Молекулярно-генетические факторы развития пролапса гениталий и недержания мочи у женщин

Размещено на http://www.allbest.ru/

МОЛЕКУЛЯРНО-ГЕНЕТИЧЕСКИЕ ФАКТОРЫ РАЗВИТИЯ ПРОЛАПСА ГЕНИТАЛИЙ И НЕДЕРЖАНИЯ МОЧИ У ЖЕНЩИН

Ящук А.Г., Закрытная О.С.

Актуальность. Опущением и выпадением внутренних половых органов страдает до 28% гинекологических больных [6]. Анатомо-топографические соотношения стенок влагалища, мочевого пузыря и прямой кишки обусловливают их сочетанное вовлечение в процесс тазовой десценции. Страдают функциональными расстройствами смежных органов 85,5% больных с пролапсом гениталий, из них у 70% развивается недержание мочи, у 36% - нарушение дефекации, у 53% - диспареуния [7]. Проблема опущения и выпадения внутренних половых органов и недержания мочи (ОиВВПО и НМ) не является угрожающей для жизни пациентки, но вызывает стойкую социальную дезадаптацию, снижает качество жизни, приводит к утрате трудоспособности [4]. Этиология данных заболеваний имеет многофакторную природу, а дефект соединительной ткани может быть одной из причин развития патологии [14--16]. Некоторые авторы предполагают, что патогенез ОиВВПО и НМ связан с дисплазией соединительной ткани (ДСТ), а степень тяжести заболевания и сроки его возникновения находятся в прямой зависимости от выраженности клинических проявлений ДСТ на экстрагенитальном уровне [5].

В мировой литературе описаны расовые различия в распространенности и семейные случаи ОиВВПО и НМ, где указывается, что риск возникновения этого заболевания достоверно выше у тех женщин, у которых больны мамы или сестры [10,12]. Эти данные свидетельствуют о существовании генетических факторов в возникновении и развитии данной патологии. В последние годы во всем мире ведутся исследования по выявлению молекулярно-генетической природы заболеваний соединительной ткани, которые связаны с мутациями в генах, ответственных за формирование первичной структуры коллагена, компонентов экстрацеллюлярного матрикса, а также многочисленных ферментов, принимающих участие во внутри- и внеклеточном созревании коллагена, фибриллогенезе, образовании коллагеновых волокон [1--3]. Представляется актуальным выявление кандидатных генов, ассоциированных с ОиВВПО и НМ, что позволит выявить группы риска и проводить эффективные профилактические мероприятия для предупреждения развития заболевания.

Цель: выявление генетической предрасположенности к развитию ОиВВПО и НМ на основе изучения полиморфизма генов коллагена 1-го и 3-го типов, рецепторов эстрогенов.

Материал и методы исследования. Для молекулярно-генетического анализа использованы ДНК 116 неродственных женщин с различной степенью выпадения женских половых органов, из них 67 имели симптомы стрессового недержания мочи различной степени тяжести, а также контрольной группы здоровых доноров - 140 женщин без клинических признаков патологии соединительной ткани. Средний возраст обследованных пациентов составил 52,25+12,03 года. Забор крови проводился на базе гинекологического отделения городской больницы №8 (Уфа) и кафедры акушерства и гинекологии №2 БГМУ.

Выделение ДНК из цельной крови проводилось методом последовательной фенольно-хлороформной экстракции 22. Генотипирование SpI полиморфизма гена б1-цепи коллагена 1-го типа (Соl1А1), PvuII и XbaI локусов гена рецептора эстрогенов (ER- б), А1и и VNTR повторов гена коллагена 3-го типа (Соl3А1) проводилось методом полимеразной цепной реакции синтеза ДНК (ПЦР) с использованием праймеров, описанных в табл.1.

пролапс гениталии недержание моча женщина

Таблица 1

Праймеры, использованные для амплификации исследованных локусов

Результаты амплификации локусов VNTR и А1и гена Соl3А1 оценивались путем проведения вертикального электрофореза в 7- и 6%-ном полиакриламидном геле (исходное соотношение акриламида и метиленбисакриламида 29:1) в соответствии с общепринятыми методами. Для генотипирования локуса SpI гена Со11А1 использовался фермент рестрикции MlsI с поcледующей инкубацией при 37'С в течение 12 ч; для определения полиморфизма гена ER- б - ферменты рестрикции PvuII и XbaI, с последующей инкубацией при 37°С течение 12 ч. Результаты рестрикционного анализа оценивали путем проведения электрофореза в 7%-ном полиакриламидном геле с последующим окрашиванием бромистым этидием и визуализацией под ультрафиолетовыми лучами. Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Statistica v.5.5 и Genepop v.1.2.

