Особливості вільнорадикальних процесів у спермі і крові людини при зміні морфофункціональних характеристик сперми

Размещено на http://www.allbest.ru/

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України

Національний медичний університет ім. О.О. Богомольця

УДК 612.616.2:612.112:612.014.4:612.223:577. 334

Автореферат

дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук

Особливості вільнорадикальних процесів у спермі і кровілюдини при зміні морфофункціональних характеристик сперми

03.00.13 - фізіологія людини і тварин

Серебровська Зоя Олександрівна

Київ 2000

Загальна характеристика роботи

Актуальність теми. Вивчення закономірностей функціонування чоловічих статевих клітин, які відіграють вирішальну роль у здійсненні репродуктивної функції, набуває особливої актуальності в сучасних умовах. Це пов'язано з погіршенням екологічної ситуації, високою урбанізацією, стресорними чинниками, шкідливими звичками, порушенням нормального способу життя людини в сучасному індустріальному суспільстві, що може призводити до порушень репродуктивної функції і навіть до розвитку чоловічої безплідності (Chatterjee J, 1994; Anger J, 1995; Нікітін А.И. 1998).

Відомо, що вільнорадикальне окислення (ВРО) відіграє значну роль в нормальній життєдіяльності сперматозоїдів. Як показали дослідження останніх років, процеси гіперактивації сперматозоїдів і їх акросомна реакція відбуваються тільки в присутності кисневих радикалів (КР) (de Lamirande, 1998). В умовах in vitro аеробна інкубація сперматозоїдів у присутності іонів Са²⁺ призводить до їх активації, і навпаки, додавання до сперми супероксиддисмутази (СОД) цілком припиняє реакції капацитації і гіперактивації (de Lamirande, 1993). Джерелом кисневих радикалів у спермі крім лейкоцитів служать самі сперматозоїди. Відомо, що за синтез активних форм кисню в цих клітинах відповідають мембранна НАДФ⁺- оксидаза і цитоплазматична НАД⁺- оксидаза. Однак, функціональна роль кисневих радикалів у реакціях сперми багато в чому залишається нез'ясованою.

Є поодинокі дані про те, що інтенсивність продукції кисневих радикалів сперматозоїдами з аномальною структурою в десятки разів перевищує таку морфологічно нормальними клітинами (Gagnon, 1995). Подібна активація продукції кисневих радикалів спостерігається і при оліго- та астенозооспермії (Aitken, 1987; Plante, 1994). В той же час неясно, чи є таке підвищення продукції КР наслідком патологічної неузгодженості діяльності ферментних систем або фізіологічно обумовленою реакцією компенсації функціональної недостатності чоловічих статевих клітин.

Водночас відомо, що високі концентрації супероксидного радикалу призводять до гальмування капацитації, акросомної і спермооцитарної реакції (Aitken et all., 1992; Comhaire et al.,1999). У зв'язку з цим були спроби вивчення можливості корекції зрушень морфофункціональних характеристик сперми за допомогою антиоксидантів (Lenzi et al., 1994; Nivsarkar et al., 1998; Omu et al., 1999; Rolf et al., 1999). Результати цих досліджень неоднозначні і найчастіше суперечливі. Це пов`язано скоріше всього з тим, що залишаються невивченими багато аспектів морфофункціонального стану сперми, у яких вільнорадикальне окислення відіграє конструктивну або деструктивну роль.

У зв'язку з цим, доцільним є дослідити, чи існує зв'язок між рухливістю, концентрацією і особливостями структури сперматозоїдів, з одного боку, та інтенсивністю продукції ними ВР, з іншого, у чоловіків із нормальними та зміненими морфофункціональними характеристиками сперми.

Відомо, що в різних екологічних умовах, при дії іонізуючої радіації морфофункціональні характеристики сперми значно змінюються (Bartoov et al., 1997; Fischbein et al., 1997). Разом з тим, невивченим залишається питання про зв'язок між інтенсивністю вільнорадикального окислення в спермі з її морфофункціональним станом як у осіб із нормальними кількісними і якісними показниками сперми, так і при зміні цих показників у чоловіків, що працюють в умовах дії малих доз іонізуючої радіації, а також у осіб, що страждають на безплідність, яка супроводжується різким зниженням кількості та якості сперматозоїдів. Малодослідженим залишається також питання про взаємозв'язок між процесами вільнорадикального окислення в спермі та в крові. Такі дослідження необхідні, оскільки інтенсивність ВРО у крові відбиває сумарну активність і спрямованість процесів ВРО в тканинах організму. Встановлення закономірностей подібних взаємозв'язків може відкрити нові можливості корекції порушень морфофункціональних характеристик сперми і пов'язаних з ними вільнорадикальних процесів.

Як відомо, одним із засобів нефармакологічного впливу на вільнорадикальні процеси є періодичні гіпоксичні впливи, що знижують інтенсивність ВРО і підвищують активність антиоксидантних систем при деяких захворюваннях (бронхіальній астмі, алергічних захворюваннях, хворобі Паркінсона - Меєрсон Ф.З.,1992; Маньковська І.М. та ін.,1993; Малишев та ін.,1995; Serebrovskaya Т.М. et al.,1999). У той же час, питання про можливість корекції зрушень вільнорадикальних процесів і морфофункціональних характеристик сперми за допомогою цих тренувань залишається цілком недослідженим.

Із сказаного випливає, що дослідження особливостей вільнорадикальних процесів у спермі і крові чоловіків із різними морфофункціональними показниками сперми є актуальним не тільки для розуміння фундаментальних механізмів діяльності сперматозоїдів, а й для корекції порушень цієї діяльності.

Мета роботи: дослідити особливості вільнорадикального окислення в спермі і крові людини при різних морфофункціональних характеристиках сперми, a також можливості корекції зрушень процесів ВРО за допомогою періодичних гіпоксичних впливів.

Основні завдання дослідження:

Вивчити показники струкрури та функціональної активності сперматозоїдів у осіб із різним станом репродуктивної функції: працівників Чорнобильскої атомної станції, осіб із встановленою олігозооспермією, а також у мешканців міст Києва і Львова.

Дослідити показники спонтанної та ініційованої хемілюмінесценції в суцільній спермі та її фракціях (спермальній плазмі, суспензії сперматозоїдів) у осіб із різними морфо-функціональними характеристиками сперми.

