфатом амонію (McKinney, Parkinson, 1987) з наступною афінною очисткою на протеїн А-сефарозі (Pharmacia, Швеція). Біотинілювання мкАт проводили в реакції з сульфо-NHS-біотином (Pierce, США) в умовах, які забезпечують зв'язування 2-5 молекул біотину на молекулу IgG. Антисироватку до ФНП з титром вище 1/106 отримували від імунізованих ФНП кролів. Афінноочищені кролячі анти-ФНП пкАт отримували хроматографією IgG-фракції антисироватки на ФНП-сефарозі, яка була одержана кон'югацією ФНП з CNBr-сефарозою (Pharmacia).

Біологічну активність ФНП оцінювали за цитотоксичною дією на клітини L929 і HEp-2 у тесті з кристалічним фіолетовим (Aggarwal et al, 1985) і по апоптозному ефекту на клітини U937 у тесті з 3Н-тимідином (Higuchi et al, 1995). Нейтралізуючу активність мкАт визначали кількісно в значеннях молярного надлишку мкАт до ФНП для 100% нейтралізації або в нейтралізуючих одиницях на 1 мг мкАт. Ізотипи Ig і IgG субкласи мкАт визначали непрямим ІФА. Афінність мкАт визначали неконкурентним ІФА (Beatty et al, 1987). Картування епітопів, рецепторзв'язуючої ділянки (РЗД) ФНП і виявлення коопераційних мкАт виконували методом зворотнього конкурентного аналізу за допомогою кон'югату ФНП-європій по загальній схемі, яку запропонували Ehrlich і Moyle (1986). Для мічення ФНП використовували комерційний набір реагентів “Europium-labelling kit” (Wallac). Крім конкурентного аналізу з рФНО-Р, здатність мкАт розпізнавати рецепторзв'язаний ФНП визначали методом проточної цитофлуориметрії на клітинах U937, попередньо оброблених ФНП.

Визначення ФНП за допомогою коопераційних мкАт виконувалось в “сендвіч” - варіанті неконкурентного ІФА. Включення ФНП до складу “сендвіча” проходило в одній інкубації з парою коопераційних мкАт, які складали “нижній” і “верхній” компоненти “сендвіча”. Аналітичні характеристики розробленого ІФА визначались згідно загальноприйнятих вимог (Tijssen, 1985). Розчинні р55 та р75 ФНО-Р визначали неконкурентним ІФА (Aderka et al, 1991).

Для статистичного аналізу використовувались наступні методи: (1) тест Колмогорова-Смирнова для нормального розподілу; (2) t-тест Стьюдента і U-тест Mann-Whitney для порівняння середніх величин в непарних вибірках; (3) тест Wilcoxon для порівняння середніх величин в парних вибірках; (4) кореляційний і регресійний аналіз. Відмінності вважались достовірними при p<0.05.

2. Результати досліджень та їх обговорення

Для підвищення ймовірності отримання різноепітопних мкАт використовувались два типи імунізації мишей BALB/c препаратом ФНП: внутрішньочеревна і підшкірна. Відповідно до титрів анти-ФНП Ат в сироватці, ефективність підшкірної імунізації була в середньому в 2.3 рази вищою, ніж при внутрішньочеревній імунізації, що відповідало кількості отриманих гібридом від цих імунізацій - 16 і 7 відповідно.

Епітопний аналіз 23-х отриманих анти-ФНП мкАт показав, що їх специфічність розподілена в межах 3-х епітопних регіонів (ЕР) ФНП, позначених як А, В, і С. Кожен ЕР включає 2-3 епітопи, один із яких є найбільш імуногенним або домінуючим (А1, В1 і С1) згідно з більшим числом мкАт, які його представляють. Решта епітопів (А2, А3; В2, В3; С2) менш імуногенні і представлені окремими мкАт. Всі мкАт, які були отримані за допомогою внутрішньочеревної імунізації, відрізнялись моноспецифічністю до С1 епітопу, тоді як мкАт від підшкірної імунізації мали специфічність проти всіх епітопів, але з більшістю мкАт IgG ізотипу до А1 і В1 епітопів.

