Діагностика інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту великої рогатої худоби за показниками антитіл в носовому, піхвовому секретах та сльозі

Размещено на http://www.allbest.ru/

ІНСТИТУТ ЕКСПЕРИМЕНТАЛЬНОЇ і КЛІНІЧНОЇ ВЕТЕРИНАРНОЇ МЕДИЦИНИ УААН

УДК 619:616.98:578.825.15:616-076:636.2

Діагностика інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту великої рогатої худоби за показниками антитіл в носовому, піхвовому секретах та сльозі

16.00.03. - ветеринарна мікробіологія та вірусологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня кандидата

ветеринарних наук

Матковська Світлана Григорівна

ХАРКІВ 1999 р.

Дисертацією є рукопис.

Робота виконана в Харківському зооветеринарному інституті Міністерства агропромислового комплексу України

Провідна установа - Національний аграрний університет Кабінету Міністрів України, м. Київ, кафедра мікробіології та вірусології.

Захист відбудеться “24” червня 1999 р. о 9 00 годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 64.359.01, при Інституті експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН за адресою: 310023, Харків - 23, вул.Пушкінська, 83.

З дисертацією можна ознайомитися в бібліотеці Інституту експериментальної і клінічної ветеринарної медицини УААН, м. Харків, вул.Пушкінська,83.

Автореферат розіслано “21” травня 1999 року

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор ветеринарних наук, професор Конаржевський К.Є.

1. ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Відомо, що збудниками вірусних захворювань великої рогатої худоби з першочерговим ураженням респіраторних органів є віруси інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту (ІРТ-ІПВ), парагрипу-3 (ПГ-3), респіраторно-синцитіальної інфекції (РСІ), аденовірусної інфекції (АДВ), вірусної діареї-хвороби слизових оболонок (ВД-БС). Вони уражають покривний епітелій і тим самим створюють сприятливі умови для розмноження бактеріальної мікрофлори, яка зумовлює важкий перебіг захворювання ( О.Х. Штрауб, 1981; Н.Н. Крюков, З.Ф. Зуділіна, 1985; В.А. Атамась,1986; Р.В. Гуненков, О.К. Сухарова, 1987; Я. И. Глухов, 1988; П. А. Красочко, 1993; Z. Posрilis, 1983; M. Ackermann,1990; El. Savalchy, 1995).

У господарствах України серед великої рогатої худоби широке розповсюдження має ІРТ-ІПВ ( Є.В.Андрєєв,1978; П.П. Фукс, 1990; Н.П. Чечоткіна,1995). Як правило, діагноз на це захворювання встановлюється на підставі виявлення вірусу в патологічному матеріалі методами ІФ, РДП, РЗК, ІФА, електронної мікроскопії; виділення збудника в культурі клітин (ПЕК, НТ, ТБ, органних культурах верхніх дихальних шляхів) та ідентифікації його в серологічних реакціях (РН, РНГА, РЗК, РІФ); виявлення антитіл в сироватці крові хворих і перехворілих тварин (ретроспективна діагностика) в серологічних реакціях (РН, РНГА, РЗК) (Б.І. Антонов, 1987). Проте для виділення вирусу згідно з цією схемою необхідно 30-45 днів, а для проведення ретроспективної діагностики потрібний повторний відбір сироватки крові з інтервалом 21 день. Люмінесцентний метод є швидким і надійним, але при цьому потребує спеціального обладнання й високоочищеної антисироватки, поміченої флюорохромом.

У цій схемі не відведено місця дослідженню різних біологічних рідин організму, окрім сироватки крові, хоча останнім часом багатьма вченими приділяється велика увага вивченню ролі антитіл, які містяться у цих рідинах та відносяться до різних класів імуноглобулінів (Ig M, G, A), в тому числі й sIg A.

Такими рідинами можуть бути секрети організму: молозиво, слина, сльоза, слиз кишкового тракту, носа, статевих органів (Я.С. Шварцман, 1978; В.А. Сергєєв, Т. І. Аліпер,1988). У зв'язку з важливою біологічною функцією, яку виконують імуноглобуліни секретів по захисту організму тварин від патогенних мікроорганізмів, виявлення останніх та визначення їх концентрації є дуже суттєвим, але, на наш погляд, найнеобхіднішим має бути не стільки виявлення концентрації кожного класу імуноглобулінів, скільки визначення специфічності цих антитіл при кожному інфекційному захворюванні з метою постановки діагнозу.

В той же час, недостатньо повно в сучасній схемі, на наш погляд, відображена роль цитоморфологічного методу діагностики при виявленні вірусу ІРТ-ІПВ. Багато вчених, які вивчали це питання, внесли вагомий внесок у вирішення проблеми. Слід відзначити, що разом зі збігом в даних літератури відносно цитоморфологічних змін, які виникають під дією віруса ІРТ-ІПВ, існують деякі розбіжності в тлумаченні окремих понять (Шт. Ніколау,1965; Р.А. Бабікова,1974; В.Д. Соловйов та ін.,1979; Д.А. Данішевський, 1981; С.Ф. Чєвєлєв та ін.,1984; M. Begawi, 1988; V. Palfi, 1989; J. Viskers, 1993; H. Weissenbock, 1995).

Враховуючи актуальність проблеми та недостатнє вивчення імунологічного та цитоморфологічного методів діагностики при цьому захворюванні, були проведені відповідні дослідження.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Дисертація присвячена виробничій діагностиці інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту (ІРТ-ІПВ) великої рогатої худоби та відноситься до держбюджетної теми: “Асоційовані інфекції і нові підходи до сучасної проблеми інфекційної патології тварин”, № 0194и027849.

