Определение качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов в составе биологически активных добавок с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Определение качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов в составе биологически активных добавок с помощью высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ)

Готтих М.Б., Ташлицкий В.Н.

антоцианиновый пигмент черника

Черника (Vaccinium myrtillus) богата различными антоцианозидами, которые являются соединениями антоцианинов с гликозидами (углеводы) [1]. Гликозиды из состава антоцианозидов не проходят через клеточную мембрану, поэтому основу активности экстрактов составляют именно антоцианины. По структуре антоцианины очень схожи с флавоноидами [2].

Антоцианы помогают поддерживать целостность капилляров и стабилизировать коллаген. Антоцианы также являются потенциальными антиоксидантами. Клинические исследования показали, что черника эффективна при лечении болезней кровообращения, гипохромных анемиях, варикозном расширении вен и других венозных и артериальных заболеваниях. Антоцианы защищают вены и артерии, стабилизируя фосфолипиды эндотелиальных клеток и стимулируя синтез коллагена и мукополисахаридов, которые придают структурную целостность стенкам артерий. Антоцианы также предупреждают агрегацию и прилипание тромбоцитов к эндотелиальным поверхностям [3].

Антоцианы, извлекаемые из черники, способствуют синтезу светочувствительного пигмента сетчатки родопсина в фоторецепторах глаза, подавляют патологическую альдозо-редуктазную активность в тканях хрусталика и предупреждают развитие катаракты. Путем синтеза фосфолипидов клеточных мембран уменьшают хрупкость капилляров, восстанавливают их проходимость при сосудистых расстройствах (тромбозах), что способствует улучшению трофики сетчатки глаза [1,3]. В связи с этим комплекс антоцианинов благотворно влияет на остроту зрения и способность видеть в сумерках (куриная или ночная слепота) [1,3]. Данный эффект объясняется ускорением регенерации родопсина и активацией ферментов сетчатки.

В настоящее время в России зарегистрированы несколько пищевых добавок офтальмологического профиля, содержащих экстракты черники. Это «Фокус», «Стрикс», «Черника-форте», «Окулист» и др.

Нами было проведено исследование по определению качественного и количественного состава антоцианиновых пигментов в составе биологически активных добавок с помощью ВЭЖХ.

Цель исследования

Определение количественного и качественного содержания антоцианиновых пигментов черники в 4 образцах следующих препаратов: «Фокус» (производитель ЗАО АКВИОН, Россия), «Стрикс» (производитель Ferrosan, Дания), «Окулист» (производитель Диод, Россия), «Черника-форте» (производитель Эвалар, Россия).

Материалы и методы исследования

Для исследований в аптеках и аптечных пунктах были закуплены четыре образца биологически активных добавок для глаз, в состав которых входит черника: «Фокус», «Стрикс», «Окулист», «Черника-форте».

В работе данные образцы были зашифрованы следующим образом:

«Фокус» - № 1;

«Окулист» - № 2;

«Стрикс» - № 3;

«Черника-форте» - № 4.

Подготовка образцов для исследования

Образцы экстрагировали дистиллированной водой из расчета содержания антоцианинов 0,05-0,2 мг/мл [4]. Таблетка или содержимое капсулы тщательно измельчались в агатовой ступке. Для экстракции соответствующая навеска порошка каждого образца помещалась в пластиковую пробирку объемом 50 мл и добавлялся рассчитанный объем дистиллированной воды (от 10 до 50 мл в зависимости от навески и образца) для получения растворов с концентрацией 3,0; 8,0; 1,0 и 10,0 мг/мл для образцов 1-4 соответственно. Экстракция проводилась при непрерывном перемешивании на термошейкере C24KC Refrigerated incubator shaker Edison, NJ, USA при 160 об./мин, температуре 37°С в течение 30 мин. Из полученных растворов отбирались аликвоты объемом 1 мл, которые центрифугировали 10 мин при 14000 об./мин, фильтровали через Millex-GV13, 0,22 um, 13 mm Filter Unit, MILLIPORE и хранили при -10°С.

Для количественного определения суммарного содержания антоцианиновых пигментов методом рН-дифференциальной спектрофотометрии образец № 4 был разбавлен дистиллированной водой в 10 раз соответственно.

Определение суммарного содержания антоцианиновых пигментов методом рН-дифференциальной спектрофотометрии.

Были использованы буферные растворы № 1 и № 2:

Раствор № 1: рН 1 - 0,405 мг КСl, 1,238 мл конц. НСl в 100 мл воды.

Раствор № 2: рН 4,5 - 1,64 г натрия ацетата в 100 мл воды и НСl до рН 4,5.