Ідентифікація 3-х головних ЕР ФНП, які містять домінуючий епітоп високої імуногенності і суміжні епітопи більш низької імуногенності, дозволяє передбачати спрямований характер генерації мкАт до цих ЕР з різним ступенем реалізації. Для цього може бути дві причини. По-перше, з приводу структурних обмежень, ФНП має тільки три конформаційностійких ділянки, до яких можлива генерація високоафінних мкАт, і, по-друге, з приводу функціональних обмежень, молекула ФНП містить три ділянки, при зв'язуванні яких досягається його нейтралізація, тобто саме ефект нейтралізації ФНП виступає фактором селекції епітопного репертуару анти-ФНП антитіл. При вивченні залежності нейтралізуючої активності мкАт від їх афінності та епітопної специфічності було встановлено, що високоафінні мкАт (із Kа>109M-1) кожного ЕР є нейтралізуючими, причому у межах кожного ЕР нейтралізуюча активність окремих мкАт знижується при зниженні їх афінності саме до повної втрати ефекту нейтралізації при афінності нижче від певного рівня. На цій підставі правомірно стверджувати, що генерація анти-ФНП мкАт проти окремих ЕР визначається їх потенційною здатністю нейтралізувати біологічну активність ФНП, але внаслідок недостатньої афінності деяких мкАт цей ефект проявляється не завжди.

Наявність нейтралізуючих анти-ФНП мкАт різної епітопної специфічності вказує на можливість існування різних механізмів нейтралізації ФНП. Типовим є конкурентний механізм, коли мкАт розпізнають епітопи, розташовані в межах РЗД і його екрануванням блокують зв'язування ФНП з ФНП-Р. Можливим є також алостеричний механізм, коли мкАт, зв'язуючи РЗД-незалежні епітопи, провокують конформаційні зміни у РЗД і, таким чином, відміняють взаємодію ФНП з ФНП-Р. Для визначення цих механізмів проводилося картування РЗД відносно епітопів нейтралізуючих мкАт з використанням препаратів р55 і р75 розчинних ФНП-Р (рФНП-Р). Всі нейтралізуючі мкАт незалежно від епітопної специфічності повністю блокували зв'язування ФНП з рФНП-Р. Однак комплекси ФНП з рФНП-Р зв'язувались ЕР-А і ЕР-В, але не ЕР-С мкАт. Аналогічні результати були отримані на клітинних ФНП-Р, де ФНП, зв'язаний ФНО-Р клітин U937, розпізнавався ЕР-А і ЕР-В, але не ЕР-С мкАт. Крім того, в умовах селективної сорбції ФНП на р55 або р75 ФНП-Р було встановлено, що ЕР-А мкАт в однаковій мірі розпізнають ФНП зв'язаний як з р55, так і з р75 ФНО-Р, а ЕР-В мкАт виявляють тільки ФНП, асоційований з р75 ФНП-Р.

На цій підставі можна стверджувати, що ЕР-С розташований в межах РЗД, і нейтралізуючі ЕР-С мкАт блокують ФНП за допомогою конкурентного механізму, тоді як ЕР-А мкАт, в зв'язку з РЗД-незалежною локалізацією ЕР-А, нейтралізують ФНП алостерично. Різний характер нейтралізації ФНП у ЕР-С і ЕР-А мкАт також підтверджується наступними спостереженнями: нейтралізуюча активність ЕР-С мкАт з'являється при афінності близько 108 моль-1, тоді як для нейтралізуючих ЕР-А мкАт необхідна афінність не менше, ніж 109 моль-1; при збільшенні афінності ЕР-С мкАт, їх нейтралізуюча активність зростає прямо пропорційно (r = 0.99; p<0.001), тоді як для ЕР-А мкАт ця залежність має непропорційний характер; незважаючи на підвищені вимоги до афінності, тільки ЕР-А мкАт досягають максимального рівня нейтралізації ФНП; активність нейтралізуючих ЕР-А мкАт не залежить від чутливості клітин до ФНП, тоді як активність ЕР-С мкАт, подібно рФНП-Р, знижується пропорційно підвищенню чутливості клітин.

