Розробка нового алогенного препарату з донорської крові - антидифтерійного імуноглобуліну

Размещено на http://www.allbest.ru/

АКАДЕМІЯ МЕДИЧНИХ НАУК УКРАЇНИ

ІНСТИТУТ ГЕМАТОЛОГІЇ ТА ТРАНСФУЗІОЛОГІЇ

УДК 615.387:66.048.3:616.931

РОЗРОБКА НОВОГО АЛОГЕННОГО ПРЕПАРАТУ З ДОНОРСЬКОЇ КРОВІ - АНТИДИФТЕРІЙНОГО ІМУНОГЛОБУЛІНУ

14.01.31 - гематологія та трансфузіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

МЕЛЬНИК ОЛЕНА АНАТОЛІЇВНА

Київ - 2001

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Інституті гематології та трансфузіології АМН України.

Науковий керівник: доктор біологічних наук, професор Федоровська Олена Олексіївна Інститут гематології та трансфузіології АМН України, керівник лабораторії мікробіології та імунних препаратів крові

Офіційні опоненти: доктор біологічних наук, професор Співак Микола Якович Інститут мікробіології та вірусології ім. Д.К.Заболотного НАН України, керівник лабораторії проблем інтерферону та імуномодуляторів

Доктор медичних наук Дизик Галина Михайлівна Інститут гематології та трансфузіології АМН України, керівник лабораторії тканинного типування

Провідна установа: Київська медична академія післядипломної освіти ім.П.Л.Шупика МОЗ України, кафедра гематології та трансфузіології

Захист відбудеться 25.04.2001 р. о 14 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.612.01 в Інституті гематології та трансфузіології АМН України за адресою: 04060 м. Київ - 60, вул. М. Берлінського, 12

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Інституту гематології та трансфузіології АМН України за адресою: 04060 м. Київ - 60, вул. М. Берлінського, 12

Автореферат розісланий 22.03.2001р.

Вчений секретар

спеціалізованої вченої ради В.Г. Комісаренко

АНОТАЦІЇ

Мельник О.А. Розробка нового алогенного препарату з донорської крові - антидифтерійного імуноглобуліну. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.00.31-гематологія та трансфузіологія - Інститут гематології та трансфузіології АМН України, Київ, 2001.

Дисертація присвячена актуальній проблемі трансфузіології - розробці алогенного антидифтерійного імуноглобуліну для лікування хворих на дифтерію на заміну протидифтерійної конячої сироватки. У період масової імунізації проти дифтерії в сироватці крові донорів у 74-98 % випадків виявляються антидифтерійні антитіла у титрах 1:80-1:40960. Визначено оптимальний контингент донорів та часовий інтервал для накопичення джерела одержання антидифтерійного імуноглобуліну. Вивчені специфічні властивості вихідної сировини у процесі зберігання. Одержано 8 серій протидифтерійного імуноглобуліну з титрами специфічних антитіл 1:2560-1:10240 та антидифтерійною активністю 10,0-70,0 МО/мл. Вивчені його властивості в динаміці зберігання. Визначено високий вміст антидифтерійних антитіл у комерційних препаратах імуноглобуліну різної направленості. Для контролю специфічної активності протидифтерійного імуноглобуліну рекомендується використовувати на СПК України методи флокуляції та розрахунковий. На одержаний препарат затверджена нормативна документація.

Ключові слова: дифтерія, імунітет, імуноглобулін, титри антидифтерійних антитіл.

Мельник Е.А. Разработка нового аллогенного препарата из донорской крови - антидифтерийного иммуноглобулина. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.00.31 - гематология и трансфузиология. - Институт гематологии и трансфузиологии АМН Украины, Киев, 2001.

