Нові моноклональні антитіла ІПО-38 до ядерного антигену, що асоційований з проліферацією нормальних та злоякіснотрансформованих клітин

Размещено на http://www.allbest.ru/

Національна академія наук України

Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології

ім. Р.Є. Кавецького

Міністерство охорони здоров`я України

Український науково-дослідний інститут онкології та радіології

МІХАЛАП СВІТЛАНА ВІТАЛІЇВНА

УДК: 616-006:576.38:616-097

НОВІ МОНОКЛОНАЛЬНІ АНТИТІЛА ІПО-38 ДО ЯДЕРНОГО АНТИГЕНУ, ЩО АСОЦІЙОВАНИЙ З ПРОЛІФЕРАЦІЄЮ НОРМАЛЬНИХ ТА ЗЛОЯКІСНОТРАНСФОРМОВАНИХ КЛІТИН

14.01.07 - Онкологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата біологічних наук

Київ - 1998

Дисертацією є рукопис

Робота виконана в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України.

Науковий керівник - доктор медичних наук, професор Глузман Данило Фішелевич, завідувач відділу імуноцитохімії.

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України.

Офіційні опоненти - доктор медичних наук, професор Бережна Нінель Міхайлівна, провідний науковий співробітник відділу біології пухлинної клітини.

Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України.

- доктор біологічних наук Мінченко Жанна Миколаївна, керівник лабораторії тканинного типування та цитохімії Науково-дослідного інституту клінічної радіології НЦРМ АМН України.

Провідна установа - Львівський державний медичний університет ім. Данила Галицького МОЗ України, кафедра онкології.

Захист відбудеться “_9_”__грудня__199 р. о 13.30 на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 26.155.01 в Інституті експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України (252022, м.Київ, вул.Васильківська, 45).

З дисертацією можна ознайомитись в бібліотеці ІЕПОР ім.Р.Є. Кавецького.

Автореферат розісланий “_7_”__листопада___199_р.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради доктор медичних наук І.В. Абраменко

ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА РОБОТИ

Актуальність теми. Закономірності процеса проліферації пухлинних клітин - один із основних критеріїв динаміки розвитку злоякісних новоутворень. Уявлення про кінетику проліферативних процесів постійно поширюється і уточнюється. Дослідження останніх років йдуть у двох напрямках. Перший - це вивчення молекулярних механізмів проліферації із з`ясуванням ролі окремих клітинних субстанцій в регулюванні цього процесу, а також впливу на нього різних екзогенних і ендогенних факторів (Pines J. et al., 1995; Brechot C., 1997). Другий - дослідження особливостей проліферації пухлинних клітин у хворих з різними новоутвореннями з метою використання цієї інформації для прогнозування перебігу захворювання і корекції схем терапії. Існує ряд робіт, результати яких свідчать про наявність кореляції між інтенсивністю проліферативного процесу і перебігом захворювання (Котельников В.М. и соавт., 1997; O'Relly S.M. et al., 1992). Такі дослідження дали підставу розглядати клітинну проліферацію як прогностичний критерій при новоутвореннях різної локалізації і гістологічної структури.

До недавнього часу існував ряд методів для оцінки кінетики проліферації, серед яких метод авторадіографії з використанням тимідина, поміченого тритієм (Malaise E.P. et al., 1973), проточна цитометрія з визначенням вмісту ДНК у ядрах клітин (Baisch H. et al., 1975), імпрегнація нуклеол азотнокислим сріблом (Busch H. et al., 1979).

Розробка гібридомної технології отримання моноклональних антитіл (МКАТ) (Kohler G., Milstein C., 1975) надала вченим можливість одержувати нові унікальні високоспецифічні реагенти, що дозволяють візуалізувати різні антигени як на поверхні клітин, так і в цитоплазмі і ядрі (Marx U. et al., 1997). Деякі з цих антигенів є циклозалежними, що дозволяє використовувати отримані до них МКАТ для вивчення проліферації нормальних і злоякіснотрансформованих клітин. Так, були отримані моноклональні антитіла до антигенів з характерною експресією у клітинах, що проліферують. Серед них широко відомі МКАТ Кі-67 (Gerdes J . et al., 1984), антитіла до PCNA (Takasaki Y. et al., 1984), рецептора трансферину (Judd W., 1980), ДНК полімераз (Alama A., 1987) та (Lee, M.Y., 1989), які знайшли використання і у клінічній практиці. Але вказані МКАТ виявляють антигени, які експресовані в основному у пізній G1, S та М фазах клітинного циклу. В зв`язку з цим рання G1 залишається поза аналізом, що є важливим недоліком цих МКАТ.

