Вирусологические исследования

Размещено на http://www.allbest.ru/

Вирусологические исследования

Взятие патологического материала для вирусологических исследований

При взятии вируссодержащего патологического материала большое значение имеет правильность выбора материала и его свежесть. Вирусы очень чувствительны к нагреванию и гниению. Поэтому материал надо брать от свежих трупов (не позднее 12 часов после гибели), а еще лучше от убитых клинически больных животных. При выборе материала учитывают тропизм вирусов и клиническое проявление болезни, вид и возраст животного, стадию течения болезни, наличие видимых изменений в органах и тканях и т.д.

При жизни животного в качестве вируссодержащего материала можно использовать: афты и их содержимое (ящур), пустулы (оспа), слизь и смывы со слизистых, моча (чума свиней и др.), кровь и лимфа (при пантропных инфекциях). Посмертно кроме указанных материалов берут кусочки паренхиматозных и других органов (печень, селезенка, почки, мозг, лимфотические узлы). Трупы мелких животных направляют обычно целиком.

Берут материал по возможности стерильно при помощи стерильных инструментов и в стерильную посуду. Если лаборатория рядом, материал отправляют в неконсервированным и обычно в термосе со льдом. Если же материал надо транспортировать далеко, то его обычно консервируют и тщательно упаковывают (особенно, если отправляют по почте или самолетом). Кусочки органов консервируют в 50% стерильном глицерине или в насыщенном растворе хлорида натрия и дополнительно помещают в термос со льдом. Жидкий материал консервируют замораживанием и сохраняют при -20^о С (в термосе с сухим льдом). К материалу прилагают сопроводительный документ, в котором указывают эпизоотологические, клинические и патологоанатомические данные.

Лабораторные методы диагностики вирусных болезней

После постановки предварительного диагноза на вирусную болезнь, его необходимо подтвердить лабораторными исследованиями. Последние включают два метода:

Вирусологический метод (Аг - х)

Включает исследование патологического материала на наличие вируса.

1. Обнаружение вируса микроскопия мазков:

а) обычная световая (на наличие телец-включений); люминесцентная (МФ - метод флуорохромирования, МФА- метод флуоресцирующих антител); ИФА - иммуноферментный анализ; электронная;

б) индикация вирусов -РГА (реакция гемагглютинации), РГАд (реакция гемадсорбции).

в) ПЦР.

г) электронная микроскопия

2. Выделение вирусов путем заражения чувствительных биологических моделей:

• лабораторных животных;

• куриных эмбрионов (КЭ);

• культур тканей (КТ);

3. Идентификация вируса (определение вида), типизация (определение типа, варианта) и дифференциация.

Проводят путем постановки серологических реакций с известными биофабричными биофабричными иммунными сыворотками, с помощью ПЦР и электронномикроскопически.

Серологический метод (применяют исследуемые сыворотки на наличие антител), постановка реакций с известными биофабричными вирусными антигенами. РДП, РИЭОФ, РЗГА, РНГА, РСК, МФА, ИФА, РЗГАд, РН.

Подготовка патологического материала для лабораторной диагностики.

Присланный в лабораторию материал принимают, и по возможности, сразу начинают исследование, если же такой возможности нет, то его хранят до начала исследований в холодильнике при -20^о С.

Подготовку материала к вирусологическим исследованиям начинают с осмотра органов и тканей, если они были консервированы, их отмывают физраствором от консерванта.

Если труп поступил целый, сначала его осматривают, а затем проводят вскрытие, измененные органы тщательно осматривают, извлекают и помещают в стерильные флаконы, или чашки Петри. При подозрении на бешенство часто присылают голову трупа. В этом случае, ее осматривают, а затем вскрывают и извлекают мозг.