Диссертация посвящена актуальной проблеме трансфузиологии - разработке аллогенного антидифтерийного иммуноглобулина для лечения больных дифтерией взамен противодифтерийной лошадиной сыворотки. В период массовой иммунизации против дифтерии в сыворотке крови доноров в 74-98 % случаев выявляются антидифтерийные антитела в титрах 1:80 -1:40960. Причем, более выраженной ответной реакцией организма на противодифтерийную иммунизацию обладают доноры-мужчины и женщины с фенотипом групповой принадлежности крови А(ІІ), В(ІІІ); киевляне по сравнению с жителями Киевской области и преимущественно в зимне-весенний период. Определен временной интервал накопления сырья (без потери специфической активности) для получения антидифтерийного иммуноглобулина - 72 часа при температуре хранения (4+2) ⁰С и в замороженном состоянии до 12 месяцев при температуре (минус 20+5) ⁰С. В процессе этанолового фракционирования на холоду из пула плазмы доноров с титрами антидифтерийных антител от 1:640 до 1: 2560 получено 8 серий противодифтерийного иммуноглобулина с антидифтерийной активностью 10,0-70,0 МЕ/мл и титрами антидифтерийных антител от 1:2560 до 1:10240. Достигнута 4-х-кратная концентрация специфических антител. Изучение качества препарата показало, что полученный иммуноглобулин соответствует требованиям, предъявляемым к иммуно-глобулинам в виде 10% раствора. Высокоактивный препарат иммуноглобулина против дифтерии получен из пула плазмы крови на 70 % и более состоящего из индивидуальных образцов с уровнем противодифтерийного антитоксина от 1:80 и выше; более 20 % из них характеризуются максимальными титрами специфических антител от 1:1280 и выше, а менее 5 % - 1:80. Обоснована целесообразность использования реакции флоккуляции и расчетного метода для контроля специфической активности антидифтерийного иммуноглобулина на СПК Украины. Определены высокие титры антидифтерийных антител в коммерческих препаратах иммуноглобулина различной направленности. Причем, более 25% антистафилококкового и 14,5% нормального иммуноглобулина обладают антидифтерийной активностью от 7,95 до 31,74 МЕ/мл. По результатам ускоренного метода хранения препаратов иммуноглобулина установлено, что титры антидифтерийных антител не изменились ни в одной из шести исследуемых серий антистафилококкового и нормального иммуноглобулина на протяжении трех лет хранения. Следовательно, коммерческие препараты иммуноглобулина с высоким содержанием антидифтерийных антител на протяжении своего срока годности могут расцениваться как антидифтерийные препараты и использоваться в данном качестве в экстренных случаях.

На препарат “Імуноглобулін антидифтерійний людини донорський рідкий” оформлена и утверждена нормативная документация.

Ключевые слова: дифтерия, иммунитет, иммуноглобулин, титры антидифтерийных антител.

Melnik Ye.A. Elaboration of a new allogenic preparation from blood donor - antidiphtheritic immunoglobulin. - Manuscript.

A thesis for a degree of candidate of biological sciences, speciality 14.00.31 - hematologyand transfusiology. - Institute of Hematology and Transfusiology of Medical Science Academy of Ukraine, Kiev, 2001.

The thesis is dedicated to a topical problem of transfusiology, i.e. to the elaboration of allogenic antidiphtheritic immunoglobulin instead of antidiphtheritic equin serum for the treatment of patients with diphtheria. In the period of mass immunization antidiphtheritic antibody titres of 1:80-1:40960 were found out in blood donor serum in 74-98 % of cases. Optimal donor contingent and time interval necessary for the accumulation of resource for antidiphtheritic immunoglobulin production have been ascertained. The initial raw material specific peculiarities in storage have been studied. 8 series of antidiphtheritic immunoglobulin with specific antibody titres of 1:2560-1:10240 and with antidiphtheritic activity of 10,0-70,0 IU/ml have been obtained. High levels of antidiphtheritic antibody were determine out in commercial preparations of immunoglobulin deferent specific action. Flocculation and calculation methods for the immunoglobulin antidiphtheritic activity are recomended to be used at BTS of Ukrain. The normative documentation on the receiving preparation have been confirmed.

Key words: diphtheria, immunity, immuniglobulin, antidiphtheritic antibody titres. алогенний імуноглобулін дифтерія трансфузіологія

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. У результаті останньої епідемії дифтерії в Україні за період з 1991 по 1998 роки цією токсикоінфекцією перехворіло понад 19 тис.чоловік, 696 з них померло [О.В.Деміховська, Л.М.Чудна, 1999] .