Виявлення коопераційних мкАт проводилось на етапі епітопного картування. Критерієм кооперативності мкАт було підвищення зв'язування ФНП першими мкАт при наявності других більш, ніж в 1.5 рази (>150% контрольного зв'язування). Було встановлено, що мкАт, спрямовані до А1 і С1 епітопів, мають взаємопідсилююче зв'язування ФНП і складають головну коопераційну пару. При аналізі коопераційних пар, які складались із окремих А1 і С1 мкАт, відмічалось їх розділення на первинні та вторинні залежно від здатності індукувати або проявляти підсилене зв'язування ФНП відповідно. У такому варіанті кооперації найбільш вірогідним є конформаційний механізм адаптації мкАт, коли зв'язування первинних мкАт індукує конформаційні зміни молекули ФНП, що призводять до більш вигідної експозиції епітопів вторинних мкАт (Sabat et al, 1996). Оскільки А1 і С1 мкАт представлені як первинними, так і вторинними мкАт, а також враховуючи максимальну імуногенність А1 і С1 епітопів, правомірно стверджувати, що, по-перше, А1 і С1 епітопи є конформаційнозалежними, тобто зв'язування одного епітопа викликає конформаційні зміни у ділянці локалізації іншого, і, по-друге, переважна генерація Ат до цих епітопів відображає процес приоритетної селекції коопераційних Ат, які забезпечують конформаційну деформацію ФНП. Виходячи із функціональних характеристик коопераційних мкАт, можна пояснити значення цього феномену. За належностю до ЕР-А і ЕР-С, коопераційні А1 і С1 мкАт представляють два типи нейтралізуючих мкАт: алостеричні і конкурентні. Тому їх кооперативність може мати значення для більш ефективної нейтралізації ФНП в умовах in vivo, де потенційно активний ФНП знаходиться в зв'язаному з рФНП-Р стані (Aderka et al, 1992). Підтвердженням цьому є наступні ефекти коопераційних А1 і С1 мкАт, що спостерігаються при їх змішуванні: синергічна нейтралізація ФНП; в 50-100 разів більша ефективність зв'язування ФНП в присутності рФНП-Р.

Коопераційні А1 (1А6) і С1 (F74) мкАт були використані в ІФА для визначення ФНП, кий згідно складаючих мкАт, був названий коопераційним. Розроблений ІФА позитивно характеризує висока чутливість (2 пг/мл), одноетапність постановки аналізу і висока резистентність до інгибуючого ефекту рФНП-Р. Аналітичні тести виявили допустимі значення варіабельності у межах однієї постановки (intra-CV=4.2±2.0%) і між постановками (inter-CV= 5.4±2.4%), лінійний динамічний діапазон до 200 пг/мл, відсутність перехресної реактивності зі структурно та функціонально близькими цитокінами (ЛТa, ІЛ-1a/b, ІЛ-2, ІЛ-8, ІФНa/b/g, ТФРb, ФНП миші) і високу ефективність виявлення ФНП в плазмі крові (86.2±9.1%) та амніотичній рідині (98.5±4.8%).

Коопераційним ІФА визначались нормальні показники ФНП в ЕДТА-плазмі крові і амніотичній рідині. Рівень ФНП в амніотичній рідині (15-22 тиж.) складав 25.2±9.9 пг/мл (медіана: 22.5 пг/мл), в плазмі дітей (вік: 7-17 років) - 7.9±7.7 пг/мл (медіана: 4.9 пг/мл), в плазмі дорослих (вік: 20-38 років) - 16.0±8.0 пг/мл (медіана: 14.6 пг/мл). Верхня межа нормального діапазону в плазмі (по 95% довірчому інтервалу) склала 25 пг/мл у дітей і 35 пг/мл у дорослих. Значення верхньої межі нормального діапазону у дорослих відповідає данним інших варіантів ІФА, які описані в літературі: 35 пг/мл (Michie et al, 1988); 39 пг/мл (Turpeinen et al, 1994); 34 пг/мл (Lamb et al, 1992); 40 пг/мл (Teppo et al, 1987).