Тому створення нових МКАТ до антигенів, які експресуються протягом всього періода ділення клітини, а також вивчення можливості використання їх поруч з морфологічними, цитохімічними та імунохімічними ознаками для характеристики патологічних клітин хворих на пухлини різної локалізації є перспективною і актуальною задачею сучасної онкології.

Зв`язок роботи з науковими програмами, планами, темами.

Дисертаційна робота виконана у Відділі імуноцитохімії Інституту експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН Украіни згідно з планами науково-дослідної роботи за темами 0.69.05.02.01 Д(с), та 0194UO17021, шифр проблеми 2.28.2.8.

Мета і задачі дослідження.

Мета роботи полягала у створенні нових реагентів - моноклональних антитіл до антигену, що експресується у проліферуючих клітинах, а також з`ясування можливості використання їх для вивчення і діагностики пухлин людини різної локалізації і гістологічної структури.

Задачі дослідження:

1. Отримання МКАТ проти ядерного антигену, який експресується у проліферуючих клітинах.

2. Визначення специфічності отриманих МКАТ з використанням ліній клітин різного походження, мононуклеарів периферичної крові, кровотворних та лімфоїдних органів практично здорових донорів та хворих на різні форми лімфопроліферативних захворювань, а також криостатних зрізів пухлин та гістологічно незмінених тканин.

3. Характеристика антигену, що виявляють отримані МКАТ.

4. З`ясування можливості використання отриманих моноклональних антитіл для оцінки рівня проліферації клітин у складі пухлин різної локалізації.

Наукова новизна одержаних результатів.

Вперше отримані та охарактеризовані МКАТ, що названі ІПО-38, які виявляють ядерний антиген, експресія котрого спостерігається тільки у проліферуючих клітинах. Доведено, що антиген, який розпізнається МКАТ ІПО-38, не є ідентичним раніш описаним циклозалежним антигенам, таким як PCNA, Ki-67. Використання цих МКАТ дає можливість характеризувати проліферативну активність пухлинних клітин.

Практичне значення одержаних результатів. Показана можливість використання вищезазначених антитіл для визначення проліферативної активності злоякіснотрансформованих клітин незалежно від локалізації пухлинного процесу.

Особистий внесок здобувача.

Дисертант безпосередньо приймала участь в отриманні гібридоми, що секретують МКАТ ІПО-38, а також у вивченні специфічності цих МКАТ ; самостійно провела біохімічні та імунохімічні дослідження, які стосуються з`ясування природи антигену, що виявляють МКАТ ІПО-38. Основні ідеї, висновки та рекомендації розроблені і оформлені дисертантом самостійно.

Апробація результатів дисертації.

Матеріали роботи були представлені та обговорені на ІІ Національному конгресі молодих вчених-медиків України (Київ, 1994), І національній практичній конференції з проблем ВІЛ/СНІД (Київ, 1995); VI International Workshop and Conference on Human Leucocyte Differentiation Antigens (Кобе, Япония, 1996); 8th European Congress on Biotechnology (Будапешт, 1997).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 6 наукових статей в провідних фахових виданнях, матеріалах і тезах 8 конференцій.

Структура і обсяг дисертації. Дисертаційна робота має 132 сторінки, складається із вступу, огляду літератури, 6 розділів з аналізом і узагальненнями результатів власних досліджень, висновків, списку використаної літератури (212 першоджерел, з них українською та російською мовами - 24, іноземними мовами - 188). Робота ілюстрована 18 рисунками, 5 таблицями.

ЗМІСТ РОБОТИ. МАТЕРІАЛИ І МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕННЯ

Для отримання моноклональних антитіл ІПО-38 був використаний метод соматичної гібридизаці у моношарі, який запропонували Davidson, Gerald (1977). Клітинами-партнерами при гібридизацї були клітини мишиної мієломи P3-X63-Ag8.653А та спленоцити миші-самки лінії BALB/c, яку попередньо імунізували клітинами селезінки хворого на волосатоклітинний лейкоз. Імунізацію проводили три рази, вводячи внутрішньочеревинно по 8х106 клітин з інтервалом 30 днів, останню імунізацію проводили у вену за 4 дні до проведення гібридизацї у кількості 18х106 клітин. Соматичну гібридизацію клітин проводили за допомогою 50% поліетиленгліколя (мол.маса 2000). Після селекції гібридом у середовищі, що вміщувало гіпоксантин, аміноптерин, тимідин, клонування і реклонування методом лімітуючих розведень, було відібрано штам гібридних клітин, що продукували моноклональні антитіла, позначені як ІПО-38. Дослідження виконані разом з к.б.н. Сидоренко С.П., к.м.н. Вєтровою О.П., к.б.н. Шлапацькою Л.М. та к.б.н. Бердовою Г.Г.. Електронномікроскопічні дослідження виконані при участі к.б.н. Юрченко О.В.