Дослідити показники спонтанної та ініційованої хемілюмінесценції сироватки крові, концентрацію продуктів перекисного окислення ліпідів і активність антиоксидантних ферментів крові, а також активність деяких ферментів лейкоцитів у осіб вищезгаданих груп.

Вивчити вплив двотижневого курсу періодичної гіпокситерапії на вільнорадикальні процеси в крові та спермі у осіб зі зміненими морфофункціональними показниками сперми.

Наукова новизна одержаних результатів. Показано, що певний рівень продукції вільних радикалів в спермі здорових людей є необхідною умовою нормального протікання процесів, пов'язаних із репродуктивною функцією. Отримано нові дані про надмірну активацію ВРО у спермі зі зниженими морфофункціональними характеристиками. Вперше виявлено, що зниження концентрації і рухливості сперматозоїдів як при олігозооспермії, так і внаслідок дії екологічних чинників, супроводжується підвищенням інтенсивності ВРО в суцільній спермі та її фракціях. Встановлено особливості морфологічних і функціональних показників сперми чоловіків, що працювали на ЧАЕС, а також мешканців Києва.

Отримано нові дані про зв'язок між інтенсивністю процесів ВРО у спермі і крові людини: підвищений рівень хемілюмінесценції і концентрації продуктів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) у крові позитивно корелює з хемілюмінесценцією спермальної плазми. Вперше показано, що курс періодичної гіпоксії у працівників ЧАЕС і мешканців Києва призводить до зниження рівня ВРО в крові, а також до позитивних змін деяких показників сперми.

Теоретичне і практичне значення одержаних результатів. Результати досліджень мають теоретичну цінність, оскільки поглиблюють існуючі уявлення про участь процесів ВРО в життєдіяльності сперматозоїдів із нормальними та зміненими характеристиками. Показано взаємозв'язок між інтенсивністю ВРО в спермі і рівнем рухливості сперматозоїдів, що може сприяти більш детальному розумінню ролі кисневих радикалів у здійсненні репродуктивної функції людини. Отримані дані з'ясовують патогенетичні шляхи корекції порушень морфофункціонального стану сперми і пов'язаних з ними змін вільнорадикальних процесів та вказують на перспективність подальшого дослідження можливостей корекції чоловічої репродуктивної функції за допомогою періодичних гіпоксичних впливів.

Результати і висновки цієї роботи можуть бути використані в науково-дослідних інститутах, що займаються вивченням репродуктивної функції, та при викладанні курсів фізіології людини і тварин, нормальної і патологічної фізіології в університетах і медичних навчальних закладах.

Особистий внесок автора. Автором самостійно визначені мета і завданні роботи. Особисто виконані дослідження ВРО в крові і спермі людей, що проживають у різних регіонах України і хворих на безпліддя, проведені курси гіпоксичного тренування, зроблено аналіз фактичного матеріалу, написана робота.

Обстеження репродуктивної функції здорових людей і осіб з олігозооспермією, зокрема збір матеріалу і морфологічний аналіз сперми, проводилися разом із лікарями відділення сексопатології Інституту урології і нефрології АМНУ (зав. відділенням, д.м.н., професор І.І..Горпинченко, д.м.н. М.І.Бойко та к.м.н. Л.І.Добровольська), а також із завідувачем кафедрою адрології Олд Домініон Університету (Норфолк, США) професором Робертом Джеймсом Свенсоном.

Апробація роботи. Результати роботи доповідались на: Міжнародній конференції з клінічної хемілюмінесценції в Берліні у 1994 і 1996 рр. (Німеччина); Міжнародному конгресі “Інтерастма-1995” у Познані у 1995 р. (Польща); на дев'ятому і десятому Міжнародних симпозіумах по гіпоксії в Лейк-Луізі у 1995 і 1997 рр. (Канада); на засіданнях київського відділення Українського патофізіологічного товариства у 1998 і 2000 рр.

Публікації. За результатами роботи надруковано 8 статей і 13 тез доповідей.

Обсяг і структура дисертації. Дисертаційна робота викладена на 130 сторінках друкованого тексту, складається зі вступу, огляду літератури, опису матеріалів та методів дослідження, 3 розділів результатів власних досліджень, заключення, висновків і списку літератури, який складається із 155 джерел. Робота ілюстрована 17 таблицями і 6 рисунками.

Основний зміст роботи

Об'єкт та методи дослідження. Нами обстежено 87 чоловіків у віці 20-37 років, що розподілялись на чотири групи:

Група 1 складалася із 10 робітників, які в 1986-87 рр працювали вахтовим методом на ЧАЕС і жили в м. Cлавутич. Усі члени групи одержали в середньому по 0.25 БЕР іонізуючого опромінення.

Група 2 складалася із 18 пацієнтів Інституту урології і нефрології АМНУ з клінічно та лабораторно підтвердженими ознаками порушення репродуктивної функції у вигляді олігозооспермії та безпліддя.

Група 3 була сформована із 22 умовно здорових чоловіків-курсантів Київського військового інституту керування і зв'язку, які ніколи не звертались до медичних закладів зі скаргами на розлади репродуктивної функції.

Група 4 складалася із 37 здорових чоловіків-курсантів Львівської міліцейскої академії.

Щодо усіх випробуваних була зібрана інформація про куріння, вживання алкоголю і кофе. Кваліфікованими лікарями - співробітниками Інституту урології і нефрології АМНУ разом із професором Р. Дж. Свенсоном було проведено ретельне медичне обстеження усіх випробуваних.

Всі обстеження були проведені вранці, натще після 12 годин голодування. У частини випробуваних, які були піддані гіпоксичному тренуванню, брали проби крові і сперми тричі: вперше, потім через 2 тижні, і потім після 2-тижневого курсу тренувань.

Морфофункціональні характеристики сперми людини. Дослідження об'єму, рН, рухливості і концентрації сперми проводилося відразу ж після забору проб. рН вимірювався рН-метром фірми Rаdelkis (Угорщина). Концентрація сперматозоїдів вимірювалася в камері Горяєва при розведенні сперми у співвідношенні 1 : 200 розчином, що містить 5 г гідрокарбонату натрію і 1 мл формаліну на 100 мл дистильованої води (Kruger T.F., 1988). Розраховувалася кількість сперматозоїдів у 1 мл сперми та загальна кількість сперматозоїдів у пробі шляхом множення значення концентрації на об'єм еякулята. Рухливість сперми аналізували за допомогою ATS - аналізатора рухливості (J. C. Diffusion International, La Ferte Frensel) при температурі 37^о С. Було досліджувано 100 траєкторій сперматозоїдів для кожної проби. Визначали відносну кількість всіх рухливих сперматозоїдів у відсотках від загальної кількості.