Науковці відмічають ряд факторів, що безпосередньо вплинули на епідемічний процес дифтерійної інфекції. Спорадичним випадкам захворювань та виділенню Corynebacterium diphtheriae у практично здорових осіб на початку 80-х років не приділяли належної уваги. Крім того, у цей період намітилась тенденція безпідставного розширення протипоказань до профілактичних антидифтерійних щеплень, а для дітей групи ризику були рекомендовані імунопрепарати зі зниженим антигенним навантаженням [Л.С.Красюк, 1996]. Втрата штучного імунітету, придбаного в дитинстві, та несприятливий соціальний фактор призвели до зниження колективного антидифтерійного імунітету, що спричинило збільшення чисельності хворих на дифтерію серед дорослого населення [Д.Мерсер, 1996; Е.В.Демиховская, 2000].

Необхідно також відмітити фактор зниження імунної відповіді на щеплення, пов`язане зі змінами у навколишньому середовищі та носійство токсигенних і нетоксигенних штамів Corynebacterium diphtheriae [Л.М.Чудная и др., 1993; А.І.Савчук, А.М.Михайлова, 2000].

Як результат, у 1991 році в Україні розпочалась епідемія дифтерії, яка охопила усі регіони країни. Пік її прийшовся на 1995 рік, коли показник захворюваності досяг найвищого рівня - 10,2 на 100 тисяч населення [А.М.Сердюк, 1997]. Для порівняння: у 1976 році був зафіксований найнижчий показник захворюваності на дифтерію - 0,02 на 100 тисяч населення [А.М.Мостюк і співавт., 1996].

Оптимальним засобом детоксикації при дифтерії до останнього часу є нейтралізація дії токсину за допомогою протидифтерійної ксеногенної (конячої) сироватки. Вона виявляє лікувальну дію, але, водночас, має ряд негативних властивостей. Ксеногенність препарату призводить до алергічних реакцій різної інтенсивності у хворих: сироваткова хвороба, яка зустрічається у 16,5 % дорослих та 1,8 % дітей, анафілактичний шок або набряк Квінке [Л.Ф.Фаворова и др., 1988; Е.Г.Фокина и др., 1995]. У певних випадках вони купіруються за допомогою антигістамінних препаратів та кортикостероїдів, небайдужих для організму [И.В.Штырев, 1990].

Відомо, що на первинне введення імунної сироватки тваринного походження (чужеродні білки) організм людини синтезує антигама-глобуліни, що взаємодіють із антигенними детермінантами Fab-фраг-ментів введених антитіл. Це знижує терапевтичний ефект ксеногенних препаратів та обумовлює появу аутоалергічних реакцій в організмі під час повторного введення [А.А.Сохин, Е.Ф.Чернушенко, 1984]. Для зменшення анафілактогенності протидифтерійної конячої сироватки її піддають ферментативному протеолізу, що призводить до часткового розщеплення білкових молекул та появи низькомолекулярних білкових фракцій, які відносяться до Fab-фрагментів гамаглобулінів з низькою авідністю та швидкою елімінацією з кров`яного русла реципієнта [М.В.Демина, Е.В.Лехтцинд, 1990].

Доведено, що алогенні імунні препарати, на протилежність ксеногенним, утворюють більш напружений специфічний імунітет в організмі хворого, особливо при повторних введеннях. Це пов`язано як із швидкістю їх накопичення у крові, так і з ефекторними функціями [Е.А.Федоровская, Л.В.Назарчук, 1986].

Наведені дані свідчать про те, що науковий підхід щодо розробки лікувального алогенного антидифтерійного препарату на основі крові донорів є перспективним напрямком у трансфузіології.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота виконувалася в рамках науково-дослідного проекту “Розробка та експериментально-клінічне вивчення алогенних антидифтерійних препаратів для лікування хворих на тяжкі форми дифтерії” (реєстраційний номер 01.07.02/007-93) за ДНТП 1.7 “Захист населення від найбільш розповсюджених інфекційних захворювань”.

Автор безпосередньо брала участь у вивченні умов одержання та експериментальному дослідженні серій антидифтерійного імуноглобуліну з плазми крові донорів, а також у розробці нормативної документації на препарат.

Мета і задачі дослідження. Метою даної роботи була розробка нового алогенного антидифтерійного імуноглобуліну для лікування хворих на тяжкі форми дифтерії на заміну конячої протидифтерійної сироватки.

Для виконання роботи необхідно було вирішити такі задачі:

1 У період масової активної імунізації проти дифтерії дослідити стан протидифтерійного антитоксичного імунітету донороздатного населення.

2 Визначити джерела, умови одержання та зберігання антидиф-терійного імуноглобуліну.

