Трансплантация клеток эмбриональной печени и стволовых клеток костного мозга для коррекции дислипидемии и ранних стадий атерогенеза

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Автореферат

диссертации на соискание ученой степени

кандидата медицинских наук

Трансплантация клеток эмбриональной печени и стволовых клеток костного мозга для коррекции дислипидемии и ранних стадий атерогенеза

Берсенёв Алексей Вячеславович

1. Актуальность темы исследования

трансплантация стволовой клетка

Aтеросклероз является одной из наиболее частых причин временной нетрудоспособности, инвалидизации и гибели населения. Это заболевание развивается медленно, поражает сосуды эластического и мышечно-эластического типа и, прежде всего, аорту, артерии сердца и головного мозга. По данным ВОЗ (2002 год) такие осложнения атеросклероза, как ишемическая болезнь сердца (ИБС), головного мозга и других органов на протяжении многих десятков лет уверенно лидируют среди других заболеваний в структуре смертности населения (до 50-60%) во всём мире. До ј больных умирают внезапно при первых проявлениях ИБС.

Указанная ситуация сохраняется во всех промышленно развитых странах, несмотря на совершенствование терапевтических (медикаментозных) [Джанашия ПХ, 1998; Аронов ДМ, 2000; Робинс Д, 2001; Шевченко ОП, 2003] и эфферентных [Малышев ПП, 1997; Чебышев АН, 2000; Bambauer R., 2002] методов лечения, используемых, в основном, для повышения клиренса холестерина (ХС) и атерогенных липопротеидов (ЛП), а также несмотря на применение инвазивных хирургических методов, которые лишь локально восстанавливают кровоток в поражённом органе, являясь методом лечения осложнений [Савельев ВС. и соавт., 1999]. Таким образом, в настоящее время до сих пор не существует эффективных методов предупреждения и лечения атеросклероза и потому негативные социальные и экономические последствия этого заболевания по-прежнему велики.

Развитие трансплантологии, патофизиологии, с одной стороны, и биотехнологии, молекулярной и клеточной биологии, а также генетики - с другой сделало клетку не только объектом, но и средством лечения многих заболеваний. Так эмбриональные островковые клетки поджелудочной железы стали использоваться для лечения сахарного диабета [Шумаков ВИ, и соавт., 1995], нервные клетки из тканей эмбрионального мозга для лечения болезни Паркинсона и других нейродегенеративных заболеваний ЦНС [Lindvall O., et al. 1989, 1997, 1998], при острой и хронической печёночной недостаточности исследуется возможность экстракорпорального подключения ксеногепатоцитов и спленоцитов [Корухов НЮ, 1989; Онищенко НА и соавт.1997-1999] и др. Развитие учения о стволовых клетках в последние годы поистине революционизировало медицину. Так, в кардиологии уже стали исследоваться возможности трансплантации мезенхимальных стволовых клеток костного мозга для стимуляции неоангиогенеза у больных острым инфарктом миокарда [Tomita S, et al. 1999; Wang JS, et al., 2000]. Между тем, возможности клеточных технологий в лечении дислипидемий и атеросклероза остаются малоизученными и нереализованными.

В последние годы для повышения эффективности лечения дислипидемий и атеросклероза началось изучение возможностей метода клеточной терапии [Boisvert WA, et al. 1995, 1997; Gunsalus JR, et al. 1997; Курильская ТЕ 1999], действие которой, как полагают, направлено на нормализацию липидного обмена путём восстановления нарушенных функции тех органов и систем, которые обеспечивают адекватную регуляцию метаболизма липидов. По современным представлениям в патогенезе дислипидемий и атеросклероза определяющая роль принадлежит нарушению липорегуляторных функций печени [Goldstein JL, et al., 1987; Косых ВА., и соавт., 1989; Климов АН., 1995; ], а также развитию дислипидогенной микроангиопатии [Клименко ЕД., 1994; Поздняков ОМ, Кобозева ЛП, 2001], и дислипидогенной дисфункции клеток моноцитарно-макрафогального и лимфоидного ряда [Панин ЛЕ, и соавт. 1991; Усынин ИФ, и соавт., 1993; Boisvert WA, et al., 1997; Linton MF, et al., 1999], иммунной системы больного [Нагорнев ВА, 1996, 2000; Титов ВН, 1999].

Очевидно, руководствуясь этими представлениями, при коррекции дислипидемий и атеросклероза стали исследовать регуляторные возможности трансплантации аллогенных и ксеногенных гепатоцитов [Tejera ML et al., 1992; Gunsalus JR, et al. 1997], аллогенного, сингенного и ген-модифицированного костного мозга [Fazio S, et al. 1997; Boisvert WA, et al. 1997, 1999; Herijgers N, et al. 1997, 2000] и фетальных тканей человека (печени, сердца, плаценты) [Курильская ТЕ 1999; Никифоров СБ, 2000].

Несмотря на начавшееся изучение возможностей метода клеточной терапии, остаётся нерешённым ряд принципиальных вопросов и это тормозит дальнейшее внедрение метода в клиническую практику.

В частности юридические и правовые ограничения использования фетальных тканей требуют обоснования возможности использования других источников клеточного материала. Отсутствие ограничений на использование аутологичного костного мозга взрослых людей требует, однако, исследования его биорегуляторной активности, а также проведения сравнительного изучения эффективности влияния аутологичного костного мозга и фетальной печени на нормализацию показателей, нарушенных в условиях дислипидемии и атеросклероза. В литературе отсутствуют данные о влиянии клеточной терапии на состояние микрососудистого русла, наиболее рано реагирующего на нарушения липидного обмена, и на состояние клеток моноцитарно-макрофагального и лимфоцитарного ряда, участвующих в патогенеза атеросклероза, и нарушений липидного обмена; неясным остаётся сам механизм лечебного действия используемых клеток на состояние липидного обмена в организме. Отсутствие ответов на перечисленные вопросы позволило сформулировать цель и задачи настоящего исследования.

Целью настоящего исследования явилось разработка адекватного метода клеточной терапии ранних стадий атерогенеза путём сравнительного изучения трансплантации клеток аллогенной эмбриональной печени и стволовых клеток костного мозга.

Для достижения цели были поставлены следующие задачи:

1. Воспроизведение модели алиментарной дислипидеми и ранних проявлений атеросклероза на мелких лабораторных животных (морских свинках) для изучения терапевтических эффектов клеточной трансплантации.

2. Отработка методов выделения и подготовки клеток эмбриональной печени и клеток костного мозга взрослых животных для трансплантации.

