Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Одержання екстракту з кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки та його застосування при абсцесах легенів

1.Загальна характеристика роботи

кріоконсервування селезінка ендобронхіальний

Актуальність теми. Створення нових препаратів з унікальними біологічними властивостями на основі клітин і тканин є одним із пріоритетних напрямків сучасної медицини і фармакології.

В останні роки увага дослідників спрямована на можливість використання селезінки як біологічного сорбенту та імуномодулятора. Наявність великої кількості Т- і В-лімфоцитів і макрофагів, здатність синтезувати біологічно активні речовини (БАР), що беруть участь у регуляції, а в ряді випадків - стимуляції різних ланок імунної системи, свідчать про значну роль цього органа в загальній системі імунітету організму.

В даний час накопичений великий клінічний досвід щодо застосування препарату “Спленин”, отриманого із селезінки великої рогатої худоби в 1945р. Основу препарату складають жиророзчинні біологічно активні речовини. Фірмою “Solco” розроблено препарат під комерційною назвою “Solcosplen”, створений на основі водяного екстракту селезінки. Слід зазначити, що технологія приготування цих препаратів не передбачає одержання їх із життєздатних клітин селезінки.

У сучасній клінічній медицині клітинна терапія займає все міцніші позиції. Особливістю клітинної терапії, механізми якої продовжують вивчатися, є надходження в організм пацієнта інформації від живих полівалентних чи спеціалізованих клітин та їхніх елементів, заміщення і доповнення природних функцій тканин і клітин хворого, відновлення нейрогуморальних систем і зв'язків, а також імунокорекція (Грищенко В.И., Сандомирский Б.П., 2000). У цьому зв'язку зросла актуальність збереження життєздатності і функціональної активності біологічного матеріалу, застосовуваного для клітинної терапії.

З позицій клітинної терапії, застосування в лікуванні хворих на сепсис селезінки як цільного органа уперше було запропоновано у 1984 році. Надалі, з метою детоксикації, у практичній медицині почали застосовувати внутрішньовенне введення селезінкових перфузатів; хворим у критичному стані здійснюється інфузія ліофілізованих пептидів свинячої селезінки (препарат “Спленонид”); є повідомлення про одержання небілкового імунотропного селезінкового фактора під робочою назвою “Спленозид”, що являє собою комплекс неідентифікованих нуклеозидів. З огляду на накопичений клінічний досвід, безсумнівну перспективу має подальша розробка біологічно активних препаратів селезінки з метою їхнього клінічного використання, у тому числі для лікування хворих із гнійними процесами в легенях. Це обумовлено тим, що в останні роки все частіше зустрічаються легеневі нагноєння, викликані антибіотикостійкою мікрофлорою, що розвивається на фоні зниження захисних реакцій організму, у тому числі системи місцевого імунітету і порушення бронхіальної прохідності, чим, власне, і обумовлені труднощі і невдачі в лікуванні даної категорії хворих.

Однак застосування вищезазначених методів лікування пов'язано з великими організаційними складностями і матеріальними витратами. При використанні клітинних препаратів, а також препаратів і сполук, одержуваних з ало- і ксеногенних органів і тканин, існує ризик як одержання інфікованих органів і тканин від хворої людини чи тварини, так і ймовірність зараження цих об'єктів на етапах одержання кінцевої продукції. Одним із способів вирішення цих проблем може бути застосування кріобіологічних технологій. Широко застосовуваний у даний час етап кріоконсервування і низькотемпературного зберігання клітин і тканин дозволяє здійснювати дослідження зазначених об'єктів на стерильність. Кріоконсервування застосовується також для накопичення органів і тканин до кількостей, необхідних для наступної технологічної переробки. Крім того, кріобіологічні технології дозволяють одержувати біологічно активний матеріал, що має саме той ступінь деструктивних змін, який є необхідним і достатнім для максимального виходу потрібних біологічно активних речовин із тканини при екстрагуванні. Таким чином, застосування кріобіологічних технологій дає можливість одержувати клітинні і тканинні препарати, зокрема екстракти, з більш вираженими біологічно активними властивостями, у порівнянні з препаратами, одержуваними з нативного матеріалу. У відділі експериментальної кріомедицини Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України розроблені технології кріоконсервування фрагментів ксеноселезінки. Дана робота є продовженням цих досліджень і присвячена вивченню впливу умов кріоконсервування на збереження фрагментів свинячої селезінки після відігрівання в часі і склад одержуваного з них водяного екстракту. З огляду на провідну роль порушення бронхіальної прохідності в розвитку легеневих деструкцій, актуальним є одержання такого біологічно активного препарату, склад і технологія приготування якого дозволили б застосувати його ендобронхіально хворим із гнійними процесами легенів. Таким чином, пошук методів одержання екстракту на основі кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки, вивчення його складу, біологічної і клінічної ефективності є актуальною задачею.