3 Вивчити придатність вихідної сировини та умови її зберігання.

4 Одержати експериментальні серії антидифтерійного імуноглобуліну та вивчити його властивості.

5 Вивчити комерційні препарати імуноглобулину різної направленості на предмет виявлення в них захисних титрів антидифтерійних антитіл.

6 Розробити нормативну документацію на препарат антидифтерійного імуноглобуліну.

Об'єкт - розробка нового препарату з донорської крові - антидифтерійного імуноглобуліну для лікування хворих на тяжкі форми дифтерії.

Предмет - алогенний антидифтерійний імуноглобулін.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше:

у період масової активної імунізації проти дифтерії вивчено стан антитоксичного протидифтерійного імунітету донороздатного населення. Виявлена залежність титрів антидифтерійних антитіл від ряду генетичних маркерів донорів та сезонів року, що сприяє скринуванню сироваток крові з метою їх використання як вихідної сировини для одержання антидифтерійного імуноглобуліну;

розроблено спосіб отримання антидифтерійного імуноглобуліну з плазми крові донорів із титрами антидифтерійних антитіл від 1:80 та вище з урахуванням визначення температурно-часового режиму зберігання вихідної сировини та кількісного співвідношення зразків плазми в пулі з різним вмістом захисного титру протидифтерійного антитоксину;

вивчені різні методи контролю специфічної активності у препараті антидифтерійного імуноглобуліну та обгрунтовані найбільш придатні з них для використання в умовах станцій переливання крові (СПК) України;

у період масової протидифтерійної імунізації доведена антидифтерійна активність комерційних препаратів імуноглобуліну різної направленості, які мають високі титри протидифтерійного антитоксину.

Практичне значення одержаних результатів полягає у науковому обгрунтуванні одержання протидифтерійного алогенного імуноглобуліну, передбаченого для використання як антитоксичного лікувального засобу на заміну ксеногенної протидифтерійної сироватки (патент України № 22426А).

З метою впровадження даного способу у виробництво на СПК України підготовлено проект нормативної документації на препарат антидифтерійного імуноглобуліну. Фармакопейна стаття на “Імуноглобулін антидифтерійний людини донорський рідкий” затверджена Фармакопейним комітетом МОЗ України. Інструкція по застосуванню алогенного антидифтерійного імуноглобуліну затверджена у Міністерстві охорони здоров`я України.

Особистий внесок здобувача.

Робота виконана особисто автором під керівництвом професора

О.О.Федоровської в лабораторії мікробіології та імунних препаратів крові Інституту гематології та трансфузіології АМН України.

Особисто були виконані дослідження антидифтерійного імунітету донорів; встановлені особливості підбору та зберігання антидифтерійної плазми як сировини для одержання препарату імуноглобуліну; вивчені фізико-хімічні, біологічні, специфічні властивості препарату; проведені порівняльні дослідження методів контролю антидифтерійної активності імуноглобуліну in vitro та in vivo; проведено скринінг комерційних препаратів імуноглобуліну на наявність антидифтерійних антитіл. Одержання препарату в лікарській формі проведено за консультацією та участю співробітників Інституту гематології та трансфузіології АМН України к.м.н. В.А.Степанчука і к.м.н. Л.К.Погодаєвої. Вивчення біологічних властивостей препарату, а також скринінг комерційних серій імуноглобуліну проведено сумісно з д.м.н. Л.В.Назарчук. Патоморфологічні особливості дермонекротичного впливу дифтерійного токсину на морських свинок консультувала к.м.н. А.І.Коваль. Дослідження нейтралізуючої дії антидифтерійного імуноглобуліну на дифтерійний токсин у культурі клітин HeLa було проведено на базі Одеського Інституту вірусології та епідеміології ім.І.І.Мечнікова (зав.лаб. к.м.н. А.Г.Стопчанська). Всім співавторам висловлюю щиру подяку.

Апробація результатів дисертації. Матеріали дисертації доповідалися на ІІІ Українському з`їзді гематологів та трансфузіологів (Суми, 1995р.), на Міжнародних наукових конференціях: ”Идеи И.И.Мечникова в развитии современного естествознания” (Харків, 1995р.) та молодих вчених (Тернопіль,1997р.), на Російській конференції “Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии” (Санкт-Петербург, 1995р.), на науково-практичній конференції молодих вчених та фахівців “Сучасні проблеми гематології та трансфузіології”, присвяченій 100-річчю від дня народження О.О.Федоровського (Київ, 1998).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано три журнальні статті, п`ять тезисних доповідей, одержано патент України.