Жидкий материал проверяют на бактериальную загрязненность микроскопией мазков и посевом на среды (МПБ, МПА, среду Киитт-Тароцци и среду Сабуро) и при необходимости обрабатывают антибиотиками (пеницилин и стрептимицин по 500-2000 ЕД на мл среды в зависимости от степени загрязненности). патологический вирусный биологический

Из кусочков органов готовят суспензию. Для этого из присланных органов и тканей берут небольшие кусочки (1-1,5 г) и помещают в стерильную ступку, где после измельчения ножницами тщательно растирают до кашицеобразной массы со стерильным песком или стеклом. Затем добавляют стерильный физраствор в соотношении 1:5 или 1:10 и получается суспензия. Ее переносят в центрифужные пробирки и туда же вносят вышеуказанные антибиотики в тех же дозах. Суспензию в пробирках 2-3 раза замораживают (при -20^о,-50^оС) и оставляют при комнатной температуре или в термостате при 37^о С. При этом происходит дополнительное разрушение клеток и освобождение вируса. Затем пробирки с суспензией центрифугируют 15-20 минут при 3000 об./мин. Надосадочную жидкость проверяют на стерильность посевом на среды в аэробные и анаэробные условия и затем используют как вируссодержащий материал для: заражения лабораторных животных; заражения куриных эмбрионов; заражения культур тканей; постановки серологических реакций в качестве антигена.

Одновременно из исходного патматериала готовят мазки или мазки-отпечатки, которые исследуют на наличие телец-включений и вируса в клетках, после специальной окраски под обычным микроскопом или применяют люминесцентную микроскопию с использованием иммунофлуоресценции (флуоресцирующие антитела). При необходимости можно из органов готовить гистосрезы и исследовать их гистологически (например, при бешенстве).

Выделение вируса проводят на развивающихся куриных эмбрионах, в культуре тканей и на лабораторных животных

Выделение вирусов на лабораторных животных.

Выбор лабораторных животных зависит от вида вируса. Лабораторные животные являются биологической моделью. Иногда приходится проводить 3-5 "слепых", безсимптомных пассажей, прежде чем удастся адаптировать вирус к лабораторным условиям. Однако, к некоторым вирусам лабораторные животные не чувствительны, в этом случае приходится использовать естественно восприимчивых животных. Как, например, при чуме свиней и инфекционной анемии лошадей.

Цель заражения лабораторных животных.

Изучить патогенез болезни; выделить вирус из пат. материала; наработка иммунных и гипериммунных сывороток; наработка вакцин; поддержание вирусов в условиях лаборатории; титрация, с целью определения количества вируса в единице объема; биологическая модель для постановки реакции нейтрализации.

Выбор метода заражения лабораторных животных зависит от тропизма вируса. Так, при культивировании нейротропных вирусов животных заражают в мозг; респираторных интранозально, интратрахеально; дерматропных - подкожно и внутрикожно. Заражение производят с соблюдением правил асептики и антисептики. Различают много Способы заражения животных: подкожный; - интрацеребральный; внутрикожный; интраперитониальный; внутримышечный; интраокулярный; внутривенный; интранозальный; алиментарный.

После заражения животных метят, помещают их в изолированный бокс и ведут наблюдение в течение 10 суток. Гибель животного в первые сутки после заражения считается неспецифичной и в дальнейшем не учитывается.

3 признака указывают на результативность заражения: наличие клинических признаков, гибель животного, патологоанатомические изменения (величины, формы, цвета и консистенции органа).

Выделение вирусов на куриных эмбрионах

Куриный эмбрион - это оплодотворенное куриное яйцо, в котором развивается зародыш (эмбрион). Культивирование вирусов на куриных и перепелиных эмбрионах в последнее время получило широкое распространение как один из наиболее простых и надежных методов культивирования и диагностики многих вирусов и некоторых бактерий - бруцеллы, риккетсии, вибрионы.

Многие вирусы человека и животных способны культивироваться в развивающихся куриных эмбрионах. Эмбриональная ткань, особенно оболочки эмбриона, богатые тканями зародышевого эпителия, является благоприятной средой для размножения многих вирусов. Вирусы, имеющие эпителиотропные свойства (оспа, ИЛТ и др.), успешно развиваются на хорионаллантоисной мембране, вызывая макроскопически видимые изменения. Различные представители миксовирусов (грипп, болезнь Ньюкасла, чума плотоядных и др.), вирусы инфекционного бронхита, гепатита утят, арбовирусы и др. хорошо размножаются в эмбрионе при введении материала в аллантоисную полость. Некоторые вирусы успешно культивируются в желточном мешке.