Вивчення специфічності МКАТ проводили на 11 клітинних лініях людини різного походження, що вміщували лінії В-клітинного походження (Raji, Ramos), Т-клітинні (MOLT-4, Jurkat, CEM, HUT), лінії клітин нелімфоїдного походження (K562, U-937, HL-60, MeWo, A-431), а також двох лініях клітин мишей (L-929, OH-1); на мононуклеарах периферичної крові 5 практично здорових людей, 79 хворих на різні форми гемобластозів, клітинах лімфовузлів 10 хворих на неходжкінські злоякісні лімфоми і 4 хворих на лімфогранулематоз. Для аналізу було використано непрямий варіант імунофлуоресцентного метода на живих клітинах. Діагнози лейкозів та лімфом були поставлені на основі стандартних морфологічних, клінічних та цитохімічних критеріїв у співробітництві з д.м.н. Л.М. Скляренко та к.б.н. В.А. Надгорною при консультації д.м.н., проф. Д.Ф. Глузмана.

Для ідентифікації проліферативного пула клітин у складі лімфовузлів при реактивній гіперплазії лімфоїдної тканини, хронічному неспецифічному лімфаденіті, при неходжкінських злоякісних лімфомах, а також пухлинної тканини у випадках раку шлунку, карциноми кишечника пухлин молочної залози було використано імуногістохімічний ПАП метод на кріостатних зрізах.

Для з`ясування особливостей експресії антигена, що розпізнають МКАТ ІПО-38, в ході прогресії клітинного циклу були використані лімфоцити практично здорових людей, стимульовані за допомогою фітогемаглютиніна (Ling, 1968). Для врахування кількості ІПО-38+ клітин в залежності від фази клітинного цикла було використано біпараметричне ДНК/ІПО-38 фарбування (Darzynkiewicz Z., 1980). Реакцію враховували за допомогою проточного цитометра АТС 3000, що забезпечений аргоновим лазером 2025 (Spectra Phisics). Результати зображені у вигляді біпараметричних гістограм. Кожного разу враховувалось не менш ніж 50000 подій. Дослідженя проведено на базі лабораторії гематології госпиталю Haut Lebeque (Бордо, Франція).

Молекулярну масу антигена було визначено за допомогою Western-blot аналіза виконаного після проведення електрофореза в поліакриламідному гелі в присутності DS-Na з використанням лізатів клітин лінії Raji.

Цифровий матеріал, що представлений у дисертаційній роботі, підлягав варіаційно-статистичній обробці (Камінський Л.С., 1964).

РЕЗУЛЬТАТИ ДОСЛІДЖЕНЬ

Отримання штаму гібридних клітин. Для отримання гібридоми-продуцента МКАТ ІПО-38 в якості матеріала для імунізації було використано клітини хворого на волосатоклітинний лейкоз. При гібридизації вже через 5 хвилин спостерігались тісні контакти між клітинами мієломи та спленоцитами. Площина дотику при цьому відрізнялась від точкового поєднання мембран двох клітин у кількох місцях до контакта мембран з їх частковим розчиненням. При подальшому злитті цитоплазми утворювались двоядерні гетерокаріони, що вміщували ядра лімфоцита та мієломної клітини У цій культурі також можна було зустріти гібридні клітини типа лімфоцит-лімфоцит та мієлома-мієлома. Через 40 хвилин спостерігалась наявність дійсно гібридних клітин - синкаріонів.

В результаті селекції змішаної культури клітин, що продукували і не продукували антитіла у ГАТ та ГТ середовищах, а також клонування і реклонування методом лімітуючих розведень, було відібрано клон гібридоми 7F10, що продукувала антитіла, позначені як ІПО-38. Ці МКАТ реагували з антигеном клітин селезінки хворого на волосатоклітинний лейкоз, кількість реагуючих клітин становила 85%. При цьому спостерігалась реакція у вигляді гранул, що знаходились у ядрах.

Клітини гібридоми 7F10 добре росли у пластикових флаконах, де утворювали щільний моношар, та у вигляді асцитичної рідини у черевній порожнині мишей лінії BALB/c. На 3-4 добу культивування секреція МКАТ ІПО-38 становила 15-20 мкг на 1 мл культурального середовища. При рості у вигляді асциту цей показник досягав 8 мг на 1 мл асцитичної рідини.