Структура та обсяг дисертації. Дисертація складається із вступу, огляду літератури (2 підрозділи), експериментальної частини (6 розділів), аналізу та узагальнення результатів дослідження, висновків та списку використаних джерел літератури.

Робота викладена на 137 сторінках, ілюстрована 14 таблицями (11 на окремих аркушах), 11 малюнками. Список використаної літератури включає 247 джерел, у тому числі 49 іноземними мовами.

ОСНОВНИЙ ЗМІСТ

У розділі огляду літератури представлено характеристику стану проблем щодо специфічної профілактики і лікування дифтерії та розробки імунних антиінфекційних препаратів із крові донорів.

Розділ 2 МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Об`єктами досліджень були: сироватка крові донорів, імунізованих дифтерійним анатоксином у 1993-1995 роках згідно з календарем щеплень, та неімунізованих осіб (1159 зразків), 8 серій імуноглобуліну проти дифтерії (1368 доз), зразки 164 серій комерційних препаратів імуноглобуліну різної специфічності виробництва СПК та підприємств бактерійних препаратів України, лабораторні тварини - кролі породи шиншила (24 особини), білі беспородні миші (40 особин), морські свинки (28 особин).

Титри антидифтерійних антитіл визначали у реакції пасивної гемаглютинації (РПГА). Визначення вмісту імуноглобулінів ізотипів G, A, M проводили за методом радіальної імунодифузії у гелі [J.Mancini, 1965] у нашій модифікації [Е.А. Мельник и др., 1991]. Кількісне визначення дифтерійного антитоксину проводили методами: in vitro - у культурі клітин карциноми матки HeLa [Методические рекомендации по приготовлению клеточных культур, используемых в практике вирусологических исследований, 1974], у реакції флокуляції [П.Н.Бургасов, 1978], in vivo - за методом Ремера [П.Н.Бургасов, 1978] та розрахунковим методом [М.И.Слюсарь и др., 1991]. Препарат антидифтерійного імуноглобуліну одержували за допомогою методу етанолового фракціонування плазми крові донорів [К.А.Лобунец и др., 1990].

У роботі використані фізико-хімічні методи досліджень: прозорість та кольоровість - спектрофотометрично; водневий показник рН - потенціометрично; загальний білок - біуретовим методом; імуно-хімічні: електорфоретична однорідність - методом електрофоретичного розділення білків у веронал-медіналовому буфері з наступним елюіруванням та колориметруванням елюатів; антигенний склад препарату визначали методом імуноелектрофорезу; кількість агрегованих фракцій та фрагментів розщеплення гамаглобуліну виявляли методом колоночної гель-хроматографії; термостабільність - шляхом прогріву на водяній бані [ФС 42-344 ВС-90];

Біологічні властивості вивчали наступними методами: стерильність згідно з чинною інструкцією з контролю стерильності препаратів крові (1989), пірогенність, шкідливість та токсичність - згідно з вимогами Державної Фармакопеї (1990).

Експериментальні дані обробляли статистично [Ю.И.Иванов, О.Н.Погорелюк, 1990, О.П.Минцер и др., 1991].

Розділ 3 АНТИТОКСИЧНИЙ ПРОТИДИФТЕРІЙНИЙ ІМУНІТЕТ ДОНОРОЗДАТНОГО НАСЕЛЕННЯ

У рамках Національної програми імунопрофілактики дифтерії на 1993-2000 роки в Україні проведена протидифтерійна імунізація максимально широкого контингенту населення. У результаті дослідження антитоксичного протидифтерійного імунітету донороздатних осіб на протязі 1993-1995 років нами було встановлено, що 74-98 % сироваток крові донорів характеризуються високими титрами антидифтерійних антитіл від 1:80 до 1:4096.

Причому, більш виразна відповідь організму на протидифтерійне щеплення виявлена серед донорів - чоловіків і жінок із групами крові А(ІІ), В(ІІІ) за системою АВ0 (рис.).

У ході дослідження встановлено, що високі титри антидифтерійних антитіл від 1:80 до 1:40960 частіше зустрічаються у сироватці крові донорів-мешканців Києва (97,9 %) у порівнянні з жителями Київської області (54,75 %) та переважно у зимово-весняний період (86,3 % та 82,5 % відповідно).