Дослідження морфологічних особливостей сперми проводили за методом R.Eliasson (1971). У роботі застосовувалися критерії ВООЗ для оцінки морфологічних характеристик сперми (форма та розміри головки, акросоми, шийки і хвоста сперматозоїда, співвідношення параметрів головки і шийки та ін.). Оцінювалася відносна кількість сперматозоїдів із нормальними морфологічними характеристиками у відсотках від їх загальної кількості.

Інтенсивність СРП у спермі і крові. Хемілюмінометрію для оцінки інтенсивності ВРО в суспензії сперматозоїдів, спермальній плазмі, суцільній спермі і сироватці крові здійснювали на приладі ХЛМЦ-1 (Україна) за методом Н.І. Серкіза (1984). Ініціацію хемілюмінесценції проводили додаванням у вимірювальну кювету 0.02 мл 3%-ного розчину Н₂О₂. Вимірювали інтенсивність першого спалаху після ініціації (Пік ХЛ) та суму імпульсів випромінювання за першу хвилину.

Концентрацію продуктів ПОЛ у крові (МДА, дієнових коньюгатів та гідроперекисів) визначали за допомогою ТБК-теста (Гаврилов, 1987). Активність еритроцитарної СОД визначали спектрофотометрическим методом, що базується на визначенні ступеня гальмування реакції окислювання кверцетину (М.А. Королюк, 1988). Активність каталази визначали в суцільній крові за методом, що заснований на спроможності перекису водню утворювати із солями молибдену стійкий забарвлений комплекс (М.А. Королюк, 1988).

Морфологічний і цитохімічний аналіз крові. У пробах крові з пальця визначали вміст лейкоцитів і популяційний склад клітин. Цитохімічні дослідження активності лейкоцитарних ферментів проводили з використанням напівкількісного методу оцінки (Hayhoe, Qualino, 1980). Активність сукцинатдегідрогенази (СДГ) у лімфоцитах оцінювалася по реакції відновлення солей нітросинього тетразолію у вигляді осаду диформазана синього кольору. Активність кислої фосфатази нейтрофілів визначали за методом З.Н.Бутенко та ін.(1978). Визначення активності мієлопероксидази нейтрофілів проводили за методом , який базується на реакції окислення бензидину перекисом водню.

Метод гіпоксичного тренування. Нами було використано метод періодичних гіпоксичних впливів, який базується на методиці зворотнього дихання з контрольованим поглинанням вуглекислого газу (зростаюча ізокапнічна гіпоксія). Досліджувані тричі на день із перервами в 15 хвилин дихали в спірограф, в якому парціальний тиск кисню поступово зменшувався. Вихідна газова суміш складалася з 20.9% О₂ і 79.1% N₂. Парціальний тиск кисню і вуглекислого газу контролювали за допомогою мас-спектрометра МХ62-02. Людина дихала в спірограф 5-6 хвилин до досягнення концентрації 7-8% кисню у вдихуваному повітрі. Тренування проводили протягом 15 днів щодня крім неділі.

Статистична обробка даних. Для обробки отриманих результатів використовували парні та непрарні критерії Стьюдента, Вілкоксона та Вілкоксона-Манна-Уітні. Кореляційний аналіз здійснювали з використанням програм ANOVA.

Результати досліджень та їх обговорення

Морфо-функціональні характеристики сперми та інтенсивність вільнорадикальних процесів в ній. Показники, що характеризують функціональний стан сперматозоїдів і сперми, достовірно відрізнялися в досліджених групах. Найбільш низька концентрація сперматозоїдів спостерігалась у осіб з олігозооспермією (18±5.6 млн/мл). У групі працівників ЧАЕС цей показник (75±14 млн/мл) виявився в 2.7 рази нижчий, ніж в групі львівських курсантів (206±10.1 млн/мл). У здорових молодих людей, що постійно проживають у Києві, концентрація сперматозоїдів (148±16.8 млн/мл) була знижена на 40% у порівнянні зі львівською групою, але виявилася вище, чим у групі працівників ЧАЕС. Аналогічний розподіл мали показники загальної кількості сперматозоїдів.

Найнижчий відсоток рухливих сперматозоїдів спостерігався в групі працівників ЧАЕС (42.2±5.3%). В групі киян рухливість сперматозоїдів (63.6±3.8%) виявилася вірогідно більш високою, ніж у групі працівників ЧАЕС, однак значно нижче, ніж у групі львів'ян (81.4±5.3%). Цей показник у групі осіб з олігозооспермією (60.5±5.5) не відрізнявся від такого в київській групі, був вірогідно вище показників групи працівників ЧАЕС і вірогідно нижче показників групи львів'ян.

Показник загальної кількості рухливих сперматозоїдів залежить від концентрації сперматозоїдів в еякуляті. Тому найнижчі показники спостерігалися в групі осіб з олігозооспермією. У групі працівників ЧАЕС загальна кількість рухливих сперматозоїдів була достовірно нижчою за таку в групах киян (у 2 рази) і львівян (у 3 рази). Київська група по даному параметру була в 2.3 рази вище за групу працівників ЧАЕС і вірогідно (у 1.5 рази) нижче групи львівян. Львівяни по даному показнику були вірогідно вищі всіх інших груп. Подібний розподіл мав місце також щодо відносного вмісту сперматозоїдів з високою рухливістю.

Зниження концентрації і рухливості сперматозоїдів у робітників ЧАЕС можна пояснити пошкоджуючою дією іонізуючої радіації на сперматогенез. За даними літератури (Нікітін, 1998), опромінення порівняно невеликої інтенсивності може викликати минущу азооспермію. Необхідно відзначити, що незважаючи на знижені характеристики сперми в групі працівників ЧАЕС щодо інших груп здорових людей, ці показники знаходяться в межах норми ВОЗ, тобто така сперма при інших сприятливих умовах (наявність овуляторных циклів, життєздатність ооцитів, продукція необхідної кількості цервікального слизу эстрогенного типу у жінки, збіг термінів статевих актів і овуляції, та інше) може привести до зачаття.