Зв'язок роботи з науковими темами. Дисертація виконана відповідно до плану науково-дослідних робіт з теми №75 (2.2.6) Інституту проблем кріобіології і кріомедицини НАН України з проблеми 2.28.7.4 “Клітинна фізіологія, механізми ушкоджень, адаптації, старіння та репарації клітин”.

Мета та задачі дослідження. Метою дослідження було одержання екстракту з кріоконсервованих фрагментів свинячої селезінки з високою концентрацією низькомолекулярних біологічно активних речовин і вивчення ефективності екстракту при лікуванні хворих з абсцесами легенів.

Для виконання поставленої мети необхідно було вирішити наступні задачі:

1. Вивчити вплив умов кріоконсервування фрагментів свинячої селезінки на їхнє збереження після відігрівання і вихід біологічно активних речовин у фізіологічний розчин при наступній інкубації.

2. Визначити фракційний склад одержаного екстракту із кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки й оцінити його мембранотропні властивості.

3. Розробити методику ендобронхіального введення екстракту кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки хворим з абсцесами легенів.

4. Вивчити клінічну ефективність ендобронхіального введення екстракту кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки в комплексній терапії хворих з абсцесами легенів у залежності від стану імунітету.

5. Дослідити можливі механізми дії екстракту кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки при його ендобронхіальному введенні хворим з абсцесами легенів.

Об'єктом дослідження є кріоконсервування фрагментів свинячої селезінки й інкубація їх у фізіологічному розчині після відігрівання з метою одержання водно-сольового екстракту із заданими властивостями, призначеного для ендобронхіального введення хворим з абсцесами легенів.

Предметом дослідження є водно-сольовий екстракт, отриманий із кріоконсервованих фрагментів свинячої селезінки і використовуваний для ендобронхіального введення хворим з абсцесами легенів.

Методи дослідження. Збереженість фрагментів після кріоконсервування оцінювали за інтенсивністю перекисних процесів у тканині, інтенсивністю дихання і фарбуванням трипановим синім. Склад одержаного екстракту визначали методом високоефективної гельпроникної хроматографії (ВЕГПХ) та спектрофотометрично. Клінічну ефективність ендобронхіального застосування екстракту хворим з абсцесами легенів оцінювали за клінічною картиною та динамікою імунологічних показників.

Наукова новизна отриманих результатів. Основні результати роботи отримані вперше. Проведені дослідження дозволили вивчити вплив умов кріоконсервування на деякі показники збереження фрагментів селезінки свиней протягом 90 хв після відігрівання і на склад одержуваного з них екстракту. Показано, що екстракт, одержаний із фрагментів свинячої селезінки, кріоконсервованих зі швидкістю 1C/хв від +4C до -70С під захистом кріопротектору ПЕО-1500 у 20% концентрації з наступним зануренням у рідкий азот, має високий вміст пептидів і нуклеотидів. При одержанні екстракту з фрагментів селезінки, кріоконсервованих за іншими дослідженими програмами, концентрація цих речовин в екстракті зменшується, а вміст білка збільшується. Також показано, що концентрація пептидів і нуклеотидів в екстракті, отриманому з кріоконсервованих у присутності 20% ПЕО-1500 фрагментів ксеноселезінки, є вірогідно вищою, ніж в екстракті, отриманому з нативних фрагментів.

Визначено молекулярно-масовий розподіл фракцій водно-сольового екстракту кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки (ЕКФКС), призначеного для клінічного застосування, і показано, що біологічно активні речовини, які входять до його складу, мають спорідненість до модельних мембран та мембран інтактних клітин.

Розроблено методику ендобронхіального введення екстракту кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки хворим з абсцесами легенів. Вивчено клінічну ефективність і можливі механізми дії ЕКФКС при його ендобронхіальному введенні в комплексній терапії хворих з абсцесами легенів.

Практичне значення одержаних результатів. Отримані результати дозволили визначити умови одержання ЕКФКС з високим вмістом низькомолекулярних БАР в екстракті. Показано, що ці речовини мають високі мембранотропні властивості, а це є необхідною умовою для прояву їхньої біологічної активності. Розроблено методику введення ЕКФКС і встановлено, що застосування ендобронхіального введення ЕКФКС у комплексній терапії хворих з абсцесами легенів поліпшує результати лікування цієї групи хворих, що дозволяє рекомендувати використання екстракту також і в інших галузях клінічної медицини для лікування інфекційно-запальних захворювань різної етіології.

Особистий внесок здобувача. Представлені для захисту наукові результати одержані дисертантом особисто. Дисертантом самостійно проведені: патентно-інформаційний пошук, клінічні дослідження, статистична обробка й аналіз експериментальних даних, розроблені основні положення та висновки дисертації. Сумісні дослідження були проведені під керівництвом професора Б.П. Сандомирського. Співавтори окремих публікацій к.б.н. С.Є. Гальченко, к.х.н. Л.В. Іванов, к.мед.н. І.П. Висеканцев сприяли проведенню експериментів із кріоконсервування фрагментів селезінки, одержання ЕКФКС, вивчення його імунобіологічних та мікробіологічних властивостей.