Рис. Частота виявлення високих титрів антидифтерійних антитіл у донорів крові в залежності від їх фенотипу крові та статі (%)

Одержані дані дозволили припустити, що для виробництва високоактивного препарату алогенного антидифтерійного імуноглобуліну як сировину можна використовувати кров донорів із високим вмістом протидифтерійного антитоксину, яка одержана через 2-4 тижні після останньої ревакцинації з урахуванням високого ступеню імунної відповіді організму на протидифтерійне щеплення донорів із різними генетичними маркерами (стать та фенотип крові).

Розділ 4 ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНЕ ОБГРУНТУВАННЯ ОДЕРЖАННЯ ІМУНОГЛОБУЛІНУ ПРОТИ ДИФТЕРІЇ

Із крові донорів з титрами антидифтерійних антитіл від 1:80 до 1:40960 була одержана специфічна плазма. Під час певних температурно-часових режимів зберігання вихідної сировини були визначені строки її придатності - 24 години за температури (18+2)⁰С та 72 години за температури (4+2)⁰С, у замороженому стані - 1 рік за температури зберігання (мінус 20+5)⁰С (строк спостереження). Це дало можливість накопичити необхідну кількість сировини для фракціонування з метою одержання антидифтерійного імуноглобуліну.

Методом етанолового фракціонування на холоду з пула плазми донорів із титрами антидифтерійних антитіл від 1:640 до 1:2560 було одержано 8 серій препарату імуноглобуліну в лікарській формі у вигляді 10 % розчину з рівнем протидифтерійного антитоксину в титрах від 1:2560 до 1:10240.

У результаті вивчення імунологічних властивостей одержаного препарату, а саме - вмісту протидифтерійного антитоксину та імуноглобулінів ізотипів G, A, M (табл.3), було встановлено чотирикратну концентрацію специфічних антитіл у порівнянні з даними показниками донорської плазми.

Важливе значення мало визначення співвідношення індивідуальних зразків плазми крові у пулі для одержання препарату з високим рівнем антидифтерійних антитіл (табл.4).

Одержані дані доводять, що для отримання високоактивного препарату імуноглобуліну проти дифтерії необхідно використовувати пул плазми крові, який на 70 % і більше складається з індивідуальних зразків із рівнем протидифтерійного антитоксину від 1:80 та вище. Причому, більше 20 % з них повинні характеризуватися максимальними титрами антидифтерійних антитіл від 1:1280 та вище і менше 5 % - 1:80.

У динаміці зберігання зразків 8 серій антидифтерійного імуноглобуліну впродовж двох років за температури (4+2)⁰С титри специфічних антитіл залишалися без змін.

Розділ 5 ХАРАКТЕРИСТИКА ПРЕПАРАТУ АЛОГЕННОГО ІМУНОГЛОБУЛІНУ ПРОТИ ДИФТЕРІЇ

Для оцінки якості препарату імуноглобуліну проти дифтерії вивчалися його фізико-хімічні, імуно-хімічні та біологічні властивості, що знайшли відображення у Фармакопейній статті, оформленої нами згідно з вимогами Галузевого стандарту МОЗ України.

За результатами проведених досліджень вміст білка в зразках восьми серій одержаного препарату знаходився на рівні 9,5-10,2 %. Вивчення антигенного складу імуноглобуліну протидифтерійної дії показало, що на імуноелектрофореграмі виявлялися інтенсивна дуга преципітації Ig G та чотири додаткові дуги (Ig A, Ig M та двох імунологічно неактивних фракцій). Концентрація іонів водню (рН) в досліджуваних зразках восьми серій препарату знаходилась у межах 7,0-7,2. Визначення електрофоретичної однорідності показало, що фракція імуноглобуліну складає 97 % від загальної кількості білка в препараті. Агреговані фракції в усіх серіях препарату складали наступне співвідношення: мономери та димери - 90,2-94,7 %, полімери - 5,3-9,8 %, фрагментів - не виявлено. Вивчення термостабільності імуноглобуліну проти дифтерії показало, що ампульовані зразки досліджуваних серій препарату за умови нагрівання на водяній бані за температури 56 С впродовж чотирьох годин залишались у рідкій формі та не утворювали гелю. Прозорість і кольоровість одержаних серій антидифтерійного імуноглобуліну були в межах - 0,03-0,05 та 0,08-0,10 відповідно.