Зниження рухливості, концентрації і морфологічних характеристик сперми у жителів Києва в порівнянні з жителями Львова може бути викликано комплексним впливом групи чинників, серед яких не можна виключити вплив іонізуючої радіації, джерелом якої є ЧАЕС. Водночас жителі великого міста підлягають дії інших чинників, що впливають на репродуктивну функцію. Серед них особливо варто виділити інформаційні перевантаження, порушення режимів сну і відпочинку, шкідливі навички, конфлікти в побуті і на роботі. Створювані в такий спосіб стресорні ситуації пригнічують репродуктивну функцію. Отримано дані про те, що у тварин хронічні стресорні впливи викликають зміни гормонального фону з наступним зниженням репродуктивної функції (Сапунов,1984, Беляев, 1988). Надходження деяких хімічних токсичних речовин із водою та їжею може також негативно впливати на репродуктивну функцію. Зокрема, хімічні речовини змінюють характер секреції простати і пухирців, що впливає на якість сперми (Scharader, 1993).

Результати дослідження вільнорадикальных процесів у спермі показали, що хемілюмінесценція суцільної сперми в групі хворих на олігозооспермію майже в 3 рази перевищує цей показник у групі львівян. У групі чорнобильців він знаходився на тому ж рівні, що й у хворих. Між киянами та львів'янами достовірних змін по цьому показнику виявлено не було (табл.1. ).

Таблиця 1. Показники хемілюмінесценції компонентів сперми досліджуваних осіб

ХЛ - сумарне випромінювання ініційованої хемілюмінесценції

Пік ХЛ - максимальна інтенсивність ХЛ після ініціації

вільнорадикальне окислення сперматозоїд кров

Щодо хемілюмінесценції спермальної плазми групи осіб з олігозооспермією і чорнобильців не відрізнялися між собою. Показники групи киян були вірогідно вищі групи львівян. У більшій мірі розходження виражені по показнику ХЛ сперматозоїдів. Звертає на себе увагу, що найвищий показник був у групі чорнобильців: він у 2,5 рази перевищував рівень у львівян. У групі осіб з олігозооспермією ХЛ сперматозоїдів була також значно вища, ніж у львівян і киян. Київська група в даному випадку не відрізнялася від львівської. Можна зауважити, що хемілюмінограми суспензій сперматозоїдів значно розрізняються, у той час як хемілюмінограми спермальної плазми практично ідентичні.

Таким чином, розходження в морфо-функціональних показниках сперми супроводжувалися аналогічними розходженнями вільнорадикальних процесів у ній. Проведений нами вперше мультифакторний кореляційний аналіз між морфологічними і функціолнальними характеристиками сперми, з одного боку, і вільнорадикальними процесами в ній, з іншого, показав, що зниження рухливості, а також концентрації сперматозоїдів супроводжувалося підвищенням рівня вільнорадикального окислення. Коефіцієнт кореляції між рухливістю сперматозоїдів та інтенсивністю їх ХЛ дорівнював -0.48 (p < 0.01). Простежувалась негативна кореляція між загальною кількістю рухливих сперматозоїдів та інтенсивністю ХЛ суцільної сперми (r = -0.30, p < 0.05), спермальної плазми (r = -0.33, p < 0.05) та сперматозоїдів (r =- 0.46, p < 0.01), a також концентрацією дієнових коньюгатів (r = -0.34, p < 0.05) та гідроперекисів (r = 0.31, p > 0.05). З іншого боку, не спостерігалося вірогідного зв'язку між концентрацією аномальних клітин та інтенсивністю ХЛ суцільної сперми, спермальної плазми і сперматозоїдів. Таким чином, ми не можемо стверджувати, що джерелом вільнонорадикального окислення в спермі є виключно аномальні клітини. Концентрація лейкоцитів у спермі не розрізнялася в групах. Тому лейкоцити як джерело надлишкової продукції вільних радикалів також виключаються. Залишається припустити, що розходження в інтенсивності вільнорадикальних процесів в спермі представників різних груп обумовлені різним рівнем сумарної продукції супероксиду сперматозоїдами. Виходячи з наших даних, можна зробити висновок, що низька активність сперматозоїдів супроводжується підвищенням продукції ними вільних радикалів. Можливо, що між явищем активації СРП і зменшенням рухливості сперматозоїдів існують причинно-слідчі відношення. У літературі є дані про те, що рухливість знижується і швидко припиняється відразу ж після блокади мітохондрій і відновлюється після додавання до сперматозоїдів АТФ (Alvares et all.,1987). Можна припустити, що порушення роботи мітохондрій у сперматозоїдах із зниженою рухливістю супроводжується активацією синтезу кисневих радикалів. Іншим можливим поясненням може бути явище апоптозу: сперматозоїди зі зниженими морфо-функціональними характеристиками включають механізми самознищення, що супроводжується підвищеною продукцією кисневих радикалів.

Можливо, що деякий внесок в активацію ВРП сперми вносять екзогенні гідроперекиси, що надходять із крові. Коефіцієнт кореляції між інтенсивністю ХЛ сироватки крові та суцільної сперми по сукупним даним всього досліджуваного контингенту (87 осіб) складав 0,3 (р<0,05). Як відомо, дія іонізуючої радіації викликає активацію ПОЛ в тканинах, що призводить до накопичення в крові гідроперекисів, які проходять крізь гемато-тестикулярний бар'єр і стимулюють перекисні процеси в спермі.

З метою більш глибокого дослідження механізмів підвищення інтенсивності ВРО сперми осіб обстежених груп вивчалися показники вільнорадикальных процесів крові. Показники ВРО в крові відображують інтенсивність даного процесу в цілісному організмі, тому по результатах дослідження крові можна судити, чи є зміни ВРО сперми відбитком загальної спрямованості даного процесу в тканинах. Нами досліджувалась спонтанна та ініційована хемілюмінесценція сироватки крові, концентрація дієнових коньюгатів, гідроперекисів та МДА в крові, активність СОД і каталази крові, а також активність ферментів ЛДГ, СДГ,НАДФ⁺ оксидази і МПО лейкоцитів.