Апробація результатів дисертації. Матеріали роботи повідомлені на науково-практичній конференції “Ліки - людині”, Харків, 2001р. і Всеукраїнській науковій конференції “Успіхи і перспективи розвитку кріобіології і кріомедицини”, Харків, 27-29 листопада, 2001р.

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 8 друкованих робіт, 6 з яких - статті у фахових наукових журналах, методичні рекомендації та 1 тези доповіді на науково-практичній конференції.

Обсяг і структура дисертації. Дисертація викладена на 159 сторінках друкованого тексту і містить вступ, огляд літератури, матеріали і методи досліджень, результати досліджень та їхнє обговорення, заключну частину, висновки і список літератури. Текст ілюстрований 21 таблицею на 20 сторінках і 24 рисунками. Бібліографія включає 233 найменування робіт на 22 сторінках.

2. Основний зміст роботи

У вступі обґрунтована актуальність обраної теми, сформульовані мета і задачі дослідження, зазначені наукова новизна і практична значимість роботи.

У розділі 1 приведений огляд літератури за темою досліджень. Структурно літературний огляд представлений трьома підрозділами. У першому підрозділі розглянуті сучасні уявлення про клітинну терапію і тканинні екстракти. В другому підрозділі аналізовані літературні дані про умови кріоконсервування біологічних об'єктів і методи оцінки збереження біооб'єктів після циклу заморожування-відігрівання. У третьому підрозділі розглянуто стан системи імунітету хворих з абсцесами легенів, основні принципи лікування цієї групи хворих і показана необхідність імунокоригуючої терапії.

Розділ 2 включає характеристику матеріалів і методів досліджень.

Методи досліджень. Селезінку одержували на Харківському м'ясокомбінаті і доставляли в лабораторію на льоді. Потім її подрібнювали на фрагменти вагою 5 - 10 мг і три рази відмивали в 10-разовому обсязі фізіологічного розчину. Як кріопротектори використовували ДМСО і ПЕО-1500 у кінцевих концентраціях 10 і 20 відсотків. Розчини кріопротекторів, що містять їхню подвійну концентрацію, додавалися по краплях до фрагментів тканини у співвідношенні 1:1. Усі маніпуляції здійснювалися при +4С. Заморожування проводили зі швидкістю 1С/хв за допомогою програмного заморожувача УОП-6 у пластикових ампулах обсягом 1мл до -70С з наступним зануренням у рідкий азот. Зразки відігрівали на водяній бані при +40С. Відмивання від ДМСО здійснювали сахарозними середовищами тієї ж молярної концентрації, що і кріопротектор з наступною їх заміною на фізіологічний розчин. ПЕО-1500 відмивали в 10-разовому обсязі фізіологічного розчину. Екстракт одержували, інкубуючи фрагменти селезінки у фізіологічному розчині (рН - 7,4) протягом 60 хв при 20-22С, потім центрифугували протягом 15 хв при 1500 об/хв і надосад проціджували через фільтр одноразової системи для переливання крові. При одержанні екстракту для клінічного застосування всі маніпуляції проводили з дотриманням правил асептики. Вихідний матеріал і отримані зразки екстракту досліджували на відсутність контамінації мікрофлорою за стандартними методами.

Екстракт, призначений для клінічного застосування, розфасовували у скляні флакони по 5 мл і закривали гумовими пробками з фіксацією парафілмом. Екстракт зберігали в морозильній камері побутового холодильника при -6С (паспортні дані).

Інтенсивність перекисних процесів у тканині та її стійкість до цих процесів визначали хемілюмінесцентним методом, додаючи в ячейку хемілюмінометра, що містила 1мл фізіологічного розчину і 100мкл гомогенату тканини, 1ммоль двовалентного заліза або 200мкл 5% розчину перекису водню. Отримані результати представляли у відносних одиницях або як нормоване значення (відношення отриманої величини до контролю).

Спленоцити одержували шляхом диспергування фрагментів в охолодженому до +4С Рингер-фосфатному буфері, рН 7,4. Суспензію фільтрували. Клітини осаджували центрифугуванням при 250g протягом 10 хв і ресуспендували в тому ж самому буфері. Кількість ізольованих клітин підраховували в камері Горяєва. Їхню життєздатність визначали шляхом фарбування трипановим синім. Для цього клітини інкубували з 0,3% розчином барвника протягом 5 хв при кімнатній температурі і потім підраховували частку ушкоджених клітин, що мали яскраво виражене фарбування ядра, або ядра і цитоплазми.

Інтенсивність дихання фрагментів селезінки і спленоцитів визначали на полярографі фірми Radelkis. Динаміку ендогенного дихання реєстрували на самописі і розраховували в нмоль О₂/хв/мг тканини чи нмоль О₂/10⁸ клітин.