3. Изучение эффективности коррекции тяжёлых проявлений дислипидемии и жировой дистрофии печени у животных на фоне продолжающейся атерогенной диеты и трансплантации аллоклеток эмбриональной печени и аутологичных стволовых клеток костного мозга.

4. Оценка состояния микроциркуляторного русла на фоне атерогенной диеты и после трансплантации клеток аллогенной эмбриональной печени и аутологичных стволовых клеток костного мозга.

5. Выявление морфологических изменений в селезёнке, возникающих на фоне атерогенной диеты и после трансплантации клеток аллогенной эмбриональной печени и аутологичных стволовых клеток костного мозга.

6. Выработать рекомендации по применению метода клеточной трансплантации для коррекции проявлений дислипидемии и атеросклероза.

Научная новизна работы.

Впервые на модели хронической дислипидемии и раннего атеросклероза у морских свинок проведено сравнительное изучение эффективности коррекции возникающих в организме нарушений, осуществляемой путём трансплантации взвеси свежевыделенных аллогенных клеток эмбриональной печени и взвеси прекультивированных стволовых клеток аутологичного костного мозга.

Впервые показано, что для коррекции дислипидемии и ранних проявлений атерогенеза более предпочтительна аутотрансплантация стволовых клеток костного мозга, т.к. уже через 2 месяца после трансплантации этих клеток на фоне продолжающейся атерогенной диеты происходило достоверное снижение индекса атерогенности сыворотки крови более чем в 2 раза и наступало более выраженное купирование изменений в микроциркуляторном русле.

Новыми являются данные о том, что трансплантация клеток аллогенной эмбриональной печени так же, как трансплантация аутологичных стволовых клеток костного мозга, ослабляет выраженность жировой дистрофии печени и снижает степень депрессии иммунной активности селезёнки (по морфологическим показателям), индуцированной атерогенной диетой.

Высказано предположение, что менее выраженный эффект терапии атеросклероза аллогенными клетками эмбриональной печени может быть обусловлен ранней гибелью этих клеток в условиях активации иммунной системы реципиента.

Теоретическая и практическая значимость работы.

Отработана модель алиментарной дислипидемии и раннего атеросклероза у мелких лабораторных животных - морских свинок, которая позволяет объективно оценивать возможности новых методов терапии, в том числе метода клеточной трансплантации.

Подтверждено положение о том, что микроциркуляторные нарушения возникают уже на ранних стадиях дислипидемии и атерогенеза, и поэтому контроль состояния микроциркуляторного русла позволяет объективно оценивать терапевтические возможности предлагаемых методов.

Отработана методика выделения и прекультивирования аутологичных стволовых клеток костного мозга, а также методика выделения эмбриональных клеток печени, что позволяет оптимизировать технологию заготовки клеток для трансплантационной терапии дислипидемии и атеросклероза.

Выявлены преимущества использования аутологичных стволовых клеток костного мозга для коррекции нарушений, сопровождающих развитие дислипидемии и атеросклероза по сравнению с использованием аллогенных эмбриональных клеток печени.

Впервые рекомендовано использовать взвесь прекультивированных аутологичных стволовых клеток костного мозга для коррекции хронических нарушений липидного обмена. Материалы диссертации могут быть использованы для разработки в клинике методов клеточной терапии дислипидемии и атеросклероза.

ПОЛОЖЕНИЯ, ВЫНОСИМЫЕ НА ЗАЩИТУ.

1. Воспроизведённая на морских свинках модель дислипидемии и раннего атеросклероза является адекватной моделью для испытания новых методов лечения нарушений липидного обмена, в том числе и метода клеточной терапии.

2. Атерогенная диета приводит к раннему развитию дислипидогенной микроангиопатии, которая корригируется трансплантацией взвеси свежевыделенных аллогенных эмбриональных клеток печени и взвеси прекультивированных аутологичных стволовых клеток костного мозга.

3. Трансплантация стволовых клеток костного мозга является более эффективным и более предпочтительным способом коррекции дислипидемии и раннего атеросклероза.

АПРОБАЦИЯ ДИССЕРТАЦИИ. Основные положения диссертации доложены на:

1. Научной конференции «Новые оперативные технологии», посвященной 75-летию Кирпатовского И.Д. Москва, июнь, 2002 г.

2. II Всероссийском съезде по трансплантологии и искусственным органам. Москва, октябрь, 2002 г.

3. Первой Всероссийской конференции «Стволовые клетки и перспективы их использования в здравоохранении» Москва, 22 мая 2003 г.

4. Объединенной межлабораторной конференции НИИ Трансплантогогии и искусственных органов МЗ РФ и НИИ Общей патологии и патофизиологии РАМН. Москва, июнь, 2003 г.

ПУБЛИКАЦИИ. По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ, из них 5 - в центральной печати и 1 за рубежом.

ОБЪЁМ И СТРУКТУРА РАБОТЫ. Диссертационная работа состоит из введения, 4 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка использованной литературы.

Текст изложен на страницах машинописного текста, иллюстрирован 7 таблицами и 12 рисунками. Библиография включает источников, из них отечественных и иностранных.

2.Содержание работы

Общая характеристика экспериментального материала и методов исследования.

Для решения поставленных задач работа проводилась по 2-м основным направлениям - по пути отработки техники хронических экспериментов (отработка модели хронической дислипидемии (ДЛП) и раннего атерогенеза, отработка техники выделения клеток и приготовления клеточных культур, отработка способа трансплантации клеток) и по пути исследования возможностей терапии хронической дислипидемии и ранних проявлений атеросклероза с помощью трансплантации клеток: аллогенных клеток эмбриональной печени (КЭП) и аутологичных стволовых клеток костного мозга (СККМ).

В таблице 1 представлен перечень серий и групп экспериментов по двум основным разделам работы и общее количество использованных в экспериментах животных.

Таблица 1. Распределение экспериментальных животных по группам при выполнении основных разделов работы.