Шляхом ELISA тесту з використанням антиідиотипічних сироваток, люб`язно наданих Клімовічем В.Б. (Центральний НДІ рентгенології-радіології МОЗ Росії, Санкт-Петербург), було встановлено, що антитіла ІПО-38 належать до імуноглобулінів класу М.

За цитоморфологічними показниками клітини гібридоми 7F10 нагадують лімфобласти середнього розміру з високим ядерно-цитоплазматичним відношенням, базофільною цитоплазмою, грубою структурою хроматину. При цитохімічному випробовуванні клітин не виявлено активності ферментів пероксидази та кислої фосфатази. Активність кислої неспецифічної естерази значно нижча, ніж в клітинах, які були використані для гібридизації. Помірна гранулярна реакція на неспецифічну -нафтілацетатестеразу зберегалась при дії інгібітора NaF, PAS-реакція - помірно-дифузна.

Характеристика антигена, що розпізнають МКАТ ІПО-38. Для ідентифікації антигена, що його розпізнають МКАТ ІПО-38, було проаналізовано ядерний екстракт клітин лінії Raji. В результаті проведення Western-blot аналіза було з`ясовано, що молекулярна маса антигена, що розпізнають досліджувані МКАТ, дорівнює 14-16 kDa.

Для вивчення циклозалежних змін в експресії антигена, що розпізнається МКАТ ІПО-38, в якості моделі переходу клітин із стану спокою (G0) до проліферативного (G1, S, G2, M) було використано лімфоцити практично здорових людей, стимульовані фітогемаглютиніном протягом 0, 12, 18, 24, 36 та 48 год; реакцію врахувували на проточному цитометрі. Результати були зображені у вигляді біпараметричних гістограм.

Рис.1 являє собою різні біпараметричні гістограми, одержані після подвійного ДНК/ІПО-38 фарбування стимульованих лімфоцитів, і показує, що клітини у стані спокою, тобто у G0 фазі клітинного циклу, не

експресують вишезазначений антиген. Після стимуляції протягом 12 годин (початок G1 фази мітотичного циклу) клітини починають експресувати антиген, який виявляють антитіла ІПО-38.

Вимірюванням інтенсивності фарбування клітин в ході прогресії клітинного цикла було доведено, що рівень експресії антигена, який виявляють МКАТ ІПО-38, залишається постійним вздовж G1, S та G2 фаз циклу, а у мітозі збільшується до 400% від вихідного рівня.

Для вивчення динаміки змін в експресії антигену, що його виявляють антитіла ІПО-38, під час входження до G1 фази клітинного циклу було використано клітини лінії К562, які оброблювались колцемідом (реагент блокує клітини у мітозі), щоб затримати входження клітин до G1 фази мітотичного циклу. Рис. 2 являє собою ДНК/ІПО-38 біпараметричні гістограми, які описують експресію антигена у клітинах через 0, 1, 2, 4, 6 та 8 годин після впливу колцеміда. Як видно з цього рисунка, кількість фарбованих клітин, що знаходяться у G1 фазі, поступово зменшується, в той час як кількість ІПО-38+ клітин, що знаходяться у інших фазах клітинного цикла, залишається постійною. З цього можна зробити висновок, що антитіла ІПО-38 фарбують клітини вздовж всієї G1 фази клітинного цикла. За допомогою комп`ютерного аналіза було враховано кількість ІПО-38+ клітин, що знаходяться у G1 фазі клітинного цикла. Для порівняння аналогічний експеримент було виконано з використанням МКАТ Кі-67, які розпізнають антиген, що починає експресуватись у пізній G1 фазі клітинного циклу. Продемонстровано, що процент ІПО-38+ клітин поступово зменшується, у той час, як кількість Кі-67+ клітин в інтервалі 1-3 години залишається постійною.

Наступним етапом стало з`ясування, наскільки ці антитіла можуть бути використаними для диференціювання проліферуючих клітин і тих, що знаходяться у стані спокою. З цією метою було здійснено фарбування клітин кісткового мозоку практично здорової людини та хворого на гострий лімфобластний лейкоз, причому аналізувалась популяція клітин у G0 та G1 фазах клітинного циклу. Як можна бачити з монопараметричних гістограм, приведених на рис. 3, ІПО-38 дозволяє проводити таке диференціювання на відміну від раніш відомих МКАТ Кі-67 .

Таким чином, в результаті виконання цієї частини роботи було з`ясовано, що МКАТ ІПО-38 розпізнають антиген, відсутній у клітинах, які знаходяться у стані спокою і починає експресуватись у ранній G1 фазі клітинного циклу.