Мета і задачі дослідження. Метою роботи було вивчити можливість використання носового, піхвового секретів та сльози для виявлення специфічних антитіл, а також показати значення та місце імунологічного та цитоморфологічного методів діагностики ІРТ-ІПВ.

Для досягнення мети були поставлені такі завдання:

1. Встановити наявність специфічних антитіл проти вірусу ІРТ-ІПВ в носовому, піхвовому секретах та сльозі за допомогою РНГА та РНБА.

2. Вивчити динаміку антитіл проти вірусу ІРТ-ІПВ у цих рідинах організму тварин із різних господарств.

3. Провести дослідження з зараженням культури клітин для уточнення етапів і термінів розвитку ЦПД при репродукції вірусу ІРТ-ІПВ.

4. Виявити присутність вірусу в клітинах слизових оболонок носа та піхви за життя або після загибелі тварин шляхом виявлення тілець-включень після офарблення їх за методами Селлєрса, Герлаха, Май-Грюнвальда, Браше та Фьольгена.

5. Визначити діагностичну цінність одержаних даних по виявленню антитіл в секретах, що використовувались, а також цитологічних змін для діагностики захворювання за життя тварин та після їх загибелі, для виділення вірусу на культурі клітин при проведенні заходів по оздоровленню господарств.

Наукова новизна одержаних результатів. Вперше випробувані різні секрети організму (носовий, піхвовий та сльоза ) для виявлення в них специфічних антитіл проти вірусу інфекційного ринотрахеїту в РНБА та РНГА в якості додаткового тесту при діагностиці ІРТ-ІПВ. Встановлена можливість використання носового секрету як діагностичного матеріалу при виявленні тварин, інфікованих вірусом ІРТ-ІПВ. Доведено, що використання носового секрету дозволяє реєструвати гостру інфекцію при виявленні антитіл в титрах від 4 до 7 log2, а також циркуляцію вірусу в господарствах при рівні антитіл від 1 до 3 log2. Показано, що різний рівень антитіл в носовому секреті та сироватці крові може бути використаний як критерій при встановленні діагнозу на ІРТ-ІПВ. Вивчені показники антитіл в носовому секреті при вакцинації великої рогатої худоби вірус-вакциною проти ІРТ-ІПВ. Встановлено, що строки появи антитіл та їх рівень в носовому секреті та сироватці крові залежать від способу введення вакцини. Після інтраназального введення вакцини “Бівак” рівень антитіл в носовому секреті різко зростає від 0 до 7 log2, а потім знижується, в сироватці крові відбувається поступове збільшення титрів антитіл, а їх рівень нижчий, ніж в носовому секреті на 3-4 log2. Після підшкірної імунізації титри антитіл в носовому секреті й сироватці крові збільшувались поступово, а їх рівень був вищим в сироватці в середньому на 1 log2.

Показано також, що при контакті вакцинованих телят з невакцинованими можливе ураження останніх, що встановлено шляхом виявлення антитіл в носовому секреті, рівень яких через 7 днів після контакту зростає від 0 до 4 log2.

Встановлено, що в процесі репродукції вірус ІРТ-ІПВ утворює базофільні тільця-включення, які потім набувають оксифільних властивостей як в культурі клітин, так і в організмі інфікованих тварин.

Практичне значення одержаних результатів. Підготовлені, розглянуті та затверджені НТР Мінагропрому України методичні рекомендації щодо використання носового, піхвового секретів та сльози для діагностики інфекційного ринотрахеїту-пустульозного вульвовагініту за допомогою РНГА та РНБА” (протокол № 1, від 18 грудня 1998 року).

Дослідження різних біологічних рідин організму дає додаткову інформацію, яка розширює уявлення про особливості перебігу інфекційного процесу при ІРТ-ІПВ у тварин в різних господарських умовах, а також при різній епізоотичній ситуації. Імунологічні дослідження цих рідин організму дають можливість поставити орієнтовний діагноз на ІРТ-ІПВ у виробничих умовах. В майбутньому доцільним буде використовувати показники антитіл в секретах при проведенні подальших досліджень по вивченню дії вакцин на організм тварин (імуногенності, залишкової вірулентності, реактогенності).

Проведені цитологічні дослідження вказують на наявність характерних цитопатичних властивостей вірусу ІРТ-ІПВ.

Одержані результати досліджень використовуються при проведенні лабораторно-практичних занять на кафедрі епізоотології факультету ветеринарної медицини Національного аграрного університету.

Особистий внесок здобувача. Результати досліджень отримані здобувачем особисто при виконанні аспірантських завдань, що підтверджується первинною документацією, щорічними звітами про хід виконання роботи, проведеною статистичною обробкою отриманих даних, а також публікаціями у відкритій пресі. У роботах, опублікованих у співавторстві, здобувач була головним виконавцем експериментів. Дослідження були проведені при активній участі співробітників лабораторії вивчення вірусних хвороб молодняку та вірусологічного відділу ІЕіКВМ.

Апробація результатів дисертації. Основні положення викладені на річних звітних конференціях ХЗВІ за 1988-1998 р.р.; на міжнародній конференції “Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии” (Кишинів,1990); на з'їзді та конференціях паразитоценологів України (Харків, Луганськ, 1995-1997); на розширеному засіданні кафедри мікробіології ХЗВІ (Харків, 1999).

Публікації. Основні результати кандидатської дисертації викладені у 7 друкованих роботах.