Результаты и обсуждение. Исследование полиморфизма генов Со11А1 и Со13А1. Коллагены 1-го и 3-го типов являются интерстициальными коллагенами, формирующими крупные фибриллы. Данные типы коллагена широко распространены в организме и находятся в связках, сухожилиях, сосудах, коже, строме внутренних органов [17]. Коллаген тазовой фасции, возможно, играет важную роль в патогенезе недержания мочи в сочетании с опущением внутренних половых органов. Предполагается, что стрессовое недержание мочи связано с нарушением метаболизма соединительной ткани [14]. Коллаген 1-го типа является основным белком матрикса соединительной (до 25--30%) ткани. Он придает механическую прочность и выполняет морфогенетическую функцию, влияя на рост, миграцию и дифференцировку клеток, определяя их секреторную и синтетическую активность [5]. Повреждения этого типа коллагена найдены при недифференцированных дисплазиях соединительной ткани [1]. Ген б1-цепи коллагена 1 типа (Со11А1) расположен на хромосоме 17 в области q21.3-22. В первом интроне гена Со11А1 имеется сайт узнавания транскрипционного фактора SрI, в котором возможна замена основания G на Т, что приводит к возникновению аллеля Со11А1*s, функциональная активность которого составляет не более 16% от нормального аллеля Со11А1*S [9,18].

Таблица 2

Распределение частот аллелей и генотипов Spl-полиморфизма гена Соl1А1 у здоровых доноров и больных с ОиВВПО и НМ

Проведено изучение G >Т полиморфизма в регуляторной области гена Со11А1 у больных с ОиВВПО и НМ и здоровых доноров из Башкортостана. Частота аллеля Со11А1*s составила 0,082 для группы доноров (табл. 2), у больных с ОиВВПО и НМ аллель Со11А1*s встречался с частотой 0,142. Анализ полиморфизма SрI гена Со11А1 не выявил достоверных различий между контрольной группой и больными, хотя наблюдается увеличение частоты аллеля Со11А1*s в группе больных до 0,142 по сравнению с контролем, где частота данного аллеля менее 1%.

У больных с ОиВВПО и НМ обнаружено 3 генотипа, а в контроле - 2. Генотип Со11А1*s*s не встречался в выборке здоровых доноров. У больных ОиВВПО и НМ генотип Со11А1*s*s выявлен с частотой 0,034. Различия в распределении частот генотипов полиморфизма SpI гена Со11А1 не достигают статистически достоверных значений (p>0,05). Таким образом, полученные результаты свидетельствуют об отсутствии ассоциации полиморфизма SpI гена Со11А1 с выпадением женских половых органов и недержанием мочи у больных из Башкортостана.

Проведен анализ Аlu-полиморфизма в интроне 8 и VNTR-полиморфизма тридцатинуклеотидных повторов в гене Со13А1 в контрольной группе и у больных с ОиВВПО и НМ. Коллаген 3-го типа состоит из трех одинаковых б-1-цепей и кодируется геном Со13А1, локализованным на хромосоме 2, в области q24.3-q31. Протяженность гена составляет 44 т.п.н. и содержит 52 экзона [13].

Частота Аlu-инсерции в контрольной группе составила 0,069. У больных с ОиВВПО и НМ А1u-инсерция обнаружена только у одного пациента в гетерозиготном состоянии, и ее частота составила 0,004. Выявлены достоверные различия в распределении частот аллелей и генотипов А1u-локуса гена Со13А1 между контрольной группой и больными с ОиВВПО и НМ из Башкортостана. Установлено, что с развитием данной патологии ассоциирован генотип А1и -/- с отсутствием инсерции (ч2=5,598, p=0,025; ОR=3,89, 95%СI 1,18-12,84). Обнаружено, что аллель с инсерцией А1u повтора (А1и+) (ч2=9,02, p=0,005; OR=0,133, 95%СI 0,029-0,617), а также гетерозиготный генотип А1и +/- (ч2=9,26, p=0,005; ОR=0,127, 95%СI 0,27-0,594) являются протективными для развития ОиВВПО и НМ.

При изучении VNTR-полиморфизма гена Со13А1 в контрольной группе обнаружено 6 аллельных вариантов, у больных - 5 (рис. 1).