Вивчення специфічності МКАТ ІПО-38 на лініях клітин різного походження, мононуклеарах периферичної крові практично здорових людей і хворих на різні форми гемобластозів, а також на кріостатних зрізах пухлин різної локалізації. Для визначення специфічності МКАТ ІПО-38 було використано 11 ліній клітин людини різного походження та 2 лінії клітин мишей. Антиген, що виявляють МКАТ ІПО-38, розташований у вигляді гранул у ядрі. В окремих клітинах спостерігається яскрава реакція по всій клітині.

Визначено, що антиген, який виявляють антитіла ІПО-38, не є видо- та лінійноспецифічним, оскільки його експресію можна спостерігати на клітинах ліній різного походження як людини, так і мишей. При збільшенні густини клітин відбувається вичерпування ростових факторів, зниження рН, проліферативний потенціал клітин гальмується, і експресія антигену майже не спостерігається. При додаванні свіжого культурального середовища відбувається поновлення проліферації клітин і одночасове збільшення ІПО-38+ клітин. Отримані данні дали можливість припустити, що МКАТ ІПО-38 розпізнають антиген, експресія якого залежить від проліферативного потенціала клітин.

Специфічність МКАТ ІПО-38 вивчалась також на мононуклеарах периферичної крові хворих на різні форми гемобластозів. Діагнози було встановлено на основі морфологічних, цитохімічних і імунологічних критеріїв. Результати представлені в табл.1.

Пре-В-варіант ГЛЛ було діагностовано у 6 хворих, яких розподілили на дві групи. В бластних клітинах периферичної крові хворих І групи експресія антигена, що виявляється МКАТ ІПО-38, була слабо вираженою і складала 5-10% (3 хворих), а у хворих ІІ групи (3 хворих) кількість ІПО-38+ клітин складала 75-95%. Велику кількість ІПО-38+ клітин (84%) виявлено у 2 хворих на зрілий В-ГЛЛ. У деяких випадках Т-ГЛЛ, про-В-ГЛЛ відмічено слабку реакцію клітин патологічного клона з МКАТ ІПО-38. Загальна кількість позитивно реагуючих клітин при цих варіантах ГЛЛ становила 3-8%.

Таблиця 1. Взаємодія МКАТ ІПО-38 з кровотворними клітинами периферичної крові практично здорових людей та хворих на різні форми гемобластозів

При вивченні клітин хворих з деякими варіантами ГМЛ виявлена гетерогенність експресії антигену, що розпізнають МКАТ ІПО-38, в межах кожного з варіантів М1, М2, М4, М5. З антитілами реагували 2-8% бластних клітин хворих ГМЛ (М1, М2); при варіанті ГММЛ (М4) кількість ІПО-38+-клітин становила 10-90%, а у випадку ГМонЛ (М5)- 5-80%.

На основі морфологічних та цитохімічних особливостей, імунологічного фенотипа лімфоцитів периферичної крові хворих ХЛЛ, а також виходячи з особливостей експресії антигену, що розпізнають МКАТ ІПО-38, їх розподілили на дві групи. Першу групу склали 6 хворих, патологічні клітини яких були представлені малими та середніми лімфоцитами з великим ядерно-цитоплазматичним відношенням, що мають ядро закругленої форми, часом з виямкою. Реакція на кислу фосфатазу і неспецифічну естеразу у цих клітинах була негативною, помірно-дифузною чи мілко-гранулярною, що є характерною рисою В-лімфоцитів, які знаходяться у ранній антигензалежній чи пізній антигеннезалежній стадії диференціювання. Фенотип таких клітин був наступним: HLA-DR+, CD5+, CD19+, CD20+, CD10- , cyIg-, sIg+. Електронномікроскопічні дослідження продемонстрували, що більшість лімфоцитів периферичної крові хворих цієї групи були представлені малими лімфоцитами округлої форми з невеликою кількістю мікровиростів цитоплазми. Найбільш типовими особливостями клітин була невелика кількість гетерохроматину, переважно розташованого біля ядерної мембрани; у вузькому обідку цитоплазми лімфоцитів клітинні органели виражені слабо; гранулярний ендоплазматичний ретикулум представлений в лімфоцитах 2-5 мілкими везікулами з рибосомами на поверхні мембран. Інколи в невеликій кількості лімфоцитів зустрічались короткі розширені канальці гранулярного ендоплазматичного ретикулума.