Вміст лейкоцитів у крові обстежених осіб знаходився в межах норми й істотно не розрізнявся у представників різних груп. Водночас, при дослідженні кількісних і якісних особливостей клітинних елементів білої крові виявлені значні розходження між досліджуваними групами. По вмісту паличкоядерних нейтрофілів показники груп чорнобильців і киян були на 50% вище ніж в львівській групі. Для групи осіб з олігозооспермією різниця невірогідна. Відносний вміст сегментядерних нейтрфілів у групах працівників ЧАЕС (51±3,7), осіб з олігозооспермією (48±2,8) і киян (51±3.1) було знижено щодо групи львівян (59±1,3). З іншого боку, відносний вміст лімфоцитів в крові в групах працівників ЧАЕС (36±1,7), осіб з олігозооспермією (36±2,3) і киян (33±1,8) були вищі, ніж в групі львівян (28±1.1). Показники лейкоцитарної формули свідчать про те, що в цих групах спостерігається зниження концентрації нейтрофілів на фоні підвищення концентрації лімфоцитів відносно показників львівської групи. Найбільше ці відмінності виражені в групі працівників ЧАЕС.

Активність ЛДГ і СДГ лімфоцитів не відрізнялися у представників досліджуваних груп. Таким чином, активність ферментів, що відповідають за енергозабезпечення імунокомпетентних клітин, суттєво не змінена. В той же час, активність бактерицидних ферментів в групах працівників ЧАЕС і киян була значно вищою . Так, активність МПО - головного фермента азурофільних гранул в цих групах була на 10-11% вище групи львівян. Активність НАДФ⁺ -оксидази нейтрофілів у групах працівників ЧАЕС і киян була також підвищена на 17-25% у порівнянні зі львівською групою.

При оцінці про- і антиоксидантних властивостей крові було встановлено, що інтенсивність спонтанної ХЛ сироватки крові у групі працівників ЧАЕС була достовірно вищою за таку у львівській групі. По всіх інших групах по цьому показнику розходжень не спостерігалося. Інтенсивність ініційованої ХЛ сироватки крові в групі працівників ЧАЕС була вірогідно (на 23%) вище за таку в львівській групі і вище, чим у групі осіб з олігозооспермією. Найбільш виражені розходження між групами спостерігалися по показнику піка ХЛ. У групі працівників ЧАЕС даний показник був два рази вище, чим у львівській групі, вірогідно вище, ніж у групах осіб з олігозооспермією і киян.

Рівень діенових коньюгатів у групі працівників ЧАЕС був у 2,5 рази вище, ніж у групі львівян і вірогідно вище чим у групі осіб з олігозооспермією. У групі киян даний показник був у 2 рази вище, ніж у львівській групі і вірогідно вище ніж у групі осіб з олігозооспермією. Аналогічна картина спостерігалася щодо показників концентрації гідроперекисів: найвище значення показника було в групі працівників ЧАЕС (на 70% вище, ніж у львівській групі) , потім - в групі киян ( на 41% вище, чим у групі львовян). Концентрація МДА в крові в групі працівників ЧАЕС була вище на 55%, ніж у групі львівян. Концентрація МДА в групі киян - на 23% вище, ніж у львівській групі. У групі осіб з олігозооспермією даний показник не відрізнявся вірогідно від такого у львівській групі.

Таким чином, показники інтенсивності вільнорадикального окислювання на всіх досліджуваних рівнях - починаючи від перших стадій, про які можна судити по показниках хемілюмінесценції, і закінчуючи кінцевими продуктами - гідроперекисами і МДА - були підвищені в групах працівників ЧАЕС і киян у порівнянні зі львівською групою. При цьому найбільш виражені зміни спостерігалися в групі працівників ЧАЕС. У осіб з олігозооспермією виражених змін в інтенсивності вільнорадикальних процесів виявлено не було. Таким чином, за винятком останньої групи, у осіб із виявленим зниженням морфофункціональних характеристик сперми та підвищенням інтенсивності вільнорадикальних процесів у ній спостерігається також активація ВРО крові.

Активність еритроцитарної СОД і каталази в групі працівників ЧАЕС була вище, ніж в групі львівян. У осіб з олігозооспермією дані показники вірогідно не відрізнялися від львівян. Така активація системи антиоксидантного захисту в групах осіб із підвищеним радіаційним ризиком може розглядатися як компенсаторна реакція у відповідь на інтенсифікацію вільнорадикальних процесів.

Чисельні дані про позитивний вплив гіпоксичного тренування на стан здоров'я людини, зокрема, на систему крові, послужили приводом до проведення курсу гіпокситерапії для осіб зі зниженими морфо-функціональними показниками сперми. Для того, щоб переконатися, що зміни показників відбулися дійсно під дією гіпоксії, нами було проведено спеціальне контрольне дослідження, у якому здоровим особам імітували всі умови гіпоксичного тренування, однак без змін парціального тиску кисню у вдихувальній суміші.

Результати досліджень показників репродуктивної функції після курсу періодичної гіпоксії показали, що морфофункціональні характеристики сперми, а також показники вільнорадикальных процесів у сперматозоїдах і суцільній спермі не змінилися, за винятком підвищення ( на 22%) концентрації рухливих сперматозоїдів на фоні зниження ХЛ спермальной плазми. Найбільше виражені зміни спостерігалися по показниках крові. Зареєстровано зниження ХЛ сироватки крові і підвищення активності еритроцитарної СОД (Рис. 5). В групі чорнобильців відмічено верогідне зниження концентрації МДА в крові, підвищення вмісту лейкоцитів, зростання кількості нейтрофілів на фоні підвищення вмісту паличкоядерних форм.

Висновки

Процеси вільнорадикального окислення в спермі здорових людей характеризуються стабільним рівнем активності, що необхідно для нормального протікання процесів, пов'язаних зі здійсненням репродуктивної функції.

Кількісні і якісні характеристики сперми молодих здорових чоловіків, що проживають у різних регіонах України, різні. Найнижчі показники концентрації і рухливості сперматозоїдів, а також мала кількість сперматозоїдів з нормальною структурою зареєстровані у робочих-вахтовиків ЧАЕС. У групі киян ці показники знаходяться в межах норми ВООЗ, однак вірогідно нижче, ніж у молодих чоловіків, що проживають у Львові.