Размещено на http://www.allbest.ru/

Наиболее частыми аллелями в контрольной группе оказались аллели VNТR*2, VNTR*3 и VNTR*4, тогда как у больных с ОиВВПО и НМ - только 2 аллеля - VNTR*2 и VNTR*3 являются частыми. Гетерозиготность по данному локусу у здоровых доноров составила 84,4%, у больных - 72,4%.При сравнении контрольной группы и больных с ОиВВПО и НМ обнаружены статистически достоверные различия по частоте аллеля VNTR*4(ч2=5,29, p=0,025), который оказался протективным для развития ОиВВПО и НМ (ОR=0,55; 95%СI 0,33--0,92). Выявлено 10 генотипов у больных и 12 генотипов у здоровых доноров (рис. 2). Обнаружены достоверные различия между больными и контролем по генотипу VNTR*2*2 (ч2=7,049, р=0,01 ). который является генотипом риска развития ОиВВПО и НМ у пациентов из Башкортостана (ОR=3,б7; 95%С1 1,33-10,09).

На основании полученных результатов по двум локусам гена Со13А1 можно сделать предположение, что ген коллагена 3-го типа является кандидатным геном, участвующим в патогенезе ОиВВПО и НМ.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Исследование Pvu II- и ХЬаI - полиморфизмов гена ЕR-а. Эстрогены стимулируют синтез коллагеновых и неколлагеновых белков, мукополисахаридов основного вещества соединительной ткани. Изоформы рецепторов эстрогена изменяют экспрессию генов как в количественном, так и в качественном отношении. Через активацию определенных генов они вмешиваются в клеточный метаболизм и функции, способствуя синтезу специфических необходимых для воспроизводства веществ [11]. В гене ЕR-а обнаружено несколько полиморфизмов. Наиболее широко изученными являются полиморфизмы РvиII (Т397С), ХbаI (С351G) в интроне 1. Данные полиморфизмы находятся в нефункциональной области гена и, поскольку разделены 50 п.н., находятся в неравновесном сцеплении. Аллели *Р и *Х (отсутствие сайта рестрикции), так же как и аллели *р и *х (наличие сайта рестрикции) сцеплены друг с другом. Молекулярные механизмы, благодаря которым эти полиморфизмы влияют на активность рецепторов, неизвестны.

Нами проведено изучение РvиII- и ХbаI -полиморфизмов гена ЕR-а у больных с ОиВВПО и НМ и в контрольной группе здоровых доноров. Частота аллеля ЕR-а*Р в контрольной группе составила 0,393, частота аллеля ЕR-а*Х составила 0,479. У больных частота аллеля ЕRа*Р составила 0,461, частота аллеля ЕR-а*Х составила 0,457. Достоверных различий в распределении частот аллелей и генотипов локусов РvиII- и ХbаI гена ЕR-а между больными ОиВВПО и НМ и здоровых доноров не обнаружено (p>0,05). Значения частот аллелей в обеих группах были приблизительно одинаковыми с превалированием аллеля ЕR-а*х (0,532 в контроле и 0,543 у больных) и аллеля ЕR-а*р (0,607 в контроле и 0,539 у больных), в выборках больных и контроля преобладали гетерозиготные генотипы по обоим исследованным локусам: ЕR-а*Р*р и ЕR-а*Х*х (табл. 3 и 4).

Таблица 3

Распределение частот аллелей и генотипов РvиII- полиморфизма гена ЕR-а у больных с ОиВВПО и НМ и здоровых доноров

Таблица 4

Распределение частот аллелей и генотипов ХbаI -полиморфизмов гена ЕR-а у больных с ОиВВПО и НМ и здоровых доноров

Учитывая, что изученные полиморфизмы находятся в неравновесном сцеплении, мы провели анализ распределения сочетания генотипов локусов РvиII- и ХbаI гена ЕR-а. Обнаружены достоверные различия по частоте генотипа ЕR-а*Х*Х*р*р между выборкой контроля и больными (ч2=4,459, р=0,05), который является протективным для развития ОиВВПО и НМ (ОR=0,123; 95%СI 0,012-1,214). Таким образом, анализ сочетания генотипов локусов РvиII- и ХbаI гена ЕR-а является более информативным, чем анализ каждого локуса в отдельности.

Таким образом, сделаны первые шаги в изучении молекулярно-генетических основ предрасположенности к ОиВВПО и НМ. Полученные результаты позволяют говорить об информативности использования полиморфизмов генов ЕR-а и СоlЗА1 в качестве ДНК-маркеров для диагностики выпадения женских половых органов. Установлены ассоциации полиморфизмов А1u и VNTR полиморфизма гена Со13А1 с выпадением женских половых органов. Относительный риск развития ОиВВПО и НМ повышен у носителей генотипов Alu-/- и VNTR*2*2 гена Со13А1 и понижен у носителей аллеля Alu+ и генотипа Alu+/-, аллеля VNTR*4 гена Со13А1, а генотип ЕR-а*Х*Х*р*р является протективным для развития ОиВВПО и НМ.