Для другої групи хворих (8 хворих) характерною була наявність лімфоцитів з достатньо високою ступінню плазматизації цитоплазми. У багатьох лімфоцитах знайдено високу активність кислої фосфатази з розподіленням продукта у вигляді одиничних крупних гранул і помірна активність неспецифічної естерази. Патологічні клітини хворих другої групи були більш зрілими і мали наступний фенотип: HLA-DR+, CD5+, CD19+, CD20+, CD10-, cyIg+, sIg+. Результати електронномікроскопічних досліджень морфології патологічних лімфоцитів другої групи хворих на ХЛЛ дозволяють вважати ці клітини більш диференційованими. Ядро з гарно вираженим гетерохроматином займало більшу частину клітин. В цитоплазмі, що містить помірну кількість рибосом, виділявся добре розвинутий гранулярний ендоплазматичний ретикулум, представлений довгими вузькими канальцями. Плазматична мембрана лімфоцитів хворих ХЛЛ другої групи, як правило, не гладка і мала різноманітні вирости з різною довжиною мікроворсинок.

Антиген, що виявляється МКАТ ІПО-38, експресувався в ядрах значної частини хворих при першому варіанті ХЛЛ. Клітини хворих при другому варіанті з фенотипом зрілих В-лімфоцитів, що знаходяться на пізній антигензалежній стадії диференціювання, не реагували з МКАТ ІПО-38. Таким чином, у хворих ХЛЛ встановлено кореляцію між експресією антигену, що його виявляють МКАТ ІПО-38, та ступенем диференціювання клітин патологічного клона.

Встановлено, що більшість клітин крові хворих на волосатоклітинний лейкоз експресує антиген, що виявляється МКАТ ІПО-38.

Клітини, що позитивно реагують з МКАТ ІПО-38, знайдені і у хворих НЗЛ. По кількості ІПО-38+ клітин їх розподілили на дві групи. До І групи увійшли 4 хворих з кількістю ІПО-38+ клітин - 3-10%. У той же час вміст позитивно реагуючих клітин у хворих ІІ групи (6 хворих) складав 50-92%. Напевно, ці розходження пов`язані з проліферативною гетерогенністю у межах і між гістологічними групами НЗЛ, що впливає на перебіг захворювання. При різних гістологічних варіантах ЛГМ у пошкоджених лімфатичних вузлах відмічено високий вміст (30-75%) ІПО-38+ клітин.

Для підтвердження того, що антиген, який розпізнають МКАТ ІПО-38, не є тканиноспецифічним, була вивчена його експресія на кріостатних зрізах пухлин різної локалізації. Для цього було використано імуногістохімічний ПАП метод; паралельно аналізувались клітини гістологічно незмінених тканин.

При реактивній гіперплазії лімфоїдної тканини, хронічному неспецифічному лімфаденіті, а також при неходжкінських злоякісних лімфомах біля 89% клітин лімфатичних вузлів давали позитивну реакцію з МКАТ ІПО-38. Фарбований у коричневий колір продукт реакції був локалізований у ядрах.

При фарбуванні пухлинної тканини низькодиференційованого залозистого рака шлунка значна частина клітин позитивно реагувала з МКАТ ІПО-38, причому інтенсивність реакції різнилась у різних ділянках. Дослідження нормальної слизової оболонки шлунку продемонструвало незначну кількість ІПО-38+ клітин.

Всі злоякіснотрансформовані епітеліальні клітини у випадку помірно-диференційованого раку кишечника давали позитивну реакцію з МКАТ ІПО-38. У той же час тільки поодинокі клітини гістологічно незміненої слизової оболонки прямої кишки реагували з вищезазначеними антитілами.

При інфільтрованій формі аденокарциноми молочної залози у ядрах всіх пухлинних клітин, що складали більшість у цьму випадку, спостерігалась яскраво виражена реакція з МКАТ ІПО-38. При фіброаденоматозі молочної залози частина клітин, але не всі, були ІПО-38+. При аналізі гістологічно незміненої тканини молочної залози позитивну реакцію з МКАТ ІПО-38 можна було спостерігати тільки у ділянках, де відбувається поновлення клітин.

гістологічний реагент моноклональний антиген

Висновки

1. За допомогою гібридомної технології отримані МКАТ ІПО-38 проти антигену проліферуючих клітин, молекулярна маса якого дорівнює 14-16kDa.

2. Антиген, що розпізнається МКАТ ІПО-38, не є видо- і тканиноспецифічним. Його експресія спостерігається у ядрах клітин ліній різного походження; рівень експресії залежить від активності проліферації.

3. Встановлено, що антиген ІПО-38 відсутній у клітинах, що знаходяться у стані спокою, і починає експресуватись у ранній G1 фазі клітинного циклу, досягаючи максимума у мітозі. Ці данні отримані за допомогою проточної цитометрії на бласттрансформованих шляхом ФГА мононуклеарах периферичної крові практично здорових донорів.