Загальну концентрацію пептидів у водяній фракції тканини селезінки (у надосаді) визначали за модифікованим методом Лоурі за допомогою реактиву Фоліна - Чикольте. Чутливість методу складає 0,2 мкг білка. Концентрацію поліпептидів і нуклеотидів визначали спектрофотометричним методом при довжинах хвиль 280 нм і 260 нм відповідно по калібрувальних кривих. Білки з екстракту попередньо осаджували центрифугуванням протягом 15 хв при 3000 об/хв після його кип'ятіння на водяній бані протягом 15 хв.

В екстракті, призначеному для клінічного застосування, вивчали молекулярно-масовий розподіл фракцій. Для цього використовували метод високоефективної гельпроникної хроматографії. Умови аналізу: стовпчик TSK SW 2000 7 мм*600 мм. Рухлива фаза: буферний розчин карбонату амонію ( рH 7.0) - ацетонітрил ( 70:30). Швидкість рухливої фази 1 мл/хв, обсяг проби 50 мкл. Прилад - фірми Waters, модель Allians, з діод-матричним детектором.

Для визначення молекулярних мас пептидних фракцій використовували декілька реперних (стандартних) речовин: фенілаланін з мол. м. 165, інсулін з мол. м. 5600, дімер інсуліну з мол. м. 11000 і бичачий сироватковий альбумін (БСА) з мол. м. 65000.

Молекулярні маси пептидних фракцій досліджуваного препарату встановлювали за часом утримання вищезазначених реперних речовин. Для встановлення природи фракцій екстракту, що відрізняються молекулярною масою, були отримані УФ спектри в області поглинання від 220 до 400 нм.

Для вивчення спорідненості БАР екстракту до ліпосом і еритроцитів використовували методи спінових і флуоресцентних зондів. При вивченні спорідненості БАР екстракту до ліпосом як флуоресцентний зонд використовували 1-анілінонафталін-8-сульфонат (1,8-АНС) виробництва "Serva"(ФРН). Для вивчення спорідненості БАР екстракту до еритроцитів використовували спін-мічений прогестерон: прегн-4-ен-3,20-діок.[17,16_-d] -2,2`-диметилоксазолідин-нітроксид.

Спорідненість БАР до ліпосом оцінювали за зміною інтенсивності флуоресценції зонда в ліпосомах у присутності досліджуваних речовин.

Спектри ЕПР реєстрували за допомогою радіоспектрометра Р 13-01 з термоприставкою при 37,5С, а спектри флуоресценції за допомогою спектрофлуориметра "Hitachi" MPF-2А.

Можлива антимікробна дія ЕКФКС та сумісна дія ЕКФКС і антибіотиків досліджувались стандартними методами (ВФС 42-1845-88; Королюк А.М., Сбойчаков В.Б., 1999; Сидоренко С.В., Колупаев В.Е., 1999) на регламентованих штамах бактерій і грибів. Дослідження проводили зі зразками ЕКФКС із п'яти серій.

Для оцінки клінічної ефективності ендобронхіального введення ЕКФКС була відібрана група з 122 хворих з абсцесами легенів, що знаходилися на лікуванні в торакально-хірургічному відділенні №2 міської клінічної лікарні №13 (м. Харків). Дослідну групу склали 58 хворих, яким у комплексну терапію було включено ендобронхіальне введення екстракту кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки. ЕКФКС відігрівали безпосередньо перед застосуванням і вливали хворим ендобронхіально через мікротрахеостому по 5мл 2 рази на добу протягом 10 днів.

Як контрольну групу було взято 64 хворих з аналогічною патологією, подібною до такої ж у хворих дослідної групи за статтю, віком і тяжкістю клінічних проявів. Хворим контрольної групи в комплекс лікувальних заходів були включені ендобронхіальні заливання через мікротрахеостому антибактеріальних препаратів: ектерицида і 1% діоксидина.

Хворі дослідної та контрольної груп за патоморфологічними і патофізіологічними ознаками, а також за особливостями клінічного перебігу були розділені на 2 підгрупи:

1 підгрупа - хворі з гнійними абсцесами легенів;

2 підгрупа - хворі з гангренозними абсцесами легенів.

Усі хворі перед початком лікування зазнавали загального клінічного обстеження, яке включає клінічний аналіз крові, клінічний аналіз сечі, дослідження згортальної системи крові, її біохімічних показників, вивчалися також С-реактивний білок та імунологічні показники периферичної крові, у 47 хворих із гнійними абсцесами легенів був вивчений стан процесів перекисного окислення ліпідів і антиоксидантного захисту. Зважаючи на те, що ЕКФКС вводився ендобронхіально, особливу увагу приділяли вивченню факторів місцевих механізмів захисту бронхолегеневої системи (визначення в мокротинні хворих функціонального стану альвеолярних макрофагів і сегментоядерних нейтрофілів, лізоциму, імуноглобуліну класу А, -інтерферонів. Окрім того, проводився ряд функціональних та інструментальних досліджень: ЕКГ, ФВД, рентгенографія органів грудної клітини в 2 проекціях, фібробронхоскопія.

