Нарушение генетического гомеостаза у больных с различными формами детского церебрального паралича

Размещено на http://www.allbest.ru

Нарушение генетического гомеостаза у больных с различными формами детского церебрального паралича

Гайнетдинова Д.Д., Исмагилов М.Ф.

Реферат

Методом регистрации хромосомных аберраций в лимфоцитах и микроядер в эритроцитах периферической крови изучено состояние генетического аппарата у больных детским церебральным параличом. Выявлен высокий уровень хромосомных аберраций и микроядер в клетках периферической крови. Повышение числа хромосомных перестроек наблюдалось примерно у 2/3 больных, в то время как эритроциты с микроядрами регистрировались практически у каждого обследуемого. Кластогенный эффект не коррелировался с возрастом и полом и был достоверно выше в группе детей с двойной гемиплегией. Анеугенный эффект был одинаков у детей с разными формами заболевания и в разных возрастных группах.

Детский церебральный паралич (ДЦП) занимает одно из ведущих мест в структуре заболеваемости нервной системы у детей, являясь широко распространенным страданием [7,8]. По данным некоторых исследователей, частота ДЦП относительно постоянна за последние десятилетия (от 1,7 до 3,1 на 1000 детского населения) и практически не зависит от качества родовспоможения, ухода за новорожденным и недоношенным ребенком и частоты перинатальной асфиксии [1]. Несмотря на неослабевающий интерес исследователей к проблеме ДЦП, на современном этапе развития медицины не представляется возможным ни его внутриутробное прогнозирование, ни, тем более, попытка предпринять какие-либо лечебные мероприятия. До сих пор не существует и достаточно эффективных методов восстановительного лечения при этом заболевании, особенно в тех случаях, когда терапия начата несвоевременно и/или имеются диффузные и грубые поражения головного мозга. Поэтому в настоящее время наиболее актуально изучение этиологических и патогенетических механизмов реализации патогенных воздействий на нервную систему ребенка.

До настоящего времени остается неясным, почему в одних случаях наличие целого комплекса вредных факторов не приводит к каким-либо нарушениям деятельности мозга, а в других даже легкая асфиксия может повлечь за собой развитие грубой церебральной патологии [9]. Необычные ответные реакции, как правило, проявляются у индивидуумов, которые по своему генетическому статусу значительно отличаются от моды распределения в популяции [2,4]. Исходя из этого, одним из моментов, провоцирующих возникновение заболевания, может стать появление у зародыша или плода нестабильности генома. Регистрация этого феномена после рождения ребенка и у детей разных возрастных групп может служить косвенным доказательством стойкости этой патологии при ДЦП и, следовательно, рассматриваться как постоянно действующий фактор, интегрированный в общую систему патогенеза при ДЦП. Не исключен и обратный механизм, когда в условиях развивающейся патологии определенные патогенетические звенья могут стать причиной повреждения генетического аппарата [6]. В любом случае установление феномена нестабильности генома у больных ДЦП может внести существенный вклад в представление об этиологии и патогенезе этого заболевания, наметить более радикальные пути восстановительного лечения.

В оценке генетического гомеостаза используются различные цитогенетические методы с изучением хромосомного состава клетки [3]. В настоящей работе для изучения нестабильности генома использован анализ уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах и микроядер в эритроцитах периферической крови. В доступной литературе мы не обнаружили публикаций, касающихся анализа генетического аппарата больных ДЦП с использованием перечисленных методов. Это и определило направленность наших исследований, целью которых явилась оценка методами цитогенетики состояния генома у больных ДЦП.

Для выявления цитогенетических аномалий в клетках периферической крови микроядерным тестом обследовано 98 больных (59 мальчиков и 39 девочек) с различными формами ДЦП. Все больные были разделены на группы в зависимости от клинической формы: спастическая диплегия - у 23 (23,5%), двойная гемиплегия - у 23 (23,5%), гиперкинетическая форма - у 17 (17,7%), левосторонняя гемипаретическая - у 15 (15,3%), правосторонняя гемипаретическая - у 12 (12,2%) и атонико-астатическая - у 8 (8,2%). Группу контроля составили 40 условно здоровых детей и подростков (10 мальчиков и 30 девочек). генетический гомеостаз церебральный хромосомный

Регистрацию эритроцитов с микроядрами (ЭМ) в периферической крови осуществляли согласно общепринятой методике [5]. Забор крови для мазков производился у больных при поступлении их в стационар. Для регистрации микроядер просматривали мазки периферической крови больных до лечения. В контрольной группе (30 детей) использовалась кровь здоровых детей, взятая у них при плановых диспансерных обследованиях. Свежие высушенные мазки фиксировали 90-70% этиловым спиртом 3 минуты. Сухие препараты окрашивали в растворе азур-эозинового красителя Романовского-Гимзы 1:5 на дистиллированной воде рН 6,8 в течение 20 минут и хорошо промывали. У каждого обследованного просматривали 1-2 мазка, в каждом из которых подсчитывали не менее 20 тысяч эритроцитов, что позволило производить исследования в группах с малой выборкой.