4. Антиген відсутній у мононуклеарах і гранулоцитах крові практично здорових людей. Кількість ІПО-38+ клітин при різних варіантах гострих лейкозів обумовлена проліферативною активністю лейкозних клітин. При ХЛЛ встановлена кореляція між рівнем експресії антигену та ступенем диференціювання патологічних клітин.

5. Антиген ІПО-38 експресується пухлинними клітинами новоутворень різної локалізації. Патологічно незмінені тканини в своїй більшості були ІПО-38 - негативними.

6. МКАТ ІПО-38 можуть бути використаними для визначення пула проліферуючих клітин у складі пухлин різної локалізації.

СПИСОК ОПУБЛІКОВАНИХ НАУКОВИХ ПРАЦЬ

1. Сидоренко С.П., Шлапацкая Л.Н., Ветрова Е.П., Бердова А.Г., Юрченко О.В., Кленова Т.Т., Михалап С.В., Абраменко И.В., Глузман Д.Ф. Моноклональные антитела ИПО-38 к ядерному антигену пролиферирующих клеток // Эксперим. онкология. - 1994. -Т.16, №2-3. - С.145-150.

2. Mikhalap S.V, Lopez F., Shlapatskaya L.N., Yurchenko O.V., Berdova A.G., Gluzman D.F., Belloc F., Sidorenko S.P.. Monoclonal antibody IPO-38 recognizes a novel nuclear antigen of proliferating cells// Leucocyte Typing VI. - New York-London: Garland Publishing Inc. - 1997. - P.609-610.

3. Sidorenko S.P., Chu G., Draves K.E., Pinchuk L.M., Mikhalap S.V., Shao S., Clark E.A. The IPO-3/SLAM surface molecule associates with protein kinase activities and CD45 in B lymphocytes// Leucocyte Typing VI. - New York-London: Garland Publishing Inc. - 1997. - P.584-585.

4. Gololobov G.V., Mikhalap S.V., Starov A.V., Kolesnikov A.F., Gabibov A.G. DNA - Protein Complexes Natural Targets for DNA-Hydrolysing Antibodies// Applied Biochemistry and Biotechnology. - 1994.- V.47, №2-3. - P. 305-315.

5. Михалап С.В., Хромяк В.Н., Шлапацкая Л.Н., Бердова А.Г., Базыка Д.А., Глузман Д.Ф. Получение и первичная характеристика моноклональных антител ИПО-М6// Эксперим. онкология. -1995.- Т.17., №3.-С.242

6. Абраменко И.В., Михалап С.В., Глузман Д.Ф., Симонэ М., Муттэ А. Апоптоз лимфоцитов периферической крови человека при воздействии малых доз радиации// Эксперим. онкология. -1995.- Т.17, №3.-С.241

7. Lopez F., Mikhalap S., Belloc F., Lacombe F., Gluzman D., Comparison of three monoclonal antibodies (Ki-67, MIB1, IPO-38) for flow cytometric identification of proliferating cells// Biol Cell. -1994. - V.79 - P.234-235

8. Шлапацька Л.М., Міхалап С.В. Моноклональні антитіла серії ІПО в діагностиці злоякісних захворювань крові і щитовидної залози//Тез.доп. ІІ Національного Конгресу молодих вчених-медиків України. 18-19 травня 1994.- Київ- 1994. - С.12.

9. Глузман, Д.Ф., Ветрова, О.П., Сидоренко, С.П., Бердова, Г.Г., Міхалап, С.В. Нові моноклональні антитіла для вивчення імунопатогеничних механізмів ВІЛ-інфекції.// Зб.тез. І Нац. Наук.-практ. Конфер з пробл. ВІЛ/СНІД.- 1995. - С.85-86.

10. Mikhalap S.V., Shlapatskaya L.N., Yurchenko O.V., Berdova A.G., Gluzman D.F., Sidorenko S.P. Monoclonal antibody IPO-38 recognizes a novel nuclear antigen of proliferating cells// Tissue Antigens.- 1996. - V.48- P.461.

11. Sidorenko S.P., Chu G., Draves K.E., Pinchuk L.M., Mikhalap S.V., Shao S., Clark E.A. The IPO-3/SLAM surface molecule associates with protein kinase activities and CD45 in B lymphocytes// Tissue Antigens.- 1996.- V.48- P.373.