Раздел работы	Название серий экспериментов	Группы опытов	Количество животных (морских свинок)
			самцы	беременные самки
I. Отработка техники выполнения эксперимента	1.отработка экспериментальной модели хронической ДЛП и ранних проявления атеросклероза	стандартный - интактные (норма)	15	-
		получение атерогенной диеты	30	-
		получение молочной диеты (группа контроля)	30	-
	2. отработка технологии (протокола) выделения клеток и приготовления клеточных культур	получение клеток из эмбриональной печени	-	6
		получение стволовых клеток костного мозга	6	-
	3. отработка оптимального способа трансплантации клеток	внутрипортально	3	-
		внутривенно	6	-
		внутрисердечно	6	-
		внутриселезёночно	6	-
II. Исследование возможностей клеточной терапии	4. коррекция ДЛЕ и раннего атерогенеза трансплантацией (внутриселезёночно) КЭП	АТД+КЭП	20	6
		АТД+физ. р-р (контроль I)	16	-
		МД+КЭП (контрольII)	16	4
	5. коррекция ДЛЕ и раннего атерогенеза трансплантацией (внутриселезёночно) СККМ	АТД+СККМ	20	-
		АТД+физ. р-р (контроль I)	16	-
		МД+СККМ (контрольII)	16	-

Всего: 222 206 16

АТД - атерогенная диета, МД - молочная диета, КЭП - клетки эмбриональной печени, СККМ - стволовые клетки костного мозга

Работа выполнена на беспородных морских свинках, общим количеством 222 голов, из них 206 самцов массой 300-400 г. в возрасте не менее 4 месяцев и 16 беременных самок (6-7 недель гестации) массой 400-500 г. в возрасте 5-10 месяцев. Все животные содержались в пластмассово-металлических клетках по 2-5 животных в каждой в циклически освещаемой комнате и имели свободный доступ к пище и воде. Максимальная длительность эксперимента составляла 6 месяцев.

Контроль терапевтической эффективности клеточных трансплантаций при ДЛП и ранних стадиях атерогенеза оценивали с помощью биохимических, морфометрических и морфологических методов исследования.

Биохимические показатели липидного обмена - общего холестерина (ХС), ХС липопротеидов низкой, очень низкой и высокой плотностей (ЛПНП, ЛПОНП, ЛПВП), триглицеридов (ТГ) исследовали в сыворотке крови, полученной пункцией сердца под эфирным наркозом. Содержание общего ХС и ТГ в сыворотке крови определяли на автоанализаторе “Airone 200” (“Crony Instruments”, Италия), ферментативным методом с помощью комбинированных диагностических наборов фирмы “Biocon” (Германия). Содержание ХС ЛПВП в сыворотке определяли также, как содержание общего ХС в супернатанте, после осаждения из сыворотки ЛП низких плотностей смесью 12 ммоль/л фосфовольфрамата Na и 0.5 ммоль/л хлорида Mg. Суммарную фракцию ХС (ЛПНП и ЛОНП) вычисляли из разницы концентраций общего ХС и ХС ЛПВП. Индекс атерогенности (ИА) рассчитывали как отношение суммарной концентрации ХС (ЛПНП+ЛПОНП) к ХС (ЛПВП). Стандартизацию и контроль качества лабораторных исследований проводили в соответствии с требованиями Федеральной системы внешней оценки качества клинических лабораторных исследований (ФСВОК).

Для морфологических исследований кусочки печени, сердца, селезёнки и брыжейку тонкой кишки фиксировали в 10% формалине. Аорту препарировали от бифуркации до левого желудочка, затем разрезали вдоль, отделяли от сердца и фиксировали в расправленном виде в 10% формалине. Морфологические изменения в печени и аорте изучали на криосрезах, окрашенных на жир по Гольдману. При окраске макропрепаратов аорты на жир использовали судан IV.

Состояние МЦР оценивали на тотальных плёночных препаратах брыжейки тонкой кишки, импрегнированной азотнокислым серебром (по Куприянову В.В., 1975). Морфометрию микрососудов проводили на полуавтоматической системе анализа изображения “Leitz-ASM” (Германия).

Статистическую оценку результатов проведённых исследований производили с использованием методов вариационной статистики. Статистический анализ проводился в программе Exel. Для сравнения количественных показателей использовали двухвыборочный t-критерий Стьюдента с поправкой Бонферрони для множественных сравнений с контрольной группой. Межгрупповые отличия считались достоверными при p<0.05.

Для создания модели хронической ДЛП и ранних стадий атерогенеза животные ежедневно получали атерогенную диету (АТД) - суспензию ХС (ultra pure grade - “Amresco” США) в молоке (жирность 3.2%) внутрь из расчёта 0.1 г/100 г. веса животного в сутки в течение 6 месяцев. Животные в группах контроля получали молочную диету - свежее цельное молоко (жирность 3.2%) аналогичным способом или находились на стандартной диете вивария в течение 6 мес.

Для трансплантации клеток морским свинкам, с целью коррекции ДЛП и ранних проявлений атерогенеза, использовали свежевыделенные КЭП и культивированные аутологичные СККМ.

1. Клетки эмбриональной печени получали из печени эмбрионов, асептически изъятых под эфирным наркозом у беременных самок. Стерильно изъятую печень погружали в холодный (+4С) раствор Эрла (EBSS) с гентамицином (50 мкг/мл). Печень механически измельчали скальпелем и/или ножницами в том же растворе. Кусочки собирали пипеткой в центрифужную пробирку и отмывали несколько раз от крови холодным (+4С) раствором Хэнкса без кальция и магния (HBSS-CMF) с последовательным центрифугированием 1 мин. при 500 об/мин. После аспирации надосадка добавляли тёплый (+37С) стерильный раствор коллагеназы (0.05% раствор коллагеназы (Gibco Biocult, USA) на HBSS. Производили последовательную 2-х этапную коллегенизацию при (+37С) на шейкере 5-20 мин. (в зависимости от возраста печени). После коллагенизации центрифугировали 1мин при 500 об/мин. (+4С), надосадок аспирировали. В осадок добавляли холодную среду MEM или DMEM с 3% фетальной телячьей сывороткой. Осадок со средой выливали на стерильное нейлоновое сито, опущенное в чашку Петри. Продавливали клеточную массу в чашку со средой, нежно растирая ферментативно переваренную ткань печени через сито поршнем от шприца. Затем осуществляли промывку от коллагеназы этой же холодной средой с последовательным центрифугированием.

После выделения под микроскопом клеточный состав КЭП был представлен: гепатоциты и их предшественники (гепатобласты) - до 60%, гемопоэтические клетки (в том числе макрофаги) - до 30%, остальные (непаренхиматозные клетки) - до 10%. Терапевтическую дозу КЭП - 20 млн. клеток получали из печени 1 эмбриона.