К 0,96 мл буферного раствора № 1 или № 2 добавляли 40 мкл экстракта, приготовленного как описано выше, и определяли оптическую плотность при 510 нм и 700 нм с соответствующим буфером в качестве раствора сравнения. Использовали УФ-спектрофотометр Cary 50bio производства Varian (США). Для каждого образца эксперимент проводили дважды.

Суммарное содержание антоцианиновых пигментов рассчитывали по формуле [4]:

С (антоцианин, масс. %) = 100%[(А510рН1- А700рН1) - (А510 рН4,5 - А700рН4,5)]MWF/(lC),

Где MW - коэффициенты молярного поглощения и молекулярная масса антоцианина, используемого в качестве стандарта (для цианидин-3-глюкозида 26900 и 449,2 соответственно);

F = 25 - коэффициент разведения;

l =1 - длина оптического пути кюветы, см;

C - концентрация приготовленного раствора образца, г/л.

Определение качественного состава антоцианиновых пигментов методом ВЭЖХ.

Качественный состав антоцианиновых пигментов определялся методом обращенно-фазной ВЭЖХ на колонке Luna C18(2) 4,6?150 mm (5um) производства Phenomenex (США). Используется градиентное элюирование с подвижной фазой А (0,151% раствор трифторуксусной кислоты в воде) и подвижной фазой В (0,151% раствор трифторуксусной кислоты в ацетонитриле) по программе 5-40% В за 11 мин при скорости потока 1,5 мл/мин, температуре 25°С, с УФ-детекцией при 520 нм и УФ-спектральными данными от 230 до 800 нм. Был использован хроматограф Agilent1100, состоящий из четырехканального градиентного насоса с дегазатором, автосамплера, термостата и диодно-матричного детектора. Сбор и обработка хроматограмм осуществлялась с помощью программ «ChemStation B.01.03» и «ACD/SpecManager 10.05».

Для ВЭЖХ анализа образца № 1 с концентрацией 6 мг/мл использовалась аликвота 1 мкл, а для образцов № 2-4 с концентрацией 8, 10 и 10 мг/мл - аликвота 10 мкл. Анализ раствора каждого образца проводили дважды.

Результаты исследования и их обсуждение

С помощью УФ-спектрометрического анализа было исследовано суммарное содержание антоцианиновых пигментов во всех образцах. Полученные данные по двум независимым экспериментам приведены в таблице 1.

Как видно из полученных данных, все анализируемые образцы содержат антоцианиновые пигменты, однако их концентрация в разных образцах варьируется в широком диапазоне от 0,5 % (образец № 4) до 6,64 % (образец № 1), а содержание в одной таблетке или капсуле - от 1,1 мг до 18,35 мг.

Для определения качественного состава образцов использовался метод обращенно-фазной ВЭЖХ (оф-ВЭЖХ). Полученные результаты приведены на рисунке 1. Отнесение пиков проводилось на основании времен удерживания и соотношения площадей. Времена удерживания и соответствующие площади пиков приведены в таблице 2. Как видно из хроматограмм и таблицы 2, качественный состав и соотношение компонентов всех исследованных образцов практически одинаковы (в пределах погрешности метода определения площади плохо разрешенных пиков) и соответствуют литературным данным для экстрактов черники [4].

Выводы

На основании полученных данных (качественный анализ методом оф-ВЭЖХ) можно утверждать, что все исследованные образцы препаратов действительно содержат антоцианиновые пигменты из экстрактов черники, а не из других природных источников. Однако количественное содержание этих соединений, определенное методом рН-дифференциальной спектрофотометрии, варьирует в широком диапазоне и составляет для образцов:

№ 1 - 18,6±0,3 мг (6,6±0,1%);

№ 2 - 2,3±0,2 мг (1,01±0,09%);

№ 3 - 13,6±0,6 мг (2,9±0,1%);

№ 4 - 1,15±0,01 мг (0,48±0,01%).

Таким образом, в исследованных нами пищевых добавках офтальмологического профиля содержатся антоцианиновые пигменты из экстрактов черники в следующем количестве (препараты расположены в порядке убывания концентрации):

Фокус (ЗАО АКВИОН, Россия) - 18,6 мг;

Стрикс (Ferrosan, Дания) - 13,6 мг;

Окулист (Диод, Россия) - 2,3 мг;

Черника-форте (Эвалар, Россия) - 1,15 мг.

Статья принята в печать 20 июня 2007 г.

Литература

1. Nakaishi H., Matsumoto H., Tominaga S., Hirayama M. (2000) Altern Med Rev, 5 (6): 553-562.

2. Schmitt E., Stopper H. (2001) Nutrition and cancer, 41 (1-2): 145-149.

3. Head K.A. (2001) Altern Med Rev, 2:141-66.

4. Руководство по методам контроля качества и безопасности биологически активных добавок к пище. МИНЗДРАВ РОССИИ. - Москва, 2004. - С. 106.

Размещено на Allbest.ru