12. Mikhalap, S.V., Lopez F., Shlaрatskaya L.N., Yurchenko, O.V., Gluzman D.F., Sidorenko, S.P. IPO-38 a new monoclonal antibody against nuclear antigan of proliferating cells//8th European congress on Biotechnology.-1997. - P.97

13. Berdova A.G., Shlapatskaya L.N., Yurchenko, O.V., Mikhalap, S.V., Gluzman, D.F., Sidorenko, S.P. The panel of monoclonal antibodies of IPO-series in human leukemia and lymphoma immunodiagnosis/8th European congress on Biotechnology.-1997. - P.97

14. Shlapatskaya L.N., Berdova A.G., Mikhalap S.V., Yurchenko O.V., Gluzman D.F., Clark E.A., Sidorenko S.P. Expression of lymphocyte activation antigens in human leukemias and lymphomas//Immunology letters. - 1997.- V.56, №1-3. - P.324.

АНОТАЦІЯ

Міхалап С.В. Нові моноклональні антитіла ІПО-38 до ядерного антигену, що асоційований з проліферацією нормальних та злоякіснотрансформованих клітин. -Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата біологічних наук за спеціальністю 14.01.07 - онкологія, Інститут експериментальної патології, онкології і радіобіології ім.Р.Є.Кавецького НАН України, Український науково-дослідний інститут онкології та радіології МОЗ України, Київ, 1998.

Шляхом соматичної гібридизації клітин отримано гібридому, що продукує моноклональні антитіла ІПО-38 (IgM). Доведено, що ці МКАТ розпізнають ядерний антиген молекулярна маса якого становить 14-16 kDa. Встановлено, що антиген відсутній у клітинах, що знаходяться у стані спокою, і починає експресуватись у ранній G1 фазі клітинного циклу, досягаючи максимума у мітозі. Особливості експресії антигену було вивчено на лініях клітин різного походження, мононуклеарах периферичної крові практично здорових людей та хворих на різні форми гемобластозів, кріостатних зрізах пухлин різної локалізації та гістологічно незмінених тканин. Продемонстровано, що антиген, який розпізнають МКАТ ІПО-38, не є видо- і тканиноспецифічним, інтенсивність експресії залежить від проліферативного потенціала клітин.

Ключові слова: моноклональні антитіла, проліферація, циклозалежні антигени.

АННОТАЦИЯ

Михалап С.В. Новые моноклональные антитела ИПО-38 к ядерному антигену, ассоциированному с пролиферацией нормальных и злокачественнотрансформированных клеток.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата биологических наук по специальности 14.01.07. - онкология, Институт экспериментальной патологии, онкологии и радиобиологии им.Р.Е.Кавецкого НАН Украины, Украинский научно-исследовательский институт онкологии и радиологии МЗ Украины, Киев, 1998.

Путем соматической гибридизации клеток получена гибридома, продуцирующая моноклональные антитела ИПО-38. Доказано, что эти МКАТ распознают ядерный антиген, молекулярная масса которого составляет 14-16kDa. Установлено, что антиген отсутствует в покоящихся клетках и начинает экспессироваться в ранней G1 фазе клеточного цикла, достигая максимума в митозе. Специфичность МКАТ ИПО-38 изучалась на линиях клеток разного происхождения, мононуклеарах периферической крови практически здорових людей и больных с различными формами гемобластозов, на криостатных срезах опухолей различной локализации и гистологически неизмененных тканей. Продемонстрировано, что антиген, распознаваемый МКАТ ИПО-38, не является видо- и тканеспецифическим, интенсивность его экспрессии зависит от пролиферативного потенциала клеток.

Ключевые слова: моноклональные антитела, пролиферация, циклозависимые антигены.

SUMMARY

Mikhalap S.V. New monoclonal antibody IPO-38 recognizing a nuclear antigen associated with proliferation of normal and malignant cells.

Thesis for degree of candidate of biological sciences on speciality 14.01.07 - oncology, R.E.Kavetsky Institute of Experimental Pathology Oncology and Radiobiology NAS of Ukraine, Institute of Oncology and Radiology Ministry of Health Care of Ukraine, Kyiv, 1998.

Hybridoma-producing monoclonal antibody (mAb) IPO-38 (IgM) has been developed following somatic hybridization technique. Mab IPO-38 recognizes an antigen of molecular weight 14000-16000. It was indicated, that antigen is absent in nonproliferating cells and became detectable in G1 phase of the cell cycle. The specificity of antigen expression was studied on cell lines of different origin, mononuclears isolated from peripheral blood of healthy persons and patients with different hematological malignancies, cryostat section of different tumors and normal tissues. It was shown that antigen, recognized with mAb IPO-38 is not species- and tissuespecific, the expression intense depends on proliferating potential of cells.

Key words: monoclonal antibody, proliferation, cell cycle dependent antigens.

Размещено на Allbest.ur