2. Стволовые клетки получали из костного мозга животных за 1 неделю до трансплантации. Под эфирным наркозом получали клеточный аспират из большеберцовой кости с промыванием её полости забуференным физиологическим раствором (ЗФР), содержащим гепарин и гентамицин, объемом 0,5 мл. с помощью иглы 16G, насаженной на шприц. После центрифугирования суспензии клеток, осадок ресуспендировали в лизирующем растворе (содержащем хлорид аммония) при комнатной t?. Гемолизированный супернатант, после осаждения, полностью удаляли отсасыванием, а клеточный осадок ресуспендировали в ростовой среде IMDM (Gibco, Grand Island), содержащей 10% бычьей эмбриональной сыворотки (HyClone, USA), инсулин 0.4 мкм, дексаметазон 10 нм, гентамицин 50 мкг/мл, основной фактор роста фибробластов (Sigma, USA) 20 нг/мл, инсулиноподобный фактор роста (Sigma, USA) 20 нг/мл. Клетки культивировали 1,5-2,0 млн. кл/мл на чашках Петри d=30 мм или в 6-ти луночных плашках (Costar, USA) при +37.0єС в СО₂-инкубаторе, атмосфере с 5% СО₂ и 95% влажности 7 суток, с однократной сменой среды на 3-е сутки.

Через неделю, под микроскопом, культура имела следующий вид (клеточный состав): до 50% прикрепившихся, распластанных фибробластоподобных клеток (стромальные стволовые клетки) и до 50% свободно плавающих в суспензии, округлых, неприкрепившихся клеток (гемопоэтические клетки, лимфоциты, моноциты).

Протокол трансплантации: КЭП трансплантировали сразу после выделения. Культуру СККМ для трансплантации снимали с культуральной посуды тёплым (+37С) раствором трипсина с версеном (1:4), после 2-х кратной промывки культуры растворами версена и HBSS-CMF. После этого собирали клетки в пробирку со средой DMEM (содержащей 3% фетальной телячьей сыворотки) и осаждали центрифугированием. Перед трансплантацией готовили суспензию клеток (либо КЭП, либо СККМ) в физиологическом растворе NaCl из расчёта 20 млн. клеток/мл. Для этого выделенные клетки подсчитывали в камере Горяева и осадок с клетками разводили физиологическим раствором до требуемой концентрации.

Суспензию клеток вводили в нижний полюс паренхимы селезёнки, лапаротомическим доступом на наркотизированном животном. Для профилактики инфекционных осложнений, интраоперационно и последующие 2 дня назначали гентамицин - 20 мг/сут.

Посттрансплантационный период (после введения аллогенных КЭП) не сопровождался назначением иммуносупрессивной терапии.

Результаты исследования

Известно, что уже на ранних стадиях атерогенеза существенную роль в прогрессирующем развитии атеросклероза играют ДЛП и индуцированная ею микроангиопатия, которая и ведёт к развитию полиорганной патологии. Нарушение липидного обмена непосредственно связано с нарушением клиренса ХС печенью и нарушением метаболизма атерогенных липопротеидов (ЛПНП и ЛПОНП), что, наряду с изменениями других органов, приводит к развитию прогрессирующего хронического гепатита и жировой дистрофии этого органа. Кроме того, в патогенезе возникновения воспалительных и дистрофических изменений в печени большое значение придаётся ингибированию активности иммунной системы и прежде всего ингибированию морфорегуляторной функции её клеток. Именно поэтому оценка эффективности применения клеточной трансплантации для коррекции нарушений обусловленных ДЛЕ и атеросклерозом, предшествовала работа по оценке адекватности модели хронической алиментарной дислипидемии и атеросклероза, отработанной на мелких лабораторных животных - морских свинках.

1. Характеристика модели алиментарной дислипидемии и атеросклероза у морских свинок.

Изучение показателей липидного обмена производилось на 2, 4 и 6 месяце пребывания животных на АТД. Результаты этого исследования представлены в таблице 2.

Таблица 2. Показатели липидного обмена у морских свинок на фоне стандартного питания (интактные животные), молочной (контроль) и атерогенной (АТД) диеты в течение 6 месяцев.

Экспериментальные группы	Биохимические показатели (ммоль/л)	Индекс атерогенности
	Общ. ХС	ЛПВП	ЛПНП+ЛПОНП	ТГ
Интактные животные (n=8)	0.91±0.19	0.37±0.23	0.55±0.24	0.82±0.30	2.4±2.05
Контроль - молоко 2 мес. (n=8)	0.74±0.10	0.53±0.12	0.21±0.14	1.3±0.17	0.45±0.37
АТД 2 мес. (n=10)	1.73±0.56*†	0.55±0.39	1.18±0.59*†	0.82±0.38	3.32±2.99*†
Контроль - молоко 4 мес. (n=8)	1.07±0.13	0.47±0.12	0.59±0.05	1.56±0.45	1.31±0.36
АТД 4 мес. (n=10)	2.95±0.88*†	0.33±0.13	2.67±0.90*†	0.71±0.34	9.85±6.93*†
Контроль - молоко 6 мес. (n=8)	1.19±0.21	0.72±0.05	0.47±0.25	1.24±0.05	0.69±0.38
АТД 6 мес. (n=10)	3.06±1.05*†	0.87±0.4	2.19±1.16*†	1.04±0.55	2.7±2.45†

Примечание: * - р < 0.05 в сравнении с группой интактных животных; † - р < 0.05 в сравнении с группами соответствующего контроля (молочная диета)

Из таблицы 2 видно, что уже через 2 месяца АТД у морских свинок наблюдалось повышение общего ХС почти в 2 раза - с 0.91±0.19 ммоль/л до 1.73±0.56 ммоль/л (р < 0.05) и это происходило за счёт атерогенных фракций липопротеидов: ЛПНП и ЛПОНП повышались с 0.55±0.24 ммоль/л до 1.18±0.59 ммоль/л (р < 0.05). К 4 месяцу пребывания животных на АТД уровень общего ХС увеличивался в 3 раза по сравнению с интактными животными и достигал 2.95±0.08 ммоль/л; аналогичным образом происходило повышение атерогенных фракций липопротеидов: ЛПНП и ЛПОНП повышались до 2.67±0.9 ммоль/л. Индекс атерогенности (ИА) по мере увеличения сроков АТД возрастал до 3.32±2.99 ко 2 месяцу АТД и до 9.85±6.93 к 4 месяцу АТД.

У контрольных животных, получавших только молоко, уровень общего ХС через 2 месяца оказался несколько ниже, а через 4 месяца несколько выше, чем к интактных животных.