На основі проведених досліджень щодо вивчення біологічних властивостей імуноглобуліну проти дифтерії було зроблено висновок про стерильність, апірогенність, нетоксичність та специфічну безпечність восьми серій препарату.

Таким чином, в результаті проведених досліджень встановлено, що одержані серії препарату протидифтерійної дії за своїми основними параметрами відповідають вимогам чинної нормативної документації на імуноглобуліни у вигляді 10 % розчину. Встановлено строки придатності препарату - 2 роки за температури зберігання (4+2)⁰С.

Розділ 6 ВИЗНАЧЕННЯ АНТИДИФТЕРІЙНОЇ АКТИВНОСТІ ПРЕПАРАТУ АЛОГЕННОГО ІМУНОГЛОБУЛІНУ

Для контролю антидифтерійної активності препарату імуноглобуліну поряд із класичними методами (реакція флокуляції та за Ремером) були використані й спеціальні (у культурі клітин HeLa та статистичний), розроблені для виявлення антитіл даної специфічності, що дозволило всебічно оцінити специфічну активність і механізм дії дослідного препарату. Вперше з даною метою була використана культура клітин карциноми матки HeLa на підставі їх високої чутливості до дифтерійного токсину.

За результатами проведених досліджень встановлено, що одержаний препарат характеризується антидифтерійною активністю від 10,0 до 70,0 МО/мл у різних серіях (табл.5), повністю нейтралізує дію дифтерійного токсину in vitro, не впливаючи на морфологію і зростання клітинної культури, та in vivo - у дермонекротичній дозі на морських свинках.

Порівняння даних, одержаних за допомогою різних методів дослідження, свідчить про незначні розбіжності в показниках у межах однієї серії, що дозволило рекомендувати найбільш придатні для використання на СПК України методи оцінки специфічної дії антидифтерійного імуноглобуліну.

Розділ 7 СКРИНІНГ КОМЕРЦІЙНИХ СЕРІЙ ІМУНОГЛОБУЛІНУ ЩОДО ВМІСТУ АНТИДИФТЕРІЙНИХ АНТИТІЛ

Масова протидифтерійна імунізація донороздатного населення зумовила задачу наших досліджень по скринуванню комерційних препаратів імуноглобуліну різної специфічної дії щодо визначення в них антидифтерійних антитіл. Встановлено, що із 164 серій антистафілококового та нормального імуноглобуліну 70 % зразків мають протидифтерійний антитоксин у титрах 1:80 - 1:5120, а у поодиноких випадках - 1:10240 (табл.6). Причому, 25 % серій антистафілококового препарату та 14 % серій нормального імуноглобуліну характеризуються антидифтерійною активністю від 8 МО/мл до 32 МО/мл.

Нами було проведено експериментальне дослідження щодо вивчення стабільності антидифтерійної активності в комерційних препаратах імуноглобуліну різної направленості за прискореним методом, згідно з яким встановлено еквівалент наступних строків зберігання: 3 роки - за температури (42) С; 1 рік - за температури (184) С; 1 місяць - за температури 37 С. Одержані результати дослідження свідчать про незмінність титрів антидифтерійних антитіл у зразках шести серій антистафілококового та нормального імуноглобуліну впродовж трьох років за температури зберігання (42) С.

Таким чином, комерційні препарати імуноглобуліну різної специфічної дії зі значним вмістом протидифтерійного антитоксину, незмінним впродовж терміну придатності препаратів, можна вважати за потенційні антидифтерійні лікарські засоби.

ВИСНОВКИ

Високий рівень захворюваності на дифтерію в Україні визвав нагальну потребу розробити високоактивний антидифтерійний препарат імуноглобулін з крові донорів для включення в комплекс лікування хворих на тяжкі форми даної токсикоінфекції на заміну протидифтерійної конячої сироватки.

Одержано новий алогенний антитоксичний препарат антидифтерійний імуноглобулін, що характеризується специфічною активністю від 10 МО/мл до 70 МО/мл (патент України №22426А).