Структура дисертації. Дисертація включає: вступ, огляд літератури, власні дослідження, обговорення результатів досліджень, висновки та практичні пропозиції, додатки. Дисертація викладена на 136 сторінках комп'ютерного друкованого тексту, ілюстрована 21 рисунком та 12 таблицями, а також має 11 додатків, які розміщені на 25 сторінках. Список використаних джерел містить 363 праці, із них 145 закордонних авторів та займає 42 сторінки.

2. ВЛАСНІ ДОСЛІДЖЕННЯ

Матеріали та методи досліджень

Робота виконувалась на кафедрі мікробіології, вірусології та імунології Харківського зооветеринарного інституту, в Луганській державній лабораторії ветеринарної медицини, а також на базі господарств Харківської, Луганської, Дніпропетровської областей.

Методика отримання секретів і підготовки їх до використання була відпрацьована на телятах і коровах, які належали учгоспу “Прогрес” Дергачівського району Харківської області, де було досліджено 18 корів 5-6-річного віку та 5-6 телят 2,5-3-місячного віку, які утримувались в окремому приміщенні в чотирьох групових клітках.

Дослідження по виявленню специфічних антитіл в носовому, піхвовому секретах та сльозі проводили на вакцинованому поголів'ї, яке належало КСП ім. Б.Хмельницького Нікопольського району Дніпропетровської області, де застосовували вакцину “Бівак”, виробником якої є Ставропольська біофабрика (серія №8, держконтроль №8). Згідно з настановою вакцину вводили інтраназально по 1 см3 в кожну ніздрю. Матеріал відбирали від 16 вакцинованих телят через 14 днів після імунізації.

Для підтвердження специфічності антитіл, які виявляли в РНГА і РНБА при використанні носового, піхвового секретів та сльози було проведено виснаження імуноглобулінів в зазначених об,єктах шляхом додання до них рідин, які утримували гомологічний та гетерологічний (ІРТ-ІПВ і ПГ-3) віруси, інактивацію об,єктів дослідження при Т-560С протягом 30 хвилин. Обидві реакції також ставили з контрольними діагностикумами, які не містили антигену.

Носовий, піхвовий секрети та сльоза використані для вивчення строків формування імунної відповіді в залежності від способу імунізації у вакцинованих проти ІРТ-ІПВ тварин. Отримані дані співставлені зі строками появи антитіл в сироватці крові. З цією метою було проведено дослід, для якого відібрані серонегативні телята 1,5-місячного віку, призначені для відгодівлі. В КСП ім.Б.Хмельницького Нікопольського району Дніпропетровської області були сформовані три групи тварин (дві - дослідні, одна - контрольна). Телятам дослідних груп вводили вакцину “Бівак”: першій групі, згідно з настановою, інтраназально, другій - підшкірно. Матеріал для дослідження відбирали через 3, 7, 15, 30 і 45 днів після імунізації і визначали рівень антитіл в РНГА.

У виробничих умовах використання носового секрету як діагностичного матеріалу було апробовано на клінічно здорових телятах, які були народжені від корів, із господарств з різною епізоотичною ситуацією з вірусних респіраторних захворювань, а в 25-денному віці переводились в господарства, які займаються відгодівлею великої рогатої худоби. Для вивчення динаміки процесу антитілоутворення і встановлення ролі місцевого імунітету при ІРТ-ІПВ були проведені дослідження по виявленню антитіл в носовому секреті та сироватці крові у таких телят в господарствах-постачальниках, а також при утриманні їх в спецгоспах по відгодівлі. Матеріал відбирали у телят 5-, 25-денного віку в господарствах-постачальниках, а в господарствах по відгодівлі - в 45-, 60- та 90-денномі віці при сумісному утриманні завезених тварин. Дослідження проводили в Луганській області в двох господарствах-постачальниках: КСП “Україна” Сватівського району (господарство №1) і ВАТ “Правда” Ново-Айдарського району (господарство №2) і в одному спецгоспі - КСП ім. Леніна Сватівського району.

Для з,ясування питання про можливість передачі вакцинного вірусу невакцинованим тваринам в умовно благополучному з ІРТ-ІПВ господарстві - КСП “Україна”, яке є постачальником для КСП ім. Леніна, було проведено дослід №2. Для цього на МТФ №3, де утримувались 98 голів молодняка великої рогатої худоби віком від 3 до 14 місяців, проведена імунізація 18 телят 3,5-місячного віку, які були в тісному контакті з 21 головою невакцинованих телят того ж віку. Тварини утримувались в сусідніх групових клітках, які мали загальну годівницю. Вакцину “Бівак” у дозі 1 см3 застосовували інтраназально згідно з настановою. До введення вакцини, а також через один і два тижні після інокуляції біопрепарату, секрет із носової порожнини і сироватку крові від вакцинованих, а також невакцинованих тварин, що знаходились з ними в контакті, досліджували в РНГА.

Дослідження по виявленню антитіл в сироватці крові з використанням РНГА та РНБА проводили згідно з існуючими інструкціями, а в секретах - згідно з удосконаленою нами методикою. В дослідних та виробничих умовах було використано 395 телят різного віку і 18 корів 5-6-річного віку. РН, РІФ та вірусологічні дослідження проводили згідно з існуючими інструкціями (Б.І. Антонов, 1986,1987); а також методичними рекомендаціями (Є.В. Андрєєв, Н.П. Чечоткіна, П.П. Фукс, 1990).