Заслуживает, между тем, внимания тот факт, что молочная диета у морских свинок существенно снижала ИА. Вместе с тем уровень ТГ у этих животных оказался выше, чем у интактных и получавших АТД.

Из таблицы 2 видно также, что пребывание морских свинок на АТД с 4 по 6 месяц не приводило к дальнейшему повышению общего ХС. Более того, на 6 месяце АТД происходило падение ИА почти до нормы, в связи с относительным увеличением ХС (ЛПВП) и снижением ХС (ЛПНП+ЛПОНП). Содержание ТГ га этом сроке увеличивалось более чем в 2 раза.

Указанные изменения в липидном спектре сыворотки крови, возникающие на 6 мес. АТД, следует, очевидно, рассматривать как результат адаптационно-приспособительных реакций организма на ежедневное экзогенное введение ХС, как стремление организма удержать значения жизненно-важных параметров метаболизма в физиологически допустимых пределах. Однако такое мнимое благополучие, наступающее в динамике показателей липидного обмена, к 6 мес. кормления ХС, может достигаться только за счёт перенапряжения работы всех функционально-зависимых систем. Результаты изучения липидного обмена позволили нам предположить, что, начиная с 4, но особенно на 6 месяце моделирования ДЛЕ изменения в липидном обмене должны уже сопровождаться изменениями морфо-функционального состояния органов и систем, участвующих в регуляции клиренса ХС; начиная с 4-6 месяцев в организме морских свинок должны появляться признаки декомпенсации практически всех функционально-зависимых систем. Изучение состояния МЦР показало, что через 2 месяца АТД в МЦР наступают сосудистые, внутрисосудистые и внесосудистые изменения: повышенная извитость микрососудов, сужение сосудов приносящего звена, локальные спазмы артериол, дилятация венул, микроаневризмы. Наблюдается образование эритроцитарных агрегатов по типу «монетных столбиков» или более плотных, характерных для сладж-синдрома. Внесосудистые изменения представлены диапедезом эритроцитов, клеточными инфильтратами и периваскулярным отёком. Наряду с этим, возрастает количество функционирующих посткапилляров и капилляров, что можно оценить как адаптационно-приспособительную реакцию терминального сосудистого русла на действие повреждающего фактора. Существенно изменяются морфометрические показатели состояния МЦР (таблица 3).

Таблица 3. Показатели, характеризующие состояние сосудов МЦР у морских свинок, получающих различный рацион питания

Группы	Площадь поперечного сечения микрососудов (мкм)
	Артериола	Венула	Прекапилляр	Посткапилляр	Капилляр
интактные животные (n=10)	186.9±9.7	238.5±11.2	36.7±2.5	69.9±5.8	30.5±2.9
контроль (молоко) 2 мес.(n=8)	191.7±6.9	254.0±20.5 254.0±20.5	38.9±3.6	64.3±7.3	28.7±3.8
АТД 2 мес. (n=10)	117.6±18.5*†	334.8±19.6*†	31.5±3.2†	72.8±4.1	21.8±2.1*†
контроль (молоко) 4 мес. (n=8)	184.5±12.3	261.7±23.6	34.9±4.1	65.6±5.2	26.9±2.1
АТД 4 мес. (n=10)	109.4±17.6*†	451.8±28.5*†	30.6±2.4*	78.9±3.8†	22.1±3.6*

Примечание: * - р < 0.05 в сравнении с группой интактных животных; † - р < 0.05 в сравнении с группами соответствующего контроля (молочная диета).

Из таблицы 3 видно, что через 2 месяца АТД достоверно снижается площадь поперечного сечения артериол с 186.9±9.7 мкм у интактных животных до 117.6±18.5 мкм (р < 0.05) и достоверно возрастает площадь поперечного сечения венул с 238±11.2 мкм у интактных животных до 334±19.6 мкм, уменьшается площадь поперечного сечения капилляров с 30.5±2.9 у интактных животных до 21.8±2.1 мкм после 2-х месяцев кормления ХС.

К 4-м месяцам АТД выявленные изменения прогрессируют и приобретают более выраженный характер. При этом обменное звено повреждено в большей степени, капилляры тромбируются и выключаются из кровообращения, отмечается разрежение капиллярных сетей. Морфологические показатели состояния сосудистого русла (таблица 3) указывают на прогрессирующее снижение площади поперечного сечения артериол до 109.4±17.6 мкм, прекапилляров до 30.6±2.4 мкм и прогрессирующее увеличение площади поперечного сечения венул до 451.8±28.5 мкм. К 6 месяцу пребывания морских свинок на АТД изменения в МЦР усугубляются, капилляры тромбируются, развивается стаз, периваскулярный отёк и клеточная инфильтрация тканей. Примечательно, что именно к этому сроку в аорте появляются макроизменения в виде липидных пятен и бляшек.

На фоне длительной АТД наступали грубые морфологические изменения в паренхиме внутренних органов-мишеней.

В печени через 2 месяца АТД были обнаружены гемодисциркуляторные нарушения, а также признаки вакуольной, зернистой и жировой дистрофии; была выявлена дискомплексация печёночных балок. Гепатоциты с включениями липидов занимали до 8-10% поверхности среза, и были локализованы, преимущественно вокруг центральных венул. С увеличением срока АТД в ткани печени возрастает количество эозинофилов. На 4-м месяце АТД гепатоциты с жировой дистрофией занимали уже до 50-70% среза с той же локализацией; прогрессировали нарушения балочной структуры. Начиная с 2-х месяцев АТД, в перипортальной области наблюдались мононуклеарные инфильтраты, периваскулярный и перидуктальный отёк.

На 4-м месяце АТД у единичных животных в просвете некоторых портальных венул появлялись стволово-подобные клетки (мелкие с очень тёмными, округлыми ядрами), отличные от лимфоцитов.

Установлено также, что на фоне АТД у морских свинок появляются признаки снижения иммунной активности селезёнки. Это проявляется уменьшением общего количества фолликулов белой пульпы (на площадь среза) и фолликулов с активными центрами размножения (светлыми), а их соотношение увеличивается. Описанные изменения усиливаются при увеличении срока АТД. Выявлено повышение митотической активности клеток в фолликулах. Через 2 месяца АТД в селезёнке появляются юные клетки миелоидного ряда и зрелые эозинофилы. С увеличением сроков АТД их количество резко возрастает. В красной пульпе имеются единичные колонии стволово-подобных клеток - мелких, имеющих округлую форму и темноё большое ядро, которые отличаются от лимфоцитов. С увеличением сроков АТД количество таких клеток увеличиваются, появляются субкапсулярные колонии.