Зниження концентрації і рухливості сперматозоїдів, порушення їх структури супроводжуються підвищенням інтенсивності вільнорадикального окислення в суцільній спермі і її фракціях. Найвищий рівень негативної кореляції спостерігається між рухливістю сперматозоїдів і інтенсивністю хемілюмінесценції спермальної плазми.

Показники хемілюмінесценції плазми крові, концентрації гідроперекисів, дієнових коньюгатів та малонового диальдегіда у працівників ЧАЕС значно підвищені в порівнянні з київською і львівською групами, інтенсивність СРО в крові киян вища, ніж у жителів Львова.

Підвищений рівень хемілюмінесценції крові і концентрації продуктів ПОЛ в ній позитивно корелює з інтенсивністю хемілюмінесценції спермальної плазми.

Показники хемілюмінесценції плазми крові, концентрації гідроперекисів, дієнових коньюгатів і малонового диальдегіда в крові осіб з олігозооспермією не змінені в порівнянні з аналогічними показниками в жителів Львова і не відповідають високому рівню ВРО в спермі.

В лейкоцитах крові працівників ЧАЕС і киян активність кисеньгенеруючих ферментів (НАДФ⁺ -оксидаза і мієлопероксидаза) підвищена в порівнянні з такими у жителів м. Львова, що супроводжується змінами лейкоцитарної формули у бік зниження кількості иейтрофілів і підвищенням концентрації лімфоцитів.

Двотижневий курс гіпоксичного тренування у працівників ЧАЕС і жителів Києва призводив до нормалізації лейкоцитарної формули, поліпшення показників вільнорадикального окислення в крові та активації еритроцитарної СОД, підвищенню рухливості сперматозоїдів на фоні зниження хемілюмінесценції спермальної плазми. Інтервальну гіпокситерапию доцільно застосовувати для корекції вільнорадикальных процесів у крові і спермі людини.

Перелік публікацій за темою дисертації

1. Серебровська З.О., Денисенко Г.Т., Серебровська Т.В. Вплив нових метаболічних препаратів рикавиту та мілдоронату на параметри кослотно-основного стану крові людини при гіпоксії. Фізіол. журн., 1992, т.38, №1, с.26-31.

2. Serebrovskaya T.V., Serebrovskaya Z.A., Afonina G., Minyailenko T. Effect of intermittent hypoxic training on human respiration, free radical prosses and immune system In: High Altitude Medicine , ed by G.Ueda et al. Matsumoto, Shinshu University Press, 1992, p.77-82.

3. Серебровская З.А., Серебровская Т.В., Афонина Г.Б. О взаимосвязи между состоянием свободнорадикальных процессов и иммунологической реактивности человека при гипоксической тренировке. - В кн.: Интервальная гипоксическая тренировка, эффективность, механизмы действия. Киев, КГИ ФК, 1992, с.81-83.

4. Serebrovskaya T.W., MankovskayaI.N., Serebrovskaya Z.A., Oberenko O.A., Belinskaya I.V. The effect of intermittent hypoxic exposure on free-radical processes and antibacterial system defence in bronchial asthma. J. Hypoxia Medical, 1994, N2, p.64.

5. Mankovskaya I., Serebrovskaya T., Serebrovskaya Z., Moshchich V. Effect of intermittent hypoxia on free-radical processes and antioxidant status in patients with bronchial asthma.// Int. Conf. on Clinical Chemiluminescense, Berlin, 1994, Abstr. P-C21.

6. Serebrovskaya T., Mankovskaya I., Serebrovskaya Z., Afonina G. Relationship between blood serum chemiluminescense and functional activity of leucocytes in humans under hypoxic training. // Int. Conf. on Clinical Chemiluminescense, Berlin, 1994, Abstr. P-027.

7. Serebrovskaya T., Mankovskaya I., Serebrovskaya Z., Oberenko O. Sоme mechanisms of intermittent hypoxic influences upon human respiration, free radical processes and antibacterial defence system.// II Conf. of Patophysiol., Kyoto, Japan, 1994.

8. Serebrovskaya T., Swanson R.J., Mankovskaya I., Serebrovskaya Z., Moshchich V., Oberenko O. Training with intermittent hypoxia (HT) influences free radical processes and glutathione antioxidant system enzymes in bronchial asthma patients. Int.Cong."Interasma 95", Poznan, Poland, 30.08-02.09.1995, p.

9. Serebrovskaya T.V., Serebrovskaya Z.A., Oberenko O. and Belinskaya I. Intermittent hypoxic training and the individual response of respiration and free radical processes. The Ninth International Hypoxia Symposium, Lake Louise, Canada, Feb.14-18, 1995,

10. Серебровская З.А., Серебровская Т.В., Афонина Г.Б. Хемилюминесценция, перекисное окисление липидов крови и активность нейтрофилов при гипоксической тренировке у лиц, подвергшихся воздействию ионизирующего излучения // Радиац. биол. Радиоэкология.- 1996. - N3, с. 394-399.

11. Mankovskaya I., Serebrovskaya T., Serebrovskaya Z., Bystryukov V., Swanson R.J. Mechanisms of Taurine action during hypoxia . Int. Congr. of Experimental Biology, Rockvillepike, Bethesda, MD. USA, April 1996.

12. Serebrovskaya Z., Swanson R.J., Serebrovskaya T., Belinskaya I., Taylor S.L., Boyko N., Dobrovolskaya L., Gorpinchenko I., Coddington C.C. Sperm function and сhemiluminescence of seminal plasma and spermatozoa in Ukrainian men exposed to long-term, low-dose chernobyl radiation. II Int. Conf. on Clinical Chemiluminescence. Berlin, April 27-30, 1996,P.-26A.

13. T.V.Serebrovskaya,R.J.Swanson,Z.A.Serebrovskaya,O.Appenzeller.Intermittent hypoxia alters hypoxic ventilatory responses (HVR). 10th Biennial Int.Symp. on Hypoxia and Mountain Medicine,Feb.18-22, 1997, Lake Louise, Canada, Abstr.49,p.25.

14. Bernardi L., C.Passino, Z.Serebrovskaya, O.Appenzeller, T.Serebrovskaya. Autonomic changes during progressive hypoxia: effect of interval hypoxic training. 10th Biennial Int.Symp. on Hypoxia and Mountain Medicine, Feb.18-22,1997, Lake Louise, Canada, Abstr.52, p.