Для апробації коопераційного ІФА проводилось визначення ФНП у дітей з дифузними захворюваннями сполучної тканини (ДЗСТ): дерматоміозит, системний червоний вовчак, ювенільний ревматоїдний артрит (ЮРА), недиференційована форма ДЗСТ. Згідно відомих даних про патогенетичну роль ФНП при системних аутоімунних захворюваннях (Cope et al, 1995; Moore, 1999) розробленим ІФА виявлялись підвищені концентрації ФНП в крові при всіх нозологічних формах ДЗСТ, причому абсолютні показники ФНП корелювали зі ступенем системної маніфестації запального процесу. На прикладі динаміки лікування хворих ЮРА по-казано, що визначення ФНП має прогностичне значення для оцінки ефективності протизапальної терапії. На відміну від рФНП-Р, які суттєво не змінювались за період лікування, показники ФНП як більш динамічні знижувались до нормальних значень протягом 2-х тижневого курсу лікування цитостатичними препаратами і/або кортикостероїдами. Таким чином, визначення ФНП в динаміці імуносупресивної терапії дозволяє в мінімальний строк оцінити її ефективність.

Визначення ФНП в амніотичній рідині проводилось в групах жінок з фетоплацентарною недостатністю (ФПН) і внутрішньоутробними вадами розвитку (ВВР) плода. Згідно літературних даних про підвищення рівнів ФНП при загрозі розвитку прееклампсії (Kupferminc et al, 1994), нашим ІФА виявлялось підвищення рівня ФНП при ФПН. Навпаки, при ВВР плода спостерігалось значне зниження ФНП, яке вибірково виявлялось в групі летальних і/або умовнолетальних ВВР з грубими анатомічними аномаліями, тоді як при ВВР без дефектів анатомічної будови показники ФНП були в межах норми або навіть підвищеними. Прямих аналогій цьому феномену в літературі не виявлено. Однак ці дані відповідають ряду експериментальних робіт, що вказують на важливу роль ФНП в процесах нормального ембріогенезу (Wride, Sanders, 1995).

Висновки

1. Епітопна структура молекули ФНП містить три головних епітопних регіони (ЕР): А, В і С. ЕР-С розташований в межах рецепторзв'язуючої ділянки (РЗД) ФНП. ЕР-В частково перекриває РЗД, а ЕР-А має РЗД-незалежну локалізацію. Структура кожного ЕР включає домінуючий епітоп (А1, В1, С1), який представлений найбільшою кількістю високоафінних мкАт, і 1-2 суміжних епітопи (А2, А3; В2, В3; С2), які представлені мкАт з середньою або низькою афінністю.

2. Епітопна специфічність анти-ФНП мкАт залежить від типу імунізації. Внутрішньочеревна імунізація призводить до моноспецифічності мкАт проти ЕР-С. Підшкірна імунізація надає повне різноманіття мкАт проти всіх ЕР, але без високоафінних мкАт до ЕР-С.

3. Всі ЕР ФНП представлені нейтралізуючими мкАт, які чітко відповідають найбільш високоафінним мкАт в кожному із ЕР. Згідно локалізації ЕР, нейтралізуючі мкАт розподіляються на два типа по механізму нейтралізації ФНП. ЕР-С представляє нейтралізуючі мкАт конкурентного типу, ефект яких проявляється внаслідок екранування РЗД. ЕР-А містить мкАт алостеричного типу, які викликають нейтралізацію ФНП зміною його біологічноактивної конформації.