На 4-м месяце АТД у некоторых животных обнаруживается расслоение, утолщение и инфильтрация липидами интимы аорты. Макроскопические проявления атеросклероза в аорте в виде пятен и бляшек выявлены у единичных животных к 6-му месяцу АТД.

Таким образом, исследование биохимических показателей липидного обмена, морфометрической и гистологической картины состояния МЦР, а также паренхимы внутренних органов (печень, селезёнка) у морских свинок, получавших АТД, позволили установить чёткую связь тяжести и глубины возникающих нарушений исследуемых показателей от длительности ежедневного приёма ХС внутрь.

Эти изменения выражаются в раннем (уже на 2 месяце АТД) развитии ДЛП и микроангиопатии, в появлении признаков вакуольной, зернистой и жировой дистрофии печени, в снижении иммунной активности селезёнки, а также в изменении структуры интимы аорты (расслоение, утолщение и инфильтрация липидами), которые прогрессируют к 4 и 6 месяцу кормления ХС.

К 6 месяцу пребывания на АТД углубление морфологических изменений в МЦР, в печени, селезёнке и аорте сопровождается стабилизацией и даже положительной динамикой показателей липидов сыворотки крови. Этот факт можно связать с адаптационными перестройками организма и перенапряжением работы всех функционально зависимых систем по поддержанию липидного баланса в организме. Не удивительно поэтому, что на 6 мес. АТД стали проявляться макроскопические признаки развития атеросклероза аорты.

Всё вышеизложенное даёт право заключить, что на морских свинках была воспроизведена адекватная модель ДЛП и атеросклероза, которая может быть использована для изучения терапевтических эффектов клеточной терапии эмбриональными клетками аллогенной печени и аутологичными стволовыми клетками костного мозга.

2. Влияние аллогенных клеток эмбриональной печени и аутологичных стволовых клеток костного мозга на регуляцию метаболизма и восстановление органных структур, повреждённых в условиях ДЛП и развития атеросклероза.

Исследование биохимических параметров липидного обмена показало (таблица 4), что после трансплантации взвеси аллогенных клеток эмбриональной печени отмечаются следующие биохимические сдвиги липидного профиля сыворотки крови: тенденция к относительно небольшому снижению уровня общего ХС через 2 (4 месяца АТД) и 4 (6 месяцев АТД) месяца, а также концентрации ХС атерогенных фракций ЛП через 4 месяца; тенденция к увеличению ХС (ЛПВП) через 4 месяца и ТГ через 2 и 4 месяца. Индекс атерогенности был ниже, чем в группах соответствующего контроля. Изменения всех этих показателей были не достоверны.

После трансплантации взвеси прекультивированных СККМ наблюдалась тенденция к двукратному увеличению концентрации ХС (ЛПВП) через 2 месяца АТД. За счёт этого индекс атерогенности в эти же сроки достоверно снижался (более чем в 2 раза) (таблица 5), по сравнению с животными, находящимися на АТД, но не получавших клеточную терапию.

Таблица 4. Показатели липидного обмена у морских свинок с разным пищевым режимом содержания, после аллотрансплантации клеток эмбриональной печени

Экспериментальные группы	Биохимические показатели (ммоль/л)	Индекс атерогенности
	Общ. ХС	ЛПВП	ЛПНП+ ЛПОНП	ТГ
2 мес. после трансплантации клеток (4 мес. АТД) (n=8)	2.63±0.79	0.35±0.04	2.28±0.77	0.87±0.17	6.46±2.11
Контроль I - ложная трансплантация (физ р-р) (4 мес. АТД (n=8)	3.06±0.74	0.36±0.13	2.7±0.8	0.66±0.22	8.59±4.96
Контроль II - трансплантация клеток без АТД (молоко 4 мес.) (n=8)	1.1±0.27	0.55±0.27	0.55±0.06	1.46±0.23	1.28±0.39
4 мес. после трансплантации клеток (6 мес. на АТД) (n=8)	2.56±0.41	1.06±0.34	1.5±0.36	0.45±0.09	1.52±0.68
Контроль I - ложная трансплантация (физ р-р) (6 мес. АТД) (n=8)	3.06±1.05	0.87±0.4	2.19±1.16	1.04±0.55	2.7±2.45
Контроль II - трансплантация клеток без АТД (молоко 6 мес.) (n=8)	1.11±0.18	0.69±0.05	0.43±0.23	1.34±0.05	0.63±0.38

Таблица 5. Показатели липидного обмена у морских свинок с разным пищевым режимом содержания, после аутотрансплантации стволовых клеток костного мозга

экспериментальные группы	Биохимические показатели (ммоль/л)	Индекс атерогенности
	общ. ХС	ЛПВП	ЛПНП+ ЛПОНП	ТГ
2 мес. после трансплантации клеток (4 мес. на АТД) (n=8)	3.25±0.83	0.68±0.19	2.56±0.89	0.87±0.07	4.12±2.21*
контроль I - ложная трансплантация (физ р-р) (4 мес. АТД ) (n=8)	3.15±0.79	0.31±0.06	2.84±0.81	0.58±0.14	9.62±4.77
контроль II - трансплантация клеток без АТД (молоко 4 мес.) (n=8)	1.17±0.17	0.39±0.08	0.77±0.23	2.15±1.03	2.1.±0.94
4 мес. после трансплантации клеток (6 мес. на АТД) (n=8)	3.47±0.63	0.98±0.12	2.49±0.51	1.04±0.28	2.53±0.23
контроль I - ложная трансплантация (физ р-р) (6мес. АТД) (n=8)	3.11±0.86	1.01±0.43	2.1.±1.13	1.11±0.63	2.71±2.36
контроль II - трансплантация клеток без АТД (молоко 6 мес.) (n=8)	0.96±0.33	0.57±0.04	0.39±0.37	0.97±0.27	0.71±0.96

Примечание: * - р < 0.05 в сравнении с группой соответствующего контроля.

Исследование изменений состояния МЦР, показало, что под влиянием трансплантированных клеток ослабляются признаки микроангиопатии, возникающей в условиях АТД, но в разной степени при использовании разных клеток.