При проведенні цитоморфологічних досліджень використовували методики, описані Б. Ромейсом (1954), З.Лярскі, (1980), В.Н. Сюріним (1972-1991). Мікрофотометричні дослідження проводили за допомогою окуляр-мікрометра МОВ-1-1,5х, градуйованої шкали окуляра 7х. Об,єкт-мікрометр використовували для перерахунку розмірів об,єктів, які виражали в мікрометрах (мкм). Мікрофотографування було проведено на мікроскопі “Біолам-212” з мікрофотонасадкою МФНЕ -1У4.2.

Загальний білок в біологічних рідинах організму виявляли за біуретовою реакцією (В.Г. Колб,1982). Зональний електрофорез проводили згідно з методикою П. Грабара та П. Буртена (1963).

РЕЗУЛЬТАТИ ВЛАСНИХ ДОСЛІДЖЕНЬ

Порівняльне вивчення біологічних рідин організму для діагностики ІРТ-ІПВ

Дослідження були проведені на телятах 1,5-місячного віку, клінічно здорових і вакцинованих проти ІРТ-ІПВ вірус-вакциною “Бівак”. Встановлено, що різні секрети організму (носовий, піхвовий, та сльоза) можуть використовуватися для виявлення в них антитіл. У вакцинованих телят титр антитіл в сироватці крові в РН був 3,06 log2, в носовому секреті - 3,25 log2, в піхвовому секреті та сльозі антитіла не виявлялись. В РНГА антитіла в сироватці крові були виявлені в титрах 5,3 log2, в носовому секреті - 7,36 log2, в сльозі та піхвовому секреті коливались в межах від 1 до 2 log2. В РНБА в сироватці крові були антитіла в титрах 6,3 log2, в носовому секреті - 5,1 log2, в піхвовому секреті та сльозі до - 1log2.

Під час електрофоретичного розподілу біологічних рідин на фракції, в них виявлені альбуміни і бета-, гамаглобуліни. Дослідження з вивчення специфічності антитіл показали, що в пробах, взятих від вакцинованих телят і підданих виснаженню імуноглобулінів шляхом додання до них гомологічного антигену (вірусу ІРТ-ІПВ), атитіла не виявлялись, а при додаванні до них гетерологічного антигену (вірусу ПГ-3) титр антитіл не змінювався. Після інактивації зазначених об'єктів дослідження при температурі 560С протягом 30 хвилин відбувалося незначне зниження титрів антитіл ( на 0,2-0,5 log2) в порівнянні з визначенням їх в нативних прозорих пробах. При дослідженні біологічних рідин з контрольними діагностикумами, які не утримували антигену, спонтанної (неспецифічної) аглютинації не спостерігалось.

Перевірка специфічності антитіл, які виявлялись в РНГА та РНБА, підтвердила придатність для дослідження як нативних, так і інактивованих проб, оскільки зниження титрів антитіл в останніх було незначним, а затрати часу на проведення інактивації з наступним повторним центрифугуванням з метою освітлення рідини досить великі, ми вважаємо можливим використовувати для дослідження нативні проби, але при цьому рідини обов'язково повинні бути прозорими.

При порівнянні результативності РНГА та РНБА встановлено, що при використанні обох реакцій для виявлення антитіл в одних і тих же пробах, РНБА показала більш високі титри антитіл, ніж РНГА у сироватці крові на 1,5-2,0 log2, а при виявленні антитіл в біологічних рідинах, навпаки, в РНГА були отримані вищі результати (в середньому на 2 log2).

Вивчення строків формування імунної відповіді при різних способах імунізації проти ІРТ-ІПВ шляхом виявлення антитіл в секретах організму

Дослідження, проведені нами, були спрямовані на виявлення антитіл в носовому, піхвовому секретах та сльозі у телят, вакцинованих проти ІРТ-ІПВ вірус-вакциною “Бівак” інтраназально та підшкірно. Телята до імунізації були клінічно здоровими і мали антитіла в сироватці крові в межах від 0,8 до 1,2 log2. В секретах організму антитіла були відсутні. Після імунізації проби відбирали через певні проміжки часу ( 3, 7, 15, 30, 45 днів) і порівнювали строки появи та рівень антитіл в даних біологічних рідинах з титрами останніх у сироватці крові.

Отримані нами дані свідчать про те, що в носовому секреті на 3-й день після інтраназального введення вакцини відбувалось різке підвищення рівня титрів антитіл з 0 до 5,1 log2, до 15 доби рівень антитіл максимально збільшувався до 7,33 log2, а до 45 дня ( строк спостереження) поступово знижувався до 4,46 log2. Після підшкірного введення препарату рівень антитіл в носовому секреті збільшувався поступово аж до 15 дня з моменту інокуляції вакцини відповідно до строків на 0,85, 2,07, 4,28 log2 , а потім поступово знижувався до 3,64 log2 на 30-й день і до 3,35 log2 на 45 день.

Результати досліджень подані на рис. 1.

Рис. 1 Динаміка титрів антитіл в сироватці крові та секретах організму після інтраназальної та підшкірної імунізації

При дослідженні сироватки крові встановлено, що рівень антитіл поступово збільшувався аж до 30 дня, а потім знижувався до 45 доби як після пішкірного, так і після інтраназального введення препарату. Однак після підшкірного введення титр антитіл в сироватці крові був значно вищий ( на 2,95 log2 ), ніж після інтраназального введення.

Наші дослідження свідчать про те, що після інтраназального введення вакцини титри антитіл в носовому секреті були вищі, ніж у сироватці крові з 3-го по 45-й день спостереження на 2,88, 3,75, 3,53, 2,16, 0,55 log2 , в той час як після підшкірного введення вакцини рівень антитіл був вищий в сироватці крові з 3-го по 45-й день на 1,0, 1,28, 0,86, 2,5, 2,65 log2. Титри антитіл в носовому секреті після різкого підвищення на 3-й день після інтраназального введення препарату до 45-го дня зберігались на більш високому рівні - (4,46 log2), ніж після підшкірного введення вакцини - (3,91 log2).