4. Нейтралізуюча активність анти-ФНП мкАт може попередньо оцінюватись по їх епітопній специфічності і афінності. Епітопна специфічність визначає потенціальну активність, тоді як ступінь її реалізації визначається величиною афінності мкАт. Максимальну активність мають алостеричні А1 мкАт. Їх активність проявляється при афінності біля 109М-1 і досягає еквімолярного рівня нейтралізації ФНП (мкАт:ФНП = 1 : 1) при афінності більш 1010М-1. Середню нейтралізуючу активність мають В1 мкАт. При аналогічних вимогах до афінності їх рівень нейтралізації не перевищує співвідношення 10:1. Мінімально активними є С1 мкАт конкурентного типу. Їх активність проявляється при афінності біля 108 М-1 і досягає молярного співвідношення 30:1 при афінності біля 109 М-1.

5. Алостеричні мкАт мають принципову перевагу над конкурентними по ефективності нейтралізації ФНП в клітинних системах з різною чутливістю до дії ФНП. З підвищенням чутливості клітин ефективність нейтралізації ФНП алостеричними А1 мкАт залишається постійною, тоді як ефективність конкурентних С1 мкАт пропорційно знижується.

6. Основна пара коопераційних анти-ФНП мкАт складається з А1 і С1 мкАт і у відповідності до їх епітопної специфічності представляє нейтралізуючі мкАт конкурентного і алостеричного типу. Механізм коопераційної взаємодії мкАт полягає в їх конформаційній адаптації. Згідно внеску в кооперацію як А1, так і С1 мкАт поділяються на первинні та вторинні. Первинні мкАт індукують, а вторинні проявляють підсилене зв'язування ФНП. Функціональне значення зв'язування ФНП коопераційними А1 і С1 мкАт полягає в комплементарному поєднанні алостеричної і конкурентної нейтралізації, що має значення для найбільш ефективної нейтралізації ФНП в умовах in vivo, де ФНП знаходиться в зв'язаній з рФНП-Р формі. Цьому сприяє зв'язування ФНП коопераційними мкАт із складу комплексів з рФНП-Р.

7. Розроблений на основі коопераційних мкАт неконкурентний варіант ІФА для визначення ФНП вигідно відрізняє одностадійність постановки аналізу, висока чутливість і здатність ефективно виявляти рФНП-Р-асоційований ФНП. Решта аналітичних характеристик відповідають загальноприйнятим вимогам до ІФА неконкурентного типу. Результати проведених досліджень свідчать про придатність розробленого ІФА для визначення ФНП у клінічних дослідженнях.

моноклональний епітопний некроз рецепторзв'язуючий

Література

1. Flow cytometric detection of two types of tumor necrosis factor alpha (TNF) receptors by biotinamidocaproyl-TNF in human tumor cells // Experimental Oncology. - 1995. - V.17. - Р.11-17 (coauth. Gumenyuk М.Е., Slukvin I.I., Chernyshov V.P.).

2. Клініко-імунологічні паралелі у дітей, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит // Педіатрія, акушерство та гінекологія. - 1998. - №6. - С.31-35 (співавт. Дудка І.В., Омельченко Т.А., Вихованець Е.В.).

3. Вивчення вмісту фактора некрозу пухлин в крові дітей, хворих на ювенільний ревматоїдний артрит // Педіатрія, акушерство та гінекологія. - 1999. - №2. - С.20-23 (співавт. Омельченко Л.І., Чернишов В.П., Дудка І.В., Омельченко Т.А.).

4. Time-resolved fluorometry-based immunoassay for whole blood TNF production in antibody-coated incubation plates // Clinical Immunology. - 1999. - V.90. - P.478 (coauth. Chernyshov V.P., Grekova S.P.).

5. Значение абсолютных и относительных показателей циркулирующих фактора некроза опухолей (ФНО) и растворимых ФНО-рецепторов (рФНО-Р) для дифференциальной диагностики нозологических форм коллагенозов у детей // Матеріали I Української конференції молодих вчених, присвяченої пам'яті академіка В.В. Фролькіса (Київ, 31.03 - 01.04.2000 року). - К.: Ін-т геронтології АМНУ. - 2000. - С. 21-22 (співавт. Людвик Т.А.).

Размещено на Allbest.ru