Так, через 2 месяца после аллотрансплантации КЭП на фоне продолжающейся АТД происходило уменьшение степени дистонии сосудов МЦР. Это проявлялось расширением суженных артериол и сужением расширенных венул; одновременно происходило усиленное развитие капиллярной сети и неоангиогенез, что проявлялось увеличением числа пре- и посткапилляров, образованием новых сосудистых выростов («почек»), заканчивающихся слепо. Микростазы и агрегаты встречались значительно реже, чем в контроле (4 мес. АТД, ложнооперированные) - только у отдельных животных, в единичных сосудах. Внесосудистых проявлений не наблюдалось. В контрольной группе наблюдалась выраженная дистония (спазм артериол, дилатация венул) и замедление кровотока с наличием внутрисосудистых агрегатов.

Через 4 месяца после аллотрансплантации КЭП на фоне продолжающейся АТД вновь возникли выраженные изменения МЦР. Они характеризовались повышенной извитостью и неровностью контуров микрососудов, наличием эритроцитарных агрегатов во всех случаях, а у отдельных животных - «монетных столбиков». Изменения МЦР в контрольной группе (6 мес. АТД, ложнооперированные) были аналогичны.

Аутотрансплантация СККМ на фоне продолжающейся АТД способствовала нормализации кровотока в МЦР и через 2, и через 4 месяца после их внутриселезёночного введения.

Через 2 месяца происходило некоторое расширение артериол, отмечалось усиленное развитие капиллярной сети и появлялись признаки неоангиогенеза (рост новых сосудов). Однако почти у всех животных происходило умеренное или слабовыраженное замедление кровотока, встречались эритроцитарные агрегаты. В контроле же (4 мес. АТД, ложная операция) наблюдалось выраженное замедление кровотока и большое количество микроагрегатов, значительная дистония сосудов.

Через 4 месяца, после аутотрансплантации СККМ на препаратах выявляются нормотоничные микрососуды с относительно ровными контурами. Хорошо развито обменное звено (сосудистая сеть), эритроцитарных внутрисосудистых микроагрегатов почти нет. В целом, картина МЦР значительно лучше, чем в аналогичной группе после аллотрансплантации КЭП и в группе через 2 месяца после пересадки СККМ. В контроле (6 мес. АТД, ложнооперированные) наблюдаются резко выраженные изменения МЦР, аналогичные таковым при 4-6 мес. АТД.

Морфометрия сосудов МЦР подтверждает положительное влияние трансплантированных клеток на площадь поперечного сечения микрососудов, даже в режиме пребывания животных на АТД (таблицы 6 и 7).

Таблица 6. Показатели, характеризующие состояние МЦР у морских свинок, через 2 месяца после трансплантации клеток на фоне АТД

Группы	Площадь поперечного сечения микрососудов (мкм)
	Артериола	Венула	Прекапил-ляр	Посткапил-ляр	Капилляр
Трансплантация КЭП (n=8)	136.55±9.5*	372.17±31.25*	32.31±1.81	68.79±6.71	25.13±1.5
Контроль - ложная операция (введение физ. р-ра) (n=7)	99.01±12.33	254.0±20.5 444.52±14.29	29.46±1.96	77.51±4.4	23.29±1.56
Трансплантация СККМ (n=8)	123.73±6.8*	418.61±19.38	31.68±2.64	74.99±2.91	24.93±1.69
Контроль - ( ложный забор КМ и введение физ. р-ра) (n=7)	102.84±9.19	438.35±9.72	27.58±1.96	85.17±1.68	21.65±0.86

Примечание: * - р < 0.05 в сравнении с группой соответствующего контроля.

Таблица 7. Показатели, характеризующие состояние МЦР у морских свинок, через 4 месяца после трансплантации клеток на фоне АТД

Группы	Площадь поперечного сечения микрососудов (мкм)
	Артериола	Венула	Прекапилляр	Посткапилляр	Капилляр
Трансплантация КЭП (n=8)	125.41±4.43*	443.82±13.63	29.81±1.34	77.86±1.48*	28.09±1.95
Контроль - ложная операция (введение физ. р-ра) (n=7)	90.6±3.88	254.0±20.5 464±8.2	28.35±1.88	86.43±2.19	25.23±2.09
Трансплантация СККМ (n=8)	155.87±9.75*†	302.41±16.26*†	30.92±1.34	68.54±3.01*	28.46±1.41
Контроль - (лож. забор КМ и введение физ. р-ра) (n=7)	89.21±3.44	459.13±4.86	32.92±1.4	85.46±0.88	25.04±1.87

Примечание: * - р < 0.05 в сравнении с группой соответствующего контроля; † - р < 0.05 в сравнении групп с трансплантацией клеток между собой.

КЭП -клетки эмбриональной печени, СККМ - стволовые клетки костного мозга, КМ - костный мозг

Из таблиц 6 и 7 видно, что уже через 1 месяца после трансплантации клеток - КЭП и СККМ происходит достоверное расширение артериол (увеличение площади поперечного сечения); достоверное сужение просвета венул было отмечено только при трансплантации аллогенных КЭП.

Через 4 месяца после трансплантации клеток обоего типа на фоне продолжающейся АТД - также отмечено достоверное расширение артериол (увеличение площади поперечного сечения) по сравнению с контролем (АТД); но достоверное сужение венул было отмечено только при трансплантации аутологичных СККМ; отмечено также достоверное сужение просвета посткапилляров при использовании обоих типов клеток для трансплантации.

Сопоставляя эффективность и выраженность регуляторного воздействия трансплантируемых клеток между собой на показатели состояния МЦР можно отметить, что при трансплантации аллогенных КЭП регуляторный эффект был более выражен через 2 месяца, а через 4 месяца достоверно ослабевал. Через 4 месяца после аутотрансплантации СККМ - площадь поперечного сечения артериол была достоверно выше, а площадь поперечного сечения венул - достоверно ниже, чем при трансплантации КЭП.

Таким образом, результаты изучения состояния сосудов МЦР показали, что и аллогенные КЭП, и аутологичные СККМ способствуют ослаблению признаков дислипидогенной микроангиопатии. Однако регуляторные свойства СККМ по восстановлению показателей МЦР были более пролонгированы и более выражены.

Исследование морфологических изменений в паренхиме внутренних органов показало, что аллогенные КЭП и аутологичные СККМ, приблизительно, в одинаковой степени способствуют нормализации морфологической структуры органов-мишеней.