При дослідженні проб піхвового секрету максимальне підвищення титрів антитіл приходилось на 15-й день після вакцинації і становило 2,0 і 1,4 log2 відповідно після підшкірної та інтраназальної імунізації. В сльозі спостерігалась пряма кореляція між зростанням титрів антитіл до вірусу ІРТ-ІПВ після підшкірного та інтраназального введення вакцини. Однак кількість їх до 45-го дня після аплікації препарату на слизову оболонку носа зберігалась на рівні -1,8 і 1,2 log2. Це більш високий рівень, ніж при підшкірній інокуляції матеріалу. За результатами статистичної обробки було зроблено висновок про вірогідність даних. При порівнянні титрів антитіл у сироватці крові і носовому секреті після інтраназального та підшкірного введення вакцини в динаміці різниця в рівні їх була достовірна ( Р > 0,999). При порівнянні рівня антитіл в носовому секреті в залежності від способу введення препарату через 45 днів показники також були достовірними ( Р> 0,95), але не всі. Так, при співставленні рівня антитіл в сироватці крові і носовому секреті через 15 днів після підшкірного введення вакцини і через 45 днів після інтраназального введення препарату показники були недостовірними ( Р < 0,95).

Проведені нами експериментальні дослідження по виявленню антитіл до вірусу ІРТ-ІПВ в носовому, піхвовому секретах і сльозі свідчать про реальну можливість і доцільність використання даних субстратів для діагностики захворювання. Однак у виробничих умовах у молодняка великої рогатої худоби найперспективнішим ми вважаємо визначення специфічних антитіл в носовому секреті, оскільки відбір цього субстрату пов'язаний з найменшими трудозатратами і дозволяє отримати його в достатній кількості для дослідження ( 1-3 см3 ) за 5-15 хвилин, а рівень антитіл в ньому вищий в середньому на 5 log2, ніж в інших секретах.

Вивчення циркуляції польових штамів вірусу ІРТ-ІПВ за визначенням титрів антитіл в носовому секреті та сироватці крові

При вивченні цього питання основну увагу було приділено виявленню антитіл в носовому секреті, оскільки нами встановлено, що в місці введення вакцинного вірусу діяли місцеві механізми імунного захисту. Дослідження проведені в двох господарствах-постачальниках (госп-во №1 і №2) і в одному спецгоспі (госп-во №3). Простежена динаміка антитіл в носовому секреті і сироватці крові у телят, які надходять із господарств-постачальників з різною епізоотичною ситуацією. В господарстві по відгодівлі телята утримувались сумісно в одній груповій клітці, при цьому вірус міг передаватись аерогенним та контактним (обнюхування та облизування) шляхами. При вивченні рівня антитіл у віковому аспекті у телят використовували всі субстрати одночасно в двох реакціях : РНГА та РНБА для порівняння їх результативності при виявленні циркулюючого вірусу ІРТ-ІПВ в господарствах.

Наші дослідження показали, що телята, які народились у господарстві №1, мали невисокі титри антитіл і в сироватці крові ( від 1,0 до 1,5 log2), і в носовому секреті ( від 0,3 до 2,0 log2 ), а саме господарство вважалось благополучним з ІРТ-ІПВ. Телята, які народились в господарстві №2, мали вищі титри антитіл, при цьому їх рівень в носовому секреті у телят 5-денного віку становив 4,6 log2 і був вищим на 1,0 log2, ніж в сироватці крові. При використанні РНГА для визначення антитіл одночасно в носовому секреті і сироватці крові встановлено, що в 5-денному віці у телят господарства №2 і в 45-денному віці у телят, які утримувались сумісно і поступали з обох господарств-постачальників, рівень антитіл в носовому секреті був вищий на 0,9 і 1,25 log2 , ніж у сироватці крові, а в 60- і 90-денному віці у цих же телят - нижчий на 0,5 log2 , ніж у сироватці крові. При використанні РНБА для виявлення антитіл в носовому секреті та сироватці крові у телят із двох господарств-постачальників і спецгоспу титр антитіл у сироватці крові був вищим, в середньому на 2,0 log2, ніж в носовому секреті. Результати досліджень представлені на рис.2.

Рис. 2 Рівень антитіл в носовому секреті та сироватці крові телят проти вірусу ІРТ-ІПВ, який виявлено в РНГА та РНБА

Однак тенденція зміни рівня антитіл в носовому секреті та сироватці крові була аналогічною при використанні обох реакцій. В 5-денному віці у телят із господарства №2 і у 45-денних телят, які поступали із двох господарств-постачальників, а також в 90-денному віці під час чергового перегрупування тварин, рівень антитіл при використанні даного діагностичного субстрату підвищувався. Встановлена виражена кореляція показників специфічних антитіл в носовому секреті та сироватці крові, які виявлялись симультанно при використанні обох реакцій.

Визначення діагностичного значення даних по симультанному виявленню антитіл в носовому секреті та сироватці крові

Проведено порівняння даних, отриманих під час дослідження тварин в умовно благополучних і неблагополучних з ІРТ-ІПВ господарств. В умовно благополучних (учгосп “Прогрес” і КСП “Україна”) господарствах кореляції між рівнем антитіл в сироватці крові та секретах, що досліджувались, не встановили. Було відмічено, що в учгоспі “Прогрес” серед 56 телят у 10 тварин (18%) рівень антитіл в носовому секреті був вищий, у 33 (59%) - нижчий, ніж в сироватці крові, у 8 тварин (14%) антитіла виявляли тільки в сироватці крові, у 5 (9%) - антитіла були відсутні в усіх субстратах, що досліджувались.