При імунологічних дослідженнях периферичної крові концентрацію імуноглобулінів визначали методом радіальної імунодифузії в гелі (Mancini G. et al.,1965; Меньшиков В.В. і соавт.,1987; Кашкин К.П., Серов А.А.,1992). Функціональну активність лімфоцитів оцінювали за допомогою реакції бласттрансформації під впливом ФГА ( Hungerford et al,1954; Гольдман М.Л. і соавт., 1964). Кількісне визначення Т- і В- популяцій лімфоцитів проводили за методами, описаними Передерий В.Г. и соавт., (1995). Вміст ЦІК, С-реактивного білка, комплементу і ШОЕ вивчали за методами, описаними відповідно Haskova et al, (1977); Лабинской А.С., (1987); Козловской Л.В., Мартыновой М.А., (1975), Меньшиковым В.В. и соавт., (1987).

Оцінку перекисних процесів окислення ліпідів і антиоксидантного захисту у хворих проводили за вмістом в плазмі крові дієнових коньюгатів, ТБКАП (Гаврилов Б.В., Мишкорудная М.И., 1983), СОД, -токоферолу і вільних сульфгідрильних груп (Кисилевич Р.Ш., Скварко С.И.,1972).

Функціональний стан альвеолярних макрофагів і сегментоядерних нейтрофілів у мокротинні хворих оцінювали за активністю, інтенсивністю і завершеністю фагоцитозу за допомогою загальноприйнятих методів (Маянский Д.Н., 1975; Стейнметц М., Стефан Д., Дажстурнику Г.Р. и др., 1988; Методичні рекомендації МЗ УРСР від 26.04.1988 “ Уніфіковані імунологічні методи обстеження хворих на стаціонарному й амбулаторному етапах лікування ”).

Визначення вмісту лізоциму, секреторного імуноглобуліну класу А та -інтерферонів у мокротинні хворих проводили, відповідно, турбідіметричним методом (Лабинская А.С., 1978); методом радіальної імунодифузії в гелі (Mancini G. et al.,1965; Кашкин К.П., Серов А.А.,1992), за допомогою імуноферментного аналізу (Егоров А.М. и соавт., 1991).

У роботі використовувалися реактиви марки не нижче ХЧ. Отримані результати оброблялися статистично за методом Стьюдента-Фішера на комп'ютері.

У розділі 3 приведені отримані результати досліджень та їхнє обговорення.

У результаті вивчення деяких показників збереження кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки після відігрівання в часі в залежності від умов їх кріоконсервування показано, що при використанні 20% ПЕО - 1500 як кріопротектора, спостерігається менша активація перекисних процесів, ніж при використанні як кріопротектора ДМСО, а також відзначається максимальне збереження дихання тканини. При цьому інтенсивність дихання не відрізняється від контролю та інтенсивності дихання фрагментів відразу після відігрівання, і до 60 хв інкубування. При заморожуванні фрагментів у присутності 10% ПЕО - 1500 або 10 - 20% ДМСО інтенсивність дихання є значно нижчою, нiж в контролi уже відразу після відігрівання і швидко знижується під час інкубування. При вивченні життєздатності кріоконсервованих спленоцитів після відігрівання методом фарбування трипановим синім отримані аналогічні дані.

Таким чином, можна зробити висновок про те, що показники збереження фрагментів селезінки свині і спленоцитів, що входять до їхнього складу, після відігрівання і наступного інкубування у фізіологічному розчині є максимальними при кріоконсервуванні фрагментів під захистом 20% ПЕО - 1500 зі швидкістю 1С/хв від +4С до -70С з наступним зануренням у рідкий азот.

Далі вивчалася динаміка виходу в екстракт білків, поліпептидів і нуклеотидів із фрагментів селезінки, кріоконсервованих за різних умов у порівнянні з контролем. Як контроль були прийняті фрагменти нативної селезінки. Результати досліджень представлені на рис.1. Отримані дані свідчать про те, що мінімальний вихід білка в розчин спостерігається при інкубуванні фрагментів, що не піддавалися заморожуванню (0,15мг/мл), і кріоконсервованих у присутності 20% ПЕО-1500 (0,30мг/мл). Максимальний вихід білка в розчин із кріоконсервованих фрагментів спостерігається при заморожуванні в присутності 10% ДМСО (0,70мг/мл). Це може бути пов'язане з тим, що при використанні ДМСО як кріопротектора , збереження фрагментів селезінки є нижчим, ніж при кріоконсервуванні в присутності ПЕО-1500. Максимальний вихід поліпептидів і нуклеотидів спостерігається при екстрагуванні з фрагментів, кріоконсервованих під захистом 20% ПЕО - 1500 (0,09мг/мл і 75мкг/мл, відповідно при інкубації протягом 60 хв). Таким чином, були отримані дані, які свідчать про те, що цикл заморожування-відігрівання фрагментів селезінки призводить до більшого виходу в розчин поліпептидів і нуклеотидів. Це може бути пов'язане з тим, що під дією факторів низькотемпературного консервування в цитоплазматичних мембранах можуть виникати дефекти, через які відносно низькомолекулярні речовини виходять із клітин. Залежність концентрації поліпептидів і нуклеотидів від умов консервування, а саме менша їхня концентрація за несприятливих умов консервування фрагментів тканини (у присутності ДМСО) може бути пов'язана з тим, що в цьому випадку спостерігається активація перекисних процесів окислення, а це призводить до ушкодження молекул поліпептидів і нуклеотидів, а також їх хімічної взаємодії з молекулами білка і, отже, їх видалення з розчину як індивідуальних речовин, що мають відповідну структуру і функцію.