Так, в печени через 2 и 4 месяца после трансплантации аллогенных КЭП и аутологичных СККМ (на фоне продолжающейся АТД) приблизительно у 30% животных отмечается нормализация гистологической картины печени. Это проявляется в почти полном отсутствии гепатоцитов с жировыми включениями и дистрофией. Однако то же самое наблюдалось у единичных животных в контрольных группах (4 и 6 мес. АТД, введение физ. р-ра). После трансплантации клеток обоего типа визуально наблюдалось некоторое снижение степени жировой дистрофии (более выраженное после введения СККМ) как через 2 так и через 4 месяца, по сравнению с контролем. Так, у контрольных животных (АТД 4 и 6 мес.), гепатоциты с жировой дистрофией занимают до 50-85% среза, а в группах с клеточной трансплантацией на фоне АТД - 40-70%. В ткани печени имелось также небольшое количество эозинофилов, а в перипортальных областях наблюдались единичные мононуклеарные инфильтраты. В контролях с молоком у всех животных печень имела нормальную гистологическую картину через 4 и 6 месяцев.

Гистологическое исследование селезёнки через 2 и 4 мес. после трансплантации аллогенных КЭП и аутологичных СККМ животным, продолжающим получать АТД (4 и 6 мес. соответственно) позволило констатировать, что иммунная активность селезёнки, угнетённая АТД - повышается. Это проявлялось в увеличении общего количества фолликулов. Через 4 месяца после трансплантации клеток обоих типов появлялись многоядерные макрофаги (больше после введения клеток печени) и плазмоциты (больше после введения клеток костного мозга). Количество эозинофилов и стволово-подобных клеток оставалось стабильно высоким как после клеточной терапии, так и в контролях.

Таким образом, результаты изучения морфологических изменений в паренхиме внутренних органов, являющихся органами-мишенями при ДЛП и ранних стадиях атеросклероза показывают, что трансплантация аллогенных КЭП и аутологичных СККМ повышает резистентность клеток этих органов к повреждению (печень), а также способствует нормализации их функции (селезёнка).

Между тем, осуществление клеточной трансплантации в условиях продолжающейся АТД, т.е. в условиях продолжающегося поступления ХС в организм, не позволяет в полной мере реализоваться терапевтическим эффектам клеточной трансплантации.

ВЫВОДЫ

1. Воспроизведённая модель хронической алиментарной дислипидемии и ранних стадий атерогенеза у морских свинок является адекватной для испытания новых методов профилактики и лечения атеросклероза, в том числе методов клеточной терапии.

2. Дислипидогенная микроангиопатия является наиболее ранним проявлением структурных нарушений в сосудистом русле при хронической дислипидемии и раннем атерогенезе. Контроль изменений в состоянии микроциркуляторного русла позволяет объективно оценивать эффективность терапии атеросклероза.

3. Трансплантация свежевыделенных клеток аллогенной эмбриональной печени и прекультивированных стволовых клеток аутологичного костного мозга позволяет осуществлять коррекцию ранних проявлений хронической дислипидемии и атеросклероза даже в условиях продолжающейся атерогенной диеты. На фоне клеточной трансплантации ослабляются морфологические признаки микроангиопатии, неспецифического воспаления и жировой дистрофии печени, а также морфологические признаки угнетения иммунной активности селезёнки, которые возникают при моделировании хронической дислипидемии и атерогенеза.

4. Корригирующий эффект при аутотрансплантации стволовых клеток костного мозга животным с дислипидемии и ранними проявлениями атерогенеза более выражен и более пролонгирован чем при аллотрансплантации клеток эмбриональной печени.

5. Для повышения эффективности клеточной терапии дислипидемии и раннего атерогенеза предпочтение следует отдавать комплексной терапии, основанной на трансплантации аутологичных стволовых клеток костного мозга и ограничении поступления в организм атерогенных факторов с пищей.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

1. Воспроизведённая на морских свинках модель дислипидемии и раннего атеросклероза может быть использована для разработки новых методов лечения и профилактики болезней липидного обмена, в том числе для испытания эффективности клеточной терапии.

2. Микроциркуляторные нарушения являются маркёрами ранней дислипидемии и атерогенеза. Выявление микроциркуляторных нарушений должно использоваться для диагностики и коррекции ранних проявлений развивающегося атеросклероза.

3. Трансплантация аллогенных клеток эмбриональной печени и аутологичных стволовых клеток костного мозга является эффективным методом профилактики и лечения дислипидемических нарушений и раннего атеросклероза и может быть рекомендована к применению в клинике.

4. Отработанный метод выделения, культивирования и аутотрансплантации стволовых клеток костного мозга может быть рекомендован для использования в клинике.

5. При выборе метода клеточной терапии дислипидемии и раннего атеросклероза предпочтение следует отдавать аутотрансплантации стволовых клеток костного мозга, как более доступному и более эффективному методу.

Работы, опубликованные по теме диссертации

1. Клеточная терапия дислипидемий и атеросклероза. Вестник Трансплантологии и искусственных органов 2001; 2: 46-53; Берсенев А.В. и соавт.

2. Экспериментальные модели повреждения миокарда и печени для изучения биологических и клинических эффектов метода клеточной трансплантации. В кн.: Новые оперативные технологии. Тез. докл. научной конф. посвящ. 75-летию Кирпатовского И.Д., Москва, 2002: 226-228; Хубутия А.Ш., Берсенев А.В. и соавт.

3. Клеточная и пептидная терапия ранних стадий атерогенеза. Вестник Трансплантологии и искусственных органов 2002; 3: 89-90 (Мат. II Всероссийского съезда по трансплантологии и разработке искусственных органов); Берсенев А.В. и соавт.

4. Костный мозг как источник получения мезенхимальных клеток для восстановительной терапии поврежденных органов. Вестник трансплантологии и искусственных органов 2002; 4: 3-6; Шумаков В.И., Онищенко Н.А., Крашенинников М.Е., Зайденов В.А., Потапов И.В, Башкина Л.В., Берсенев А.В.

5. Дифференцировка стромальных стволовых клеток костного мозга в кардиомиоцито-подобные клетки у различных видов млекопитающих. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2003, 4: 461-465; Шумаков ВИ, Онищенко НА, Крашенинников МЕ, Зайденов ВА, Потапов ИВ, Башкина ЛВ, Берсенев АВ.

6. Дислипидогенная микроангиопатия у морских свинок на ранних стадиях атерогенеза. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 2003 в печати. Берсенев А.В. и соавт.

7. Experimental models and technological approach for the estimation of therapeutic efficiency of organ dysfunction, by bone marrow-derived mesenchymal stem cells N.A. Onischenko, M.E. Krasheninnikov, M.F. Rasulov, I.V. Potapov, A.V. Bersenev, et al. Int J Artif Organs 2003; 26; 7: 563 (abstract 127)

Размещено на Allbest.ru