Дослідження, проведені в ВАТ “Правда” і КСП ім. Леніна, також не дозволили встановити кореляцію між титрами антитіл в біологічних рідинах, а показали, що всі тварини мали антитіла і в сироватці крові і в носовому секреті, але у одних титри антитіл були вищі у сироватці крові, а у інших - в носовому секреті. Різниця в рівні антитіл у телят 5-денного віку із ВАТ “Правда” в порівнянні з телятами із КСП “Україна” становила в носовому секреті 4,2 log2 , в сироватці крові - 2,0 log2. Для підтвердження значення тестів, що використовувались, для оцінки епізоотичної ситуації були проведені дослідження в господарствах Луганської, Дніпропетровської і Харківської областей по одночасному виявленню антитіл як у сироватці крові, так і в носовому секреті. Наші дослідження показали, що практично в усіх господарствах були виявлені тварини, які мали титр антитіл у сироватці крові вищий 4,0 log2, крім КСП ім. Б.Хмельницького, Нікопольського району Дніпропетровської області. При порівнянні результатів досліджень проб носового секрету і сироватки крові встановлено, що у тварин із КСП “Лиман”, ім. Фрунзе, ім. Леніна і ВАТ “Правда” титри антитіл в носовому секреті були вищі, ніж у сироватці крові відповідно на 0,9, 0,2, 1,4 і 0,2 log2. При цьому тільки в ВАТ “Правда” і КСП ім. Леніна рівень антитіл в носовому секреті був вищий за 4 log2 ( 4,7 і 5,6 log2) відповідно. Це свідчило про гострий перебіг захворювання тварин саме в цих господарствах. КСП “Лиман”, який формував групи тварин за рахунок власного відтворення, а також КСП ім. Леніна і ВАТ “Правда”, судячи із отриманних даних, є неблагополучними господарствами, де циркулюють високовірулентні штами вірусу ІРТ-ІПВ, але при цьому кількість телят, які мають антитіла в носовому секреті вищі 5,0 log2 в цих господарствах, була різною: по КСП “Лиман” - 30%, ВАТ “Правда” - 50%, КСП ім. Леніна - 90%.

Вивчення можливості передачі вакцинного вірусу невакцинованим тваринам шляхом виявлення антитіл в носовому секреті.

Дослідження проведені на двох групах телят 3,5-місячного віку, у яких специфічні антитіла до початку досліду були відсутні. Вакциновані і невакциновані телята знаходились в сусідніх групових клітках, а контакт відбувався через спільну годівницю. Нами встановлено, що після імунізації у телят 3,5-місячного віку динаміка титрів антитіл в носовому секреті і сироватці крові була аналогічна тій, яку ми виявляли у телят 1,5-місячного віку, а саме через 7 днів після інтраназальної імунізації 77% тварин мали антитіла в носовому секреті з титром 5,0 log2 і вище. До 14-го дня кількість таких тварин зменшилась до 44,4%, в той же час в сироватці крові рівень антитіл збільшився до 5,0 log2 у 50% вакцинованих телят на 14-й день після введення препарату, а саме на тиждень пізніше, ніж в носовому секреті. У телят, які були в контакті з імунізованими тваринами також спостерігалось підвищення титрів антитіл і в носовому секреті і в сироватці крові. Серед тварин, які контактували, 28% телят через 7 днів мали антитіла в носовому секреті вищі 5,0 log2, а через 14 днів кількість таких тварин зменшилась до 4%. В сироватці крові тільки у 14,3% телят рівень антитіл збільшився до 5,0 log2 через 14 днів після контакту. Це свідчить про те, що у вакцинованих тварин в носовому секреті були присутні антитіла, які вироблялись місцево, оскільки рівень їх був вищий, ніж в сироватці крові, на 1,5 log2. Крім того, в носовому секреті був присутній вірус, який передавався контактним шляхом і викликав появу антитіл у тварин в носовому секреті, хоча титри їх були нижчі, ніж у вакцинованих телят на 1,5-2,0 log2 в носовому секреті і на 0,8-1,0 log2 в сироватці крові.

Проведені дослідження ще раз підтверджують, що виявлення антитіл в носовому секреті доцільно проводити в момент появи захворювання, оскільки одержані дані мають перевагу в зв'язку з тим, що титри антитіл в сироватці крові ще знаходяться на низькому рівні.

Цитоморфологічні дослідження при вивченні особливостей репродукції вірусу ІРТ-ІПВ in vitro та in vivo

Була вивчена динаміка утворення тілець-включень при ІРТ-ІПВ, а також виявлені інші морфологічні зміни, які вірус викликає в ураженому моношарі культури клітин при застосуванні перещеплюваних культур клітин нирки теляти (НТ) і вірусу ІРТ-ІПВ, штам “Молдавія”.

Встановлено, що в препаратах ураженого моношару при внесенні вірусу в розведенні 10-1 і 10-2 ТЦД50 / в 0,1см3 цитопатогенна дія (ЦПД) проявлялась стрімко і повна деструкція клітинного моношару наставала через 18-24 години. Показано, що вірус в дозі 10-3 ТЦД50 / 0,1 см3 викликав порушення клітинного шару протягом 48 годин, а при дії менших доз вірусу (10-6) ЦПД розвивалась досить повільно і через 96 годин після аплікації вірусутримуючої рідини моношар ще зберігався, однак при вивченні пофарбованих препаратів виявлялись зміни, характерні для ІРТ-ІПВ: базофільні та оксифільні тільця-включення, симпласти, клітини у стані патологічного мітозу.