З огляду на літературні дані про активність різних імунобілогічних препаратів, можна було припустити, що екстракт, який містить більшу кількість поліпептидів і нуклеотидів, матиме більшу біологічну активність, тому в подальшій роботі для одержання екстракту з метою клінічного застосування ми використовували фрагменти свинячої селезінки, кріоконсервовані з використанням 20% ПЕО-1500.

У зв'язку з тим, що отриманий екстракт до його використання й у процесі застосування для лікування хворих повинен зберігатися протягом певного часу, експериментально було показано, що зберігання екстракту в морозильній камері побутового холодильника при температурі -6С (паспортні дані) протягом 28 діб практично не призводить до зміни складу і концентрації досліджуваних біологічно активних речовин.

Потім були вивчені деякі біофармацевтичні властивості ЕКФКС. Результати визначення молекулярно-масового розподілу фракцій ЕКФКС представлені на хроматограмі при довжині хвилі 214 нм. Докладно ці дані представлені в таблиці 1. Для ідентифікації природи кожної фракції, представленої на хроматограмі, були вивчені спектри поглинання випробуваного розчину в УФ діапазоні від 220 нм до 350 нм при часах утримання, що відповідають максимуму кожної фракції.

Таблиця 1. Розшифровка хроматограми ЕКФКС, представленої на рис. 2

Уф-спектри екстракту фрагментів селезінки свиней при наступних часах утримання (хв): 1- 10.683, 2- 13.442, 3- 15.213, 4- 16.909, 5- 18.816,

6- 21.507, 7- 22.849

Таблиця 2. Склад екстракту з кріоконсервованих фрагментів селезінки свині за даними хроматографії при довжині хвилі 214 нм.

Потім були вивчені мембранотропні властивості біологічно активних речовин, що входять до складу одержаного екстракту. Отримані дані свідчать про те, що введення екстракту в розчин з ліпосомами супроводжується монотонним зменшенням інтенсивності флуоресценції зонда в ліпосомах. З тієї причини, що досліджувані зразки не поглинають в області збудження флуоресценції зонда (365 нм), зменшення флуоресценції зонда можна пояснити зв'язуванням БАР екстракту з мембранами ліпосом, при цьому зонд витісняється молекулами БАР у зовнішнє середовище і відбувається гасіння флуоресценції. При цьому діапазон зменшення флуоресценції зонда пропорційний спорідненості БАР до ліпосом, а отже, і біологічної активності цих речовин.

Окрім того, отримані дані, які свідчать про те, що додавання екстракту до суспензії еритроцитів призводить до помітних змін у спектрах ЕПР - збільшення інтенсивності вузької складової спектра внаслідок витіснення зонда з мембран еритроцитів у позаклітинну рідину молекулами БАР. Це свідчить про ефективне зв'язування водорозчинних БАР тканини селезінки з мембранами еритроцитів.

Завершальним етапом в експериментальній частині роботи було вивчення можливої антимікробної дії ЕКФКС. Одержані при цьому дані свідчать про те, що отриманий екстракт не виявляє безпосередньої антибактеріальної й антимікотичної дії, а також не потенціює бактерицидну і фунгіцидну дію антибіотиків і антимікотиків з різними механізмами дії.

Далі були вивчені результати застосування ендобронхіального введення екстракту кріоконсервованих фрагментів ксеноселезінки в комплексній терапії хворих з абсцесами легенів, що стало можливим у результаті затвердження методичних рекомендацій МОЗ України.