Преимущества: экономически выгодно, кроме того яйца легко доступны.

У развивающихся куриных эмбрионов отсутствуют защитные механизмы, т.к. система иммунитета еще не развита;

Скорлупа яиц препятствует проникновению через неё бактерий и вирусов из окружающей среды;

Для культивирования и выделения вирусов на куриных эмбрионах требуется очень несложное оборудование - обычный термостат или инкубатор.

Условия:

1. Яйца получают из хозяйств заведомо благополучных по инфекционным заболеваниям;

2. Куриные эмбрионы лучше получать от белых пород кур (леггорн, русская белая), т. к. они более устойчивы к манипуляциям и не гибнут от маленьких травм. Кроме того, у них скорлупа белая и более прозрачная, чем у других пород, и легче просвечивается, что удобно для просмотра и наблюдения в процессе работы с ними;

3. Для инкубирования отбирают оплодотворенные яйца снесенные не более 10 суток тому назад;

4. Берут незагрязненные яйца, т. к. мыть их перед инкубированием нельзя, а грязные яйца хуже просвечиваются при просмотре (овоскопии) и при работе с ними можно инфицировать эмбрион в процессе манипулирования;

Инкубируют яйца в инкубаторе или в термостате с водяным нагревом и доступом воздуха, причем в процессе инкубации в термостате яйца 2-3 раза в сутки нужно переворачивать и для лучшего газообмена вынимать на 5-10 минут на воздух. Для поддержания определенной влажности в термостат ставят сосуд с водой для испарения, температура в термостате должна быть 38°.

Развитие зародыша происходит уже в первые сутки инкубирования, происходит закладка головного мозга, скелета. Строение куриного эмбриона в возрасте 7-9 дней.

Для заражения наиболее часто используют эмбрионы 7-12 суточного возраста. Работу с куриными эмбрионами проводят в стерильной комнате-боксе со строжайшим соблюдением асептики.

Цель заражения куриных эмбрионов: - выделить вирус из пат. материала; для приготовления живых и убитых вакцин; поддержание вируса в условиях лаборатории; - титрация вирусов; -биологическая модель для постановки реакции нейтрализации; - изучение интерференции вирусов и наработка интерферона;

Заражение куриных эмбрионов:

Для заражения нужно отбирать жизнеспособные эмбрионы с хорошо выраженной подвижностью. Перед заражением все эмбрионы тщательно просматривают в затемненной комнате на овоскопе. Доза заражения составляет 0,1-0,2 смз.

В зависимости от вида вируса и цели заражения имеются различные методы введения вируссодержащего материала: Заражение на хориоаллантоисную оболочку. Заражение в аллантоисную полость.

Заражение в желточный мешок. Заражение в амниотическую полость Заражение в тело эмбриона и заражение в головной мозг. Заражение в крупные кровеносные сосуды.

После заражения куриные эмбрионы ставят в термостат. Их ежедневно овоскопируют в течение 7-8 суток в зависимости от вида вируса. Если эмбрион погиб в течение первых 14-18 часов после заражения, то гибель считается неспецифической и в дальнейшем не учитывается. Поэтому, так же как и при заражении лабораторных животных, в сомнительных случаях рекомендуется, делать несколько пассажей и в опыт брать на каждый материал по несколько эмбрионов.

После вскрытия погибших зараженных куриных эмбрионов наблюдают характерные изменения, вызванные вирусом. Наиболее часто поражения наблюдают на хориоаллантоисной оболочке: появляются кровоизлияния и воспалительные очаги круглой формы. Кровоизлияния могут быть на теле эмбриона. Весь материал собирают в стерильную посуду.

Размещено на Allbest.ru