Джерелом одержання антидифтерійного імуноглобуліну є плазма крові донорів обох статей усіх груп крові (за системою АВ0), яка заготовлена через 2-4 тижні після щеплення, з антидифтерійними антитілами в титрах 1:80-1:40960 у разі зберігання своєї активності на протязі 72 годин за температури (4+2) ⁰С та у замороженому стані впродовж 12 місяців за температури (мінус 20+5) ⁰С.

Високі рівні протидифтерійного антитоксину у сироватці крові донорів переважають серед жителів м.Києва з групами крові А(ІІ), В(ІІІ), переважно у зимово-весняний період, що орієнтує на оптимальний контингент та часовий інтервал накопичення вихідної сировини для одержання специфічного імуноглобуліну.

Високоактивний препарат антидифтерійного імуноглобуліну одержано з пула плазми крові донорів, до складу якого входить понад 70 % індивідуальних зразків з тирами специфічних антитіл більше, ніж 1:80. До того ж, 20 % мають максимальні титри протидифтерійного антитоксину від 1:1280 та вище, а менше 5 % - 1:80.

Виявлені високі титри антидифтерійних антитіл від 1:80 до 1:10240 у комерційних препаратах імуноглобуліну різної направленості. 22 % серій препаратів антистафілококового та нормального імуноглобуліну характеризуються антидифтерійною активністю від 7,95 до 31,74 МО/мл у різних серіях.

Із чотирьох методів визначення специфічної активності антидифтерійного імуноглобуліну - реакції флокуляції, культури клітин HeLa, дермонекротичної проби на морських свинках, розрахункового методу - рекомендуються для використання на СПК України реакція флокуляції та розрахунковий метод на підставі їх інформативності, економічності та простоти виконання.

Розроблено та затверджено нормативну документацію на препарат “Імуноглобулін антидифтерійний людини донорський рідкий” для виробництва його на станціях переливання крові та клінічного застосування.

СПИСОК ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

Мельник Е.А., Федоровская Е.А. Состояние проблемы специфической профилактики и лечения дифтерии // Врачебное дело. - 1996. - № 10-12. - С.26-31.

Федоровська О.О., Назарчук Л.В., Мироненко В.І., Мельник О.А. Антидифтерійний імунітет донороздатного населення // Фізіологічний журнал. - 1997. - Т.43. - № 1-2. - С.109-112.

Мельник О.А. Комерційні препарати імуноглобуліну з донорської крові, як засіб для лікування хворих з тяжкими формами дифтерії // Лікарська справа. - 1997. - № 4. - С.105-106.

Fedorovskaya Ye.A., Melnick Ye.A. New experimental model for allogenic antidiphtheritic immunoglobulin specific activity determination // Journ.of Hematology. - 1999. - vol.84. - P.271.

Патент 22426А Україна, МКІ G 01 N 33/531, А 61 К 35/395. Спосіб одержання антидифтерійного імуноглобуліну / Перехрестенко П.М., Федоровська О.О., Назарчук Л.В., Мельник О.А., Степанчук В.А., Погодаєва Л.К. (Україна). - № 95062955; Заявл.23.06.95.

Перехрестенко П.М., Федоровская Е.А., Назарчук Л.В., Мельник Е.А., Степанчук В.А., Погодаева Л.К. Возможности получения антидифтерийных препаратов донорской крови // Тез.докл.Между-нар.конф.,посвященной 150-летию со дня рождения И.И.Мечникова “Идеи И.И.Мечникова в развитии современного естествознания” - Харьков,1995. - С.301.

Федоровская Е.А., Назарчук Л.В., Мельник Е.А., Степанчук В.А., Погодаева Л.К. Разработка аллогенных антидифтерийных препаратов крови // Тез.докл.Российской конф.”Актуальные вопросы службы крови и трансфузиологии”. - С.-Петербург, 1995. - С.289-290.

Федоровська О.О., Назарчук Л.В., Мельник О.А. Результати дослідження антидифтерійного імунітету донороздатного населення м.Києва // Тез.доп.Міжнар.симпозіуму “Актуальні питання медичної допомоги населенню”. - Чернівці, Україна - Енгельхольм, Швеція, 1996. - С.105-106.

Мельник О.А., Романенко Л.І. Антибактеріальні антитіла у комерційних препаратах алогенного імуноглобуліну // Тез.доп.науково-практичної конференції молодих вчених та фахівців “Сучасні проблеми гематології та трансфузіології”. - Київ, 1998. - С.47.

Размещено на Allbest.ru