У всіх хворих були виявлені різного ступеня виразності зміни показників як місцевих механізмів бронхо-легеневого захисту, так і загальної системи імунітету. У мокротинні пацієнтів був знижений вміст лізоциму, спостерігалося збільшення співвідношення сегментоядерні нейтрофіли/альвеолярні макрофаги, зниження активності фагоцитозу в альвеолярних макрофагах, підвищення показників НСТ-тесту в сегментоядерних нейтрофілах. У периферичній крові були виявлені зміни загального числа лімфоцитів, Т- і В-лімфоцитів і О-клітин, перевищення імунорегуляторного індексу, підвищення спонтанної і зниження індукованої ФГА бласттрансформації лімфоцитів, підвищення вмісту циркулюючих імунних комплексів, імуноглобулінів А і М, ШОЕ і С-реактивного білка. Концентрація імуноглобуліну G і комплементу знижувалася. Установлені зміни показників імунного статусу в сполученні з інфекційно-запальним процесом у легенях, викликаним опортуністичними мікроорганізмами, дозволяють зробити висновок про те, що у всіх хворих, які знаходилися під наглядом, була наявна спонтанна форма вторинного імунодефіциту. У хворих спостерігали також активацію процесів перекисного окислення ліпідів і зниження активності природних антиоксидантів.

Клінічна картина характеризувалася кашлем із гнійним мокротинням, інтоксикацією, у більшості хворих відзначалися явища поліорганної недостатності.

Усім хворим проводився курс комплексної терапії, що включає: антибактеріальну і детоксикаційну терапію, корекцію життєво важливих систем організму, комплексну ендобронхіальну санацію. Ендобронхіальна санація полягала у застосуванні лікувальних фібробронхоскопій та тривалих регулярних інстиляціях лікарських речовин у трахеобронхіальне дерево. Хворим дослідної групи ендобронхіально вводили ЕКФКС, а хворим контрольної групи - антибактеріальні препарати: діоксидин 1% та ектерицид. Позитивний результат був отриманий у хворих 1-ої підгрупи з тенденцією до затяжного перебігу і переходу процесу у хронiчну форму; у цих пацієнтів швидше зникав гнильний запах з роту, зменшувалася кількість гнійного мокротиння і наставало загоєння порожнини абсцесу. Якщо в контрольній групі у зв'язку з переходом процесу у хронiчну форму було прооперовано 5 (12,1%) хворих, то в дослідній групі тільки 1 (2,5%). У зв'язку з цим середня тривалість перебування хворих дослідної групи на ліжку виявилася меншою на 7,2 дня. Застосування ендобронхіального введення ЕКФКС у хворих з гангренозними абсцесами легенів виявилося малоефективним і вірогідно не поліпшувало клінічного перебігу хвороби в порівнянні з хворими контрольної групи.

У хворих дослідної групи на 10-12 добу відновлювалася функціональна активність альвеолярних макрофагів і сегментоядерних нейтрофілів, концентрація лізоциму в мокротинні досягала верхньої межі норми, відзначалися більш високі показники концентрації секреторного IgА і -інтерферонів у порівнянні з контрольною групою хворих.

Динаміка відновлення показників системи імунітету периферичної крові у бік норми при використанні в комплексній терапії ЕКФКС мала залежність від початкового стану імунної системи. У хворих 1-ої підгрупи на 10-12 добу відновлювались більшість цих факторів. У хворих 2-ої підгрупи частина показників до кінця клінічного спостереження не відновлювалася, але динаміка змін цих показників у бік норми перевищує показники в хворих контрольної групи. Спостерігалася також більш виражена тенденція до зниження активності процесів перекисного окислювання ліпідів і відновлення факторів антиоксидантного захисту. Отримані дані свідчать про те, що застосування ЕКФКС виявляло імуномодулюючу дію.

Припускається, що під впливом препарату активуються тканинні макрофаги, сегментоядерні нейтрофіли і вільні нейтрофіли бронхоальвеолярного секрету. У результаті відновлюється функціональна активність фагоцитуючих клітин, здатність до секреції лізоциму, а також підвищується секреція секреторного IgА і -інтерферонів. Цитокіни, синтезовані макрофагами, ініціюють місцеву неспецифічну резистентність і специфічну імунну відповідь.

З бронхолегеневого дерева синтезовані цитокіни надходять у кров'яне русло. У кров також надходять деякі фракції препарату (вільні амінокислоти, низькомолекулярні пептиди, нуклеїнові кислоти), що виявляють біологічно активну дію і спорідненість до цитоплазматичних мембран кров'яних клітин. Ці цитокіни і БАР також ініціюють розвиток неспецифічної резистентності і специфічного імунітету організму в цілому. Активізація імунної системи призводить до інгібування процесів перекисного окислювання ліпідів і відновлення системи антиоксидантного захисту. Ці ефекти впливу препарату викликають до більш активного перебігу фаз місцевої запальної реакції, локалізації гнійного осередку з наступним більш швидким його очищенням від гнійно-некротичних мас, репарацією ушкоджених тканин і відновленням гомеостазу.