Під дією вірусу ІРТ-ІПВ на культуру клітин було відмічено два етапи розвитку ЦПД: неспецифічний і специфічний. Перший етап, під час якого відбувалось дезінтегративне набрякання ядер, яке характеризувалось збільшенням площі ядра і зміненням ядерно-клітинного і ядерно-цитоплазматичного відношення в порівнянні з незараженим клітинним моношаром. При цьому площа ядер збільшувалась з 115,03+13,19 до 203,77+17,44 мкм2, а цитоплазми - зменшувалась з 527,72+ 40,19 до 177,71+20,03, так само як і площа всієї клітини - з 642,72+40,86 до 381,58+33,01 мкм2 (Р>0,999).

У клітин нормального моношару відношення ядра до клітини дорівнювало 0,21, а ядра до цитоплазми - 0,28. У клітин ураженого моношару відношення ядра до клітини дорівнювало 0,53, а ядра до цитоплазми - 1,23. Другий етап характеризувався утворенням симпластів з 2-5 та 6-10 ядрами, гіпертрофією і лізисом ядерець, утворенням базофільних, а потім оксифільних тілець-включень, повним хроматолізом ядер.

Базофільні включення, які виявлялись в уражених клітинах через 9-16 годин після внесення вірусу, мали площу від 3 до 13 мкм2 , а ядерця - від 37 до 54 мкм2 . Оксифільні включення виявлялись через 24 години в ядрах клітин, при цьому вони займали площу від 54 до 130 мкм2 , а ядерця в цей час вже не виявлялись. Ядра в багатьох клітинах були пікнотизовані.

Структурні зміни, які виявлялись при офарбленні препаратів за Селлєрсом, Герлахом, Май-Грюнвальдом, були однотипними, але відрізнялися кольором (блакитно-рожевий при використанні метиленової сині і фуксину, коричнево-бузковий при використанні метиленового синього і еозину) і були ніжнішої структури при офарбленні за Май-Грюнвальдом. При диференціації ядерець від базофільних включень з використанням реакції Браше встановлено, що через 9-16 годин після внесення вірусу в ядрах клітин виявлялись структури, забарвлені в рожевий колір, і з ними поряд - дрібні утворення, відокремлені зоною просвітлення. Через 24 години після початку розвитку ЦПД інтенсивність забарвлення центральної частини ядра, де утримувались великі оксифільні включення, зменшувалась. Для виявлення у включеннях матеріалу, що містить ДНК, препарати офарблювались по Фьольгену і в них були виявлені дрібні круглясті утворення по 2-4 в ядрі, які сприймали фарбу інтенсивніше, ніж хроматин. А тільця-включення, які виявлялись через 24 години і розташовувались в центрі ядра, забарвлювались менш інтенсивно, ніж хроматин. Цитоморфологічний метод діагностики був використаний нами при вивченні польових штамів вірусу ІРТ-ІПВ. Показано, що остаточний діагноз на ІРТ-ІПВ було встановлено в ВАТ “Правда” в результаті виділення вірусу з використанням культури клітин НТ.

Виявлення присутності вірусу в ураженій культурі клітин традиційним методом - шляхом визначення ЦПД на 3-4 хреста під малим збільшенням мікроскопу з наступною ідентифікацією виділеного агенту в РН на культурі клітин - вимагало на 7 днів більше часу, ніж цитоморфологічний метод для індикації вірусу з наступною ідентифікацією його в РІФ.

Було проведено також вивчення цитоморфологічних змін епітелію респіраторного тракту при ІРТ-ІПВ у телят з різним імунним фоном. Найчіткіші зміни в клітинах слизової оболонки носа, які визначали через 7 та 14 днів після імунізації, були виявлені у телят, інтраназально вакцинованих проти ІРТ-ІПВ вірус-вакцинами.

Зміни, які виникали через 7 днів після введення препарату, супроводжувались характерною дією вірусу на клітини. При цьому виявляли 54% епітеліальних клітин, які були морфологічно змінені. Базофільні утворення виявлялись в ядрах 3% цих клітин, в 15% розміщувались оксифільні тільця-включення, а хроматоліз ядер і загибель у 12% клітин від числа патологічно змінених були кінцевим етапом репродукції вірусу.

При дослідженні матеріалу через 15 днів після імунізації телят, з,ясували, що співвідношення клітин було трохи інше: виявляли 35% морфологічно нормальних і 28% змінених клітин. Базофільні тільця-включення були виявлені у 15% клітин, оксифільні - у 8%, хроматоліз ядра - у 5% епітеліальних клітин.

вірус антитіло репродукція

ВИСНОВКИ

1. Інфекційний ринотрахеїт-пустульозний вульвовагініт широко розповсюджений серед поголів,я великой рогатої худоби в господарствах Харківської, Луганської та Дніпропетровської областей. Рання діагностика ІРТ-ІПВ шляхом виявлення антитіл не розроблена, а використання експрес-методів за знаходженням збудника безпосередньо в патологічному матеріалі в зв,язку з можливою персистенцією вірусу не завжди дозволяє швидко ставити діагноз, що стримує проведення заходів.

2. Вивчена та встановлена можливість використання носового, піхвового секретів та сльози для виявлення специфічних антитіл за допомогою РНГА та РНБА у телят, вакцинованих вірус-вакциною, а також інфікованих польовими штамами вірусу ІРТ-ІПВ для ранішньої діагностики цього захворювання.