Выводы. На основании результатов исследования выдвинуто предположение об участии генов рецептора эстрогенов и коллагена 3-го типа в патогенезе данных заболеваний. При анализе молекулярно-генетических результатов в сочетании с сопутствующими клиническими проявлениями патологии соединительной ткани получены убедительные доказательства роли генетических факторов в развитии ОиВВПО и НМ, и это дает повод рассматривать выпадение женских половых органов и недержание мочи в качестве системного заболевания соединительной ткани.

Список литературы

1. Банников Г.А. Молекулярные механизмы морфогенеза // Итоги науки и техники. ВИНИТИ.-Т. 14. - М., 1990.-С. 148.

2. Замараева Т.В., Лебедев Д.А. Поперечные ковалентные связи, стабилизирующие коллагеновыс структуры в норме и патологии // Вопросы мед. химии. - 1985. - Т. 31, №1. - С. 10-23.

3. Кадурина Т.И. Наследственные коллагенопатии. - СПб, 2000. - 270 с.

4. Кан Д.В. Руководство по акушерской и гинекологической урологии. - М.: Медицина, 1978. - 456 с.

5. Смольнова Т.Ю., Савельев С.В., Титченко Л.И., Гришин В.Л., Яковлева Н.И. Пролапс гениталий - следствие травматических родов или генерализованной дисплазии соединительной ткани? // Акушерство и гинекология. - 2001. - №4.

6. Смольнова Т.Ю., Буянова С.Н., Савельев С.В., Петрова В.Д. Дисплазия соединительной ткани как одна из возможных причин недержания мочи у женщин с пролапсом гениталий. // Урология.- 2001.- №2.

7. Попов А.А. Хирургическое лечение осложненных и неосложненных форм пролапса гениталий // Матер. II Рос. форума «Мать и дитя».- 2000.- С.271.

8. Москаленко М.В., Асеев М.В., Зазерская И.Е., Кузнецова Л.В., Баранов В.С. Биологические технологии в медицинской практике / Под ред. А.Б. Масленникова. - Вып. 4. - Новосибирск: Альфа Виста, 2003. - С. 120-133.

9. Audi L, Garcia-Ramirez M., Carrascosa A. Genetic determinants of bone mass// Horm. Res. - 1999 - Vol. 51, №3. - P. 105-123.

10. Banu L.F. Synthetic sling for genital prolapse in young women // Int. J. Gynaecol. Obstet. - 1997. - Vol. 57, №1. - P. 57-64.

11. Becherini L., Gennari L., Masi L. et al. Evidence of a linkage disequilibrium between polymorphisms in the human estrogen receptor alpha gene and their relationship to bone mass variation in postmenopausal Italian women // Hum. Mol. Genet. - 2000. - Vol. 9, №13. - P. 2043-2050.

12. Chiaffarino F., Chatenoud L., Dindelli M. et al. Reproductive factors, family history, occupation and risk of urogenital prolapse // European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. - 1999. - Vol. 82. - P. 63-67.

13. Dalgleish R. The human mutation database // Nucleic Acids Res. - 1998. - Vol. 26. - P. 253-255.

14. Falconer C., Blomgren B., Johansson 0. et al. Different organization of collagen fibrils in stress-incontinent women of fertile age // Acta Obstet Gynecol. Scand. - 1998. - Vol. 77. - P. 87-94.

15. Jackson S.R., Avery N.C., Tarlton J.F. et al. Changes in metabolism of collagen in genitourinary prolapse // The Lancet. - 1996. - Vol. 347, №15. - P. 1658-1661.

16. Kirsi M. Rinne, Pcrtti P. Kirkinen. What predisposes young women to genital prolapse? // European Journal of Obstetrics & Gynecology and Reproductive Biology. - 1999. - Vol. 84. - P. 23-25.

17. Kivirikko K. Collagens and there abnormalities in a wide spectrum of diseases//Ann. ofmed. - 1993. -Vol. 25. - P. 113-126.

18. Langdahl B.L., Ralston S.H., Grant S.F., Eriksen E.F. An Spl binding site polymorphism in the COLIA1 gene predicts osteoporotic fractures in both men and women // J. Bone Miner. Res. - 1998. - Vol. 13, №9. - P. 1384-1390.

Размещено на Allbest.ru