15. T.V.Serebrovskaya,R.J.Swanson,Z.A.Serebrovskaya,O.Appenzeller.Intermittent hypoxia alters hypoxic ventilatory responses (HVR).10th Biennial Int.Symp. on Hypoxia and Mountain Medicine,Feb.18-22,1997, Lake Louise, Canada, Abstr.49,p.25.

16. R.J.Swanson, T.Serebrovskaya, I.Gorpinchenko, N.Boyko, L.Dobrovolskaya, S.L.Taylor, Z.Serebrovskaya, I.Belynskaya, L.Vojteh. Biochemical, respiratory and reproductive evaluation of Ukrainian men eight year post-Chernobyl atomic power station catastrophe// World Intermediate Congress of Clinical and Experimental Pathophysiology, Sofia, 30 May- 1 June 1997, Abstracts, p.25.

17. Маньковська І.М., Серебровська З.О. Роль кисневих радикалів у фізіології та патології сперми людини. Фізіол.журн., 1998, т.44, № 5-6, с. 118-125.

18. TV Serebrovskaya, RJ Swanson, IN Karaban, ZA Serebrovskaya, EE Kolesnikova. Intermittent hypoxia alters hypoxic ventilatory responses. Фізіологічний журн., 1999, т.45, № 5, с. 9-19.

19. Горпинченко І.І., Бойко М.І., Свенсон Р.Дж., Серебровська Т.В., Серебровська З.О., Добровольська Л.І., Трифонова Ю.П. Показники спермограми чоловіків, які проживали в районах різної віддаленності від Чорнобильської АЕС. Урология, 1999, №4, с. 68-74.

20. З.А.Серебровська, І.М.Маньковська, М.І.Бойко, Л.І.Добровольська. Вільнорадикальні процеси в спермі людини після аварії на ЧАЕС. Ш з'їзд Українського тавориства патофізіологів. Одеса, 2000, с.

Анотації

Серебровська З.О. Особливості вільнорадикальних процесів у спермі і крові людини при зміні морфофункціональних характеристик сперми.- Рукопис

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 03.00.13 - фізіологія людини і тварин Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця НАН України, Національний медичний університет ім. О.О.Богомольця, Київ -2000.

В сперме и крови человека при различных морфофункциональных характеристиках спермы, возможности коррекции нарушений СРО, а также функциональных биохимических и морфологических показателей спермы и крови с помощью периодических гипоксических воздействий.

Робота присвячена вивченню особливостей вільнорадикального окислення (ВРО) в спермі та крові людини при різних морфофункціональних характеристиках сперми, можливостей корекції порушень ВРО, а також функціональних біохімічних та морфологічних показаників сперми і крові за допомогою періодичних гіпоксичних впливів. Показано, що процеси ВРО в спермі здорових людей характеризуються стабільним рівнем активності, що є необхідною умовою нормального протікання процесів, пов'язаних з репродуктивною функцією. Вперше виявлено різницю по морфологічним і функціональним показникам сперми між чоловіками, що працюють на ЧАЕС, мешканцями Києва і Львова. Відмічено, що зниження концентрації і рухливості сперматозоідів як у випадку безпліддя, так і під впливом екологічних факторів, супроводжується підвищенням інтенсивності ВРО в суцільній спермі та її фракціях. При цьому найвищий рівень від'ємної кореляції спостерігається між концентрацією рухливих сперматозоїдів та інтенсивністю хемілюмінесценції (ХЛ) спермальної плазми.

Отримано нові дані про зв'язок між інтенсивністю процесів ВРО в крові та спермі людини. Показано, що підвищений рівень ХЛ і концентрації продуктів перекисного окислення в крові позитивно корелює з ХЛ спермальної плазми. В роботі вперше показано, що курс періодичної гіпоксії у працівників ЧАЕС та у мешканців Києва призводив до зниження рівня ВРО крові, а також до позитивних змін показників сперми.

Ключові слова: вільнорадикальне окислення, сперматозоїди, кров, гіпокситерапія.

Серебровская З. А. Особенности свободнорадикальных процессов в сперме и крови человека при изменении морфофункциональных характеристик спермы.- Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 030013 - физиология человека и животных.- Институт физиологии им. А.А.Богомольца НАН Украины, Национальный медицинский университет им. А.А.Богомольца, Киев. 2000.

Работа посвящена исследованию особенностей свободнорадикального окисления (СРО) в сперме и крови человека при различных морфофункциональных характеристиках спермы, возможности коррекции нарушений СРО, а также функциональных биохимических и морфологических показателей спермы и крови с помощью периодических гипоксических воздействий.

Исследовались четыре группы мужчин в возрасте 20-37 лет: рабочие - вахтовики ЧАЭС, лица с клиническими и лабораторными признаками нарушения сперматогенеза, а также здоровые жители городов Киева и Львова. Изучались морфофункциональные характеристики спермы, интенсивность СРО в сперме и крови, количественные и качественные характеристики лимфоцитов крови.

В результате проведенного исследования спермы у лиц вышеуказанных групп нами было обнаружено, что самые низкие показатели концентрации и подвижности сперматозоидов, а также относительно небольшое количество сперматозоидов с нормальной структурой зарегистрированы у рабочих-вахтовиков ЧАЭС. В группе киевлян эти показатели были в пределах нормы ВОЗ, однако достоверно ниже, чем у молодых мужчин, проживающих во Львове. По содержанию сперматозоидов с нормальной структурой самая неблагоприятная картина обнаружена в группе больных олигозооспермией. В группе рабочих ЧАЭС этот показатель был также достоверно ниже, чем в группах львовян и киевлян, а в группе киевлян - достоверно ниже, чем у жителей Львова. Таким образом, морфофункциональные характеристики спермы у работников ЧАЭС, лиц с олигозооспермией и в меньшей степени - у киевлян снижены относительно аналогичных показателей у лиц львовской группы.