3. У вакцинованих тварин строки появи антитіл в дослідних біологічних рідинах організму та їх рівень залежать від способу введення вакцини. Після інтраназального введення вірус-вакцини проти ІРТ-ІПВ рівень антитіл в носовому секреті зростає на 3-й день до 5,0 log2 , на 14-й день - до 7,0 log2 , а потім знижується на 45-й день до 3,0 log2 . В сироватці крові відбувається підвищення титрів антитіл, але їх рівень нижчий, ніж в носовому секреті на 3-й і 14-й дні на 3,0-4,0 log2. Після підшкірного способу імунізації антитіла в носовому секреті виявлені в титрах від 1,0 до 4,2 log2 , а у сироватці крові їх рівень був вищий на 1,0-2,0 log2.

4. Специфічні антитіла в носовому секреті у телят із господарств, неблагополучних з ІРТ-ІПВ, виявляли за допомогою РНГА в титрах від 1 до 7,0 log2 , в сльозі та піхвовому секреті від 1,0 до 2,0 log2, а при використанні РНБА - від 1,0 до 5,0 log2 в носовому секреті і від 0,2 до 1,0 log2 - в піхвовому секреті і сльозі.

5. Виявлення антитіл в носовому секреті дозволяє розпізнавати гострий перебіг захворювання при титрах від 4,0 до 7,0 log2 і латентну циркуляцію вірусу в господарстві при рівні антитіл від 1,0 до 3,0 log2 . Більш високий рівень антитіл в носовому секреті ( 4,0 log2 і вище) в порівнянні з сироваткою крові ( до 4,0 log2 ) свідчить про свіжі випадки захворювання, оскільки титр антитіл в носовому секреті підвищується через 3 -7 днів після проникнення вірусу в організм і знаходиться на високому рівні до 21 дня.

6. При контакті телят, які були вакциновані вірус-вакциною “Бівак”, з невакцинованими тваринами встановлена передача вірусу. При цьому в носовому секреті, титр антитіл через 7 днів після контакту зростав до 3,5 log2 , а у вакцинованих збільшувався до 6,0 log2 .

7. Вірус ІРТ-ІПВ викликає виражену цитопатогенну дію на клітини перещеплюваних ліній нирки теляти (НТ), яка супроводжується дезінтегративним набряканням ядер, закругленням клітин, утворенням симпластів з наступною повною деструкцією клітинного моношару.

8. Тільця-включення при розвитку ЦПД в культурі клітин НТ виявляються у вигляді базофільних внутрішньоядерних утворень через 9 годин, а оксифільних - через 20 годин після аплікації вірусу ІРТ-ІПВ на клітинний моношар. Для диференціації базофільних включень від ядерець необхідно проводити офарблення за Браше, а для виявлення ДНК-утримуючого матеріалу у включеннях використовувати реакцію Фьольгена.

9. Застосування цитоморфологічного методу з використанням перещеплюваної культури клітин ПТ по виявленню ЦПД вірусу уже через 16-36 годин після кожного пасажу дозволяє скоротити строк постановки діагнозу на ІРТ-ІПВ.

10. Цитоморфологічний метод рекомендується використовувати для контролю вакцин, що розробляються, введених інтраназально, так як через 7 і 15 днів після імунізації під дією вірусу в ядрах епітеліальних клітин слизової оболонки носа можна виявити базофільні (від 3 до 15%) і оксифільні (від 15 до 8%) включення.

СПИСОК НАУКОВИХ ПРАЦЬ, ОПУБЛІКОВАНИХ ЗА ТЕМОЮ ДИСЕРТАЦІЇ

1. Матковська С.Г., Апатенко В.М. Нове в діагностиці та лікуванні асоційованої респіраторної інфекції великої рогатої худоби // Ветеринарна медицина України. - К., 1998. - № 6. - С. 25.

2. Матковская С.Г. Использование цитоморфологического метода в вирусологической диагностике инфекционного ринотрахеита // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Харків, 1998. - С. 61-67.

3. Матковская С.Г. Обнаружение антител к вирусу инфекционного ринотрахеита в носовом секрете с помощью РНГА и РНБА // Ветеринарна медицина: Міжвід. темат. наук. зб. - Харків, 1998. - С. 67-71.

4. Матковскька С.Г. Вивчення цитопатогенної дії вірусу інфекційного ринотрахеїту в культурі клітин нирки теляти // Проблеми зооінженерії та ветеринарної медицини: Зб. наук. праць Харк. зоовет. ін-ту. - Харків: РВВ ХЗВІ, 1998. - Вип. 3 (27). - С. 256-259.

5. Фоменко С.Г. Оценка методов индикации внутриядерных телец-включений при инфекционном ринотрахеите крупного рогатого скота // Совершенствование мер борьбы и профилактики с.-х. животных: Сб. науч. тр. / Харьков. с.-х. ин-т им. В.В. Докучаева. - Харьков, 1990. - С. 37-41.

6. Фоменко С.Г. К оценке методических подходов в диагностике инфекционного ринотрахеита крупного рогатого скота // Проблемы научного обеспечения животноводства Молдавии: Тез. докл. конф. / Молд. НИИ животноводства и ветеринарии. - Кишинев, 1990. - С. 96.

7. Матковская С.Г. Цитологический метод диагностики вирусных респираторных заболеваний телят // Проблемы и перспективы паразатоценологии: Матер. V межсъезд. конф. паразитоценологов Украины 29-30 окт.1997. - Луганск, 1997. - С. 105.

Размещено на Allbest.ru