Висновки

В останні роки все частіше зустрічаються легеневі нагноєння, викликані антибіотикостійкою мікрофлорою, що розвивається на фоні зниження захисних реакцій організму, у тому числі системи місцевого імунітету і порушення бронхіальної прохідності. Актуальним є одержання такого біологічно активного препарату, ендобронхіальне введення якого забезпечує відновлення показників імунітету, в першу чергу місцевих механізмів бронхолегеневого захисту. Таким препаратом є екстракт із фрагментів ксеноселезінки з високим вмістом низькомолекулярних БАР. Для одержання екстракту із заданими властивостями запропоновано кріобіологічні технології. Експериментально визначені умови одержання й отримано ЕКФКС із високою концентрацією низькомолекулярних БАР: заморожування фрагментів селезінки під захистом 20% ПЕО - 1500 зі швидкістю 1С/хв від +4С до -70С з наступним зануренням у рідкий азот, відігрівання на водяній бані при +40С та інкубування у водно-сольовому розчині протягом 60 хв. Показано, що концентрація низькомолекулярних БАР в екстракті, отриманому за розробленим способом, перевищує концентрацію низькомолекулярних БАР в екстракті, одержаному з нативних фрагментів селезінки.

Методом високоефективної ексклюзійної гельпроникної хроматографії вивчено молекулярно-масовий розподіл фракцій екстракту кріоконсервованих зі швидкістю 1С/хв у присутності 20% ПЕО - 1500 фрагментів свинячої селезінки; встановлено, що основними компонентами препарату є амінокислоти і речовини пептидної природи з різною молекулярною масою, які ефективно зв'язуються з мембранами модельних та інтактних клітин за конкурентним механізмом, що є необхідною умовою для прояву їхньої біологічної активності.

Розроблено методику застосування екстракту і показано, що ендобронхіальне введення ЕКФКС хворим із гнійними абсцесами легенів призводить до достовірного поліпшення клінічного перебігу захворювання, зменшення кількості випадків переходу процесу у хронічну форму і потреби у великих оперативних втручаннях, а також скорочення середньої тривалості перебування хворих на ліжку на 7,2 дня.

Ендобронхіальне введення ЕКФКС у хворих з абсцесами легенів забезпечує відновлення або тенденцію до достовірного відновлення в більш ранній термін і в більшому обсязі показників неспецифічного і специфічного імунітету, в першу чергу місцевих механізмів бронхолегеневого захисту шляхом активації тканинних (альвеолярних) макрофагів, сегментоядерних нейтрофілів і вільних нейтрофілів бронхоальвеолярного секрету, що спричиняє до відновлення функціональної активності фагоцитуючих клітин, збільшення секреції лізоциму, а також підвищення рівня секреторного IgА і -інтерферонів.

5. Установлено наявність корелятивних зв'язків між динамікою клінічного перебігу захворювання у хворих з абсцесами легенів після ендобронхіального введення ЕКФКС і відновленням показників клітинного і гуморального імунітету периферичної крові, процесів перекисного окислення ліпідів і факторів антиоксидантного захисту.

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Бызов В.В. Применение криоконсервированных фрагментов ксеноселезёнки в лечении больных с гнойными процессами лёгких и плевры // Проблемы криобиологии.-2000.-№1.-С.81-85.

2. Бызов В.В. Лечение гнойно-деструктивных заболеваний лёгких // Український терапевтичний журнал.-2001.- Т.-3, №2.-С.55-57.

3. Бызов В.В., Высеканцев И.П., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Опыт применения эндотрахеального введения экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезёнки в комплексном лечении больных с гнойными процессами в лёгких // Проблемы криобиологии.-2001.-№3.-С.87-88.

4. Бызов В.В., Высеканцев И.П., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Влияние эндобронхиального введения экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезёнки на некоторые факторы местного иммунитета в комплексной терапии больных с абсцессами лёгких // Проблемы криобиологии.-2001.-№4.-С.65-70.

5. Бызов В.В., Высеканцев И.П., Гальченко С.Е., Сандомирский Б.П. Изучение сочетанного воздействия экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезёнки и антибиотиков на микроорганизмы // Клиническая антибиотикотерапия.-2002.-№1(15).-С.24-26.

6. Сандомирский Б.П., Бызов В.В., Иванов Л.В., Гальченко С.Е. Некоторые биофармацевтические свойства экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезёнки // Фармаком.-2002.-№2.-С.78-82.

7. Заготівля, кріоконсервування та клінічне застосування фрагментів селезінки свиней та екстракту з них: Методичні рекомендації / МОЗ Укр.; Коорд. Центр трансплантації органів, тканин та клітин; НАН Укр.; ІПКіК; Сост.: Сандомирський Б.П., Гальченко С.Є., Бизов В.В., Грищенко В.І., Мамонтова А.В., Велигоцький М.М., Велигоцький О.М.- Харків, 2001.-9с.

8. Бызов В.В. Применение экстракта криоконсервированных фрагментов ксеноселезёнки в лечении больных с абсцессами лёгких // Лекарства - человеку: Мат-лы научн.-практ. конф.- Харьков, 2001.- С.14-16.

Размещено на Allbest.ru