Результаты исследования свободнорадикальных процессов в сперме показали, что снижение концентрации и подвижности сперматозоидов, нарушение их структуры сопровождаются повышением интенсивности свободнорадикального окисления в цельной сперме и ее фракциях. Самые значительные различия между группами отмечались нами по показателю хемилюминесценции (ХЛ) сперматозоидов. Корреляционный анализ показал наличие достоверной отрицательной корреляционной связи между подвижностью сперматозоидов и уровнем их ХЛ (r = - 0,48 (р< 0.01). По данным литературы, возможными источниками повышения СРО в сперме могут быть аномальные сперматозоиды и лейкоциты. В наших исследованиях не установлено корреляции между концентрацией аномальных клеток и интенсивностью ХЛ цельной спермы, спермальной плазмы и сперматозоидов. Вместе с тем, концентрация лейкоцитов в сперме у лиц различных групп была практически одинаковой и находилась в пределах нормы. Поэтому мы не можем утверждать, что источником свободнорадикального окисления в сперме служат только аномальные сперматозоиды или лейкоциты. Остается предположить, что эти различия частично обусловлены активацией синтеза свободных радикалов сперматозоидами с сохраненной структурой.

У лиц с выявленным снижением морфофункциональных характеристик спермы, сопровождающимся активацией свободнорадикальных процессов в спермальной плазме и сперматозоидах, зарегистрирована активация СРО крови. Интенсивность инициированной ХЛ сыворотки крови в группе рабочих ЧАЭС была достоверно (на 23%) выше инициированной ХЛ сыовротки крови у жителей Львова и выше, чем у лиц с олигозооспермией. Уровень диеновых коньюгатов и гидроперекисей в группе рабочих ЧАЭС был в 2,5 раза выше, чем в группе львовян и достоверно выше чем в группе лиц с олигозооспермией. Изменения активности СРО крови сопровождались достоверным повышением активности антиоксидантных ферментов - эритроцитарной СОД и каталазы. Содержание лейкоцитов в крови обследованных лиц находилось в пределах нормы и существенно не различалось у представителей разных групп, в то время как показатели лейкоцитарной формулы у чернобыльцев и киевлян были изменены относительно львовской группы (наблюдалось снижение концентрации нейтрофилов и повышение концентрации лимфоцитов).

Во всех обследованных группах нами выявлена положительная корреляция между интенсивностью ХЛ сыворотки крови, концентрацией диеновых коньюгатов и гидроперекисей, с одной стороны, и интенсивностью ХЛ спермальной плазмы, с другой. Возможно, что одним из источников интенсификации СРО в спермальной плазме является переход в нее гидроперекисей из плазмы крови.

Проведение двухнедельного курса гипоксической тренировки (метод нормобарической изокапнической нарастающей гипоксии, 3 раза в день с перерывами в 15 минут) привело к достоверному повышению (на 22%) относительного содержания подвижных сперматозоидов в сперме. Показатели интенсивности свободнорадикальных процессов в сперме под влиянием гипоксической тренировки существенно не изменялись, за исключением достоверного снижения хемилюминисценции (на 20% ) и пика ХЛ (29%) цельной спермы. Более выраженные изменения наблюдались в крови. Гипоксическая тренировка привела к достоверному повышению относительного содержания нейтрофилов в крови (на11% ) и увеличению активности кислородгенерирующих ферментов. Светосумма инициированной хемилюминисценции сыворотки крови снизилась на 14%, пик ХЛ уменьшился на 21% и концентрация МДА - на 19%. Наблюдалось выраженное увеличение активности эритроцитарной СОД (на 42%) при недостоверных изменениях активности каталазы.

Таким образом, в настоящей работе показано, что снижение морфофункциональных характеристик спермы сопровождается активацией СРО в сперматозоидах и спермальной плазме. У лиц, проживающих в экологически наблагоприятных условиях, снижение качества спермы и интенсификация свободнорадикальных процессов в ней сопровожнается активацией СРО в крови.Эти сдвиги частично нормализуются под влиянием гипоксической тренировки.

Ключевые слова: свободнорадикальное окисление, сперматозоиды, кровь, гипокситерапия

Serebrovskaya Z. A. Free radical processes in human blood and sperm under different morphological and functional sperm characteristics. - Manuscript.

Thesis for the scientific degree of Candidate of Biological Sciences in specialty 03.00.13 - Human and Animal Physiology. - Bogomoletz Institute of Physiology of the NAS of Ukraine, National Medical University, Kiev, 2000.

Normal sperm hyperactivation and capacitation are accompanied by free radical production. Previous researches suggest that abnormal spermatozoa produce reactive oxygen species (ROS) in high amount and the increased level of ROS inhibits normal sperm function. The mechanism of the physiological role for ROS production by either normal or abnormal sperm is unknown. The purpose was to investigate free radical production in sperm samples with different concentration, motility and morphological characteristics. Sixty-nine healthy men and 18 patients with clinical and laboratory signs of infertility were studied. Subjects ranged in age from 20-37 years and came from regions with different ecological environments. Subjects were divided into 4 groups. Group 1: 10 Chernobyl Power Station workers; Group 2: 18 patients with secretory infertility; Group 3: 22 healthy men from Kiev (90 km from Chernobyl); Group 4: 37 healthy men from L'viv (600 km from Chernobyl). The ejaculate volume, pH, total sample sperm count, sperm concentration per milliliter, sperm motility and morphology, SOD and catalase activity in erythrocytes, and TBA-active product concentration in whole blood were investigated. ROS production in whole sperm, seminal plasma, spermatozoa suspension and blood serum was studied using spontaneous as well as hydrogen peroxide-initiated chemiluminescence. The therapeutic effect of intermittent hypoxia (15-day course) on sperm characteristics and ROS production in blood and sperm were studied.

Sperm concentration in the Chernobyl group was lower than in the L'viv and Kiev groups by 64% and 50%, respectively. Sperm motility in the Chernobyl group was lower than in the L'viv and Kiev groups by 48% and 34%, respectively. The lowest total sperm count and lowest normal sperm concentration was reported in the infertile patient group. A high ROS level accompanied the sperm quality decrease. The biggest difference observed was in the chemiluminescence of spermatozoa. The highest level of ROS production was registered in the samples with the lowest motility (r = 0.48, p<0.01). There was no difference in leukocyte concentration between the different groups. There was no correlation between the concentration of abnormal spermatozoa and sperm chemiluminescence. Most likely the source of high ROS production in sperm with low quality was spermatozoa with decreased motility. There was a positive correlation between the chemiluminescence of blood serum and seminal plasma. The intermittent hypoxia course had a small positive influence on the sperm chemiluminescence and motility.

Key words: Free radical oxidation, spermatozoa morphology and function, blood, intermittent hypoxia.

Размещено на Allbest.ru