Аберрации хромосом (АХ) изучены у 49 больных, распределенных в соответствии с формой заболевания по 5 группам. В каждой группе подобрано в основном по 9-10 человек. Группа больных с атонико-астатической формой была исключена из анализа в связи с их малочисленностью. Культивирование крови осуществляли согласно общепринятой методике [5]. Культуру фиксировали на 48 часов. За 3 часа до фиксации добавляли колхицин в конечной концентрации 0,5 мкг/мл. На каждого обследованного готовили 2 мазка, в каждом мазке изучали по 150 метафаз, полученные данные суммировали. Использованные реактивы (фитогемагглютинин, колхицин и красители) производились фирмой «Sigma» (Россия). Учитывали все хромосомные и хроматидные аберрации. Анализ данных литературы [2, 5] показал, что при цитогенетическом анализе, подобно запланированному нами, достаточно пользоваться выборками при величине ошибок, равной 0,05 и анализе от каждого индивидуума от 200 до 700 клеток. Это позволило нам остановиться на величине выборки для каждой формы ДЦП, равной 9-10, и 300 просматриваемых клетках от каждого обследованного. При цитогенетическом анализе учитывали число клеток с изменениями структуры хромосом (одиночные и парные фрагменты, хромосомные обмены, клетки с множественными повреждениями хромосом не менее 5 хромосомных аберраций в клетке) без конкретизации типа нарушения.

Статистический анализ полученных данных проводился с использованием непараметрических критериев: t-критерий Манна-Уитни и критериев Краскала-Уоллиса. Средний уровень клеток с микроядрами и перестройками хромосом оценивали с помощью медианы (Me). Нижний и верхний пороговые уровни клеток с цитогенетическими нарушениями определяли как 2,5 и 97,5-й перцентили соответственно.

Результаты исследования уровня эритроцитов с микроядрами в полихроматофильных эритроцитах у больных ДЦП и здоровых детей

В контрольной группе средний уровень (Me) эритроцитов с микроядрами (ЭМ) составил 0,07%. Исследование выявило, что уровень ЭМ в периферической крови больных ДЦП оказался достоверно выше контрольного (рис.1).

Причем показатель варьировал в пределах от минимальных (0,19%) при гемипаретической форме до максимальных (0,21%) при гиперкинетической. При гемипаретической форме средний уровень ЭМ был одинаков (по 0,19%) как при левостороннем, так и правостороннем вариантах. Клинические проявления у больных со спастическим тетрапарезом (спастическая диплегия и двойная гемиплегия) по значениям ЭМ также не различались. Достоверные различия получены при сравнении показателей при гиперкинетической и гемипаретической формах (р<0,05). Высокие значения ЭМ у больных с гиперкинетической формой свидетельствуют, вероятно, о существовании более активных процессов кластогенеза.

При спастической диплегии и атонико-астатической форме показатель ЭМ (Me) был несколько выше у мальчиков, а при двойной гемиплегии, гиперкинетической и гемипаретической формах - у девочек (р>0,05). У мальчиков при разных формах средние значения ЭМ между собой достоверно не различались, но в сравнении с контролем разница была значимой (р<0,001). У девочек с гиперкинетической формой этот показатель оказался достоверно выше (р<0,05), чем при гемипаретической форме и спастической диплегии.

В исследованной выборке больных ДЦП выявлена значительная вариабельность числа ЭМ. У всех обследованных независимо от формы заболевания средняя величина кратности превышения уровня ЭМ над контролем составила примерно 2,5, в группе детей со спастической диплегией, двойной гемиплегией и гиперкинетической формой - 2,7, атонико-астатической формой - 2,3, правосторонней гемиплегией - 2,2, левосторонней гемиплегией - 2,1. Для детального изучения этого феномена все больные были условно распределены по 3 группам. В 1-ю группу вошли больные ДЦП с числом 1ьные значения в 1,01 - 2 раза (низкий уровень), во 2-ю - от 2,01 до 3 раз (средний уровень), в 3-ю - более чем в 3,01 раза (высокий уровень). Больных со средним уровнем ЭМ выявлено достоверно больше, чем с низким и высоким, - соответственно 74,5%, 13,3%, 12,2% (р< 0,001).

Анализ анамнеза больных с различным уровнем превышения ЭМ показал некоторые особенности. Известно, что масса тела при рождении отражает незрелость новорожденного даже в большей степени, чем срок гестации, и эта величина менее 2500 граммов является одним из факторов риска ДЦП [1]. Поэтому всех обследованных мы разделили на детей, родившихся массой тела 2500 граммов и более и родившихся меньшей массой. Доля детей массой тела менее 2500 граммов в 3 группах оказалась различной и зависела от интенсивности процессов кластогенеза: в 1-й - 38%, во 2-й - 41%, в 3-й - 75%. Исходя из этого, можно предположить, что интенсивность процессов кластогенеза связана со степенью зрелости больных ДЦП к моменту рождения, и чем более маловесным рождается ребенок, тем более высок у него анеугенный эффект на эритропоэз.

Нейровизуализационное исследование выявило во всех 3 группах перивентрикулярную лейкомаляцию различной выраженности, кистозно-атрофические изменения, микрокальцинаты в области подкорковых ядер. В то же время замечены некоторые различия томографических находок: только у лиц со средней и высокой кратностью превышения уровня ЭМ над контролем (2 и 3-я группы) дополнительно к перечисленным выше изменениям макроуровня обнаружены аномалии развития головного мозга. Во 2-й группе встречались гипоплазия мозжечка, арахноидальные кисты, гипоплазия мозолистого тела. У больных 3-й группы томографическая картина пороков развития была представлена нарушениями нейрональной миграции - гетеротопией серого вещества головного мозга и нарушением соотношения серого и белого вещества с уменьшением объема белого. Выявленный высокий уровень ЭМ в периферической крови свидетельствует о дестабилизации генетического аппарата (генома) у больных ДЦП, причем у каждого обследованного. Анеугенный эффект был достоверно выше у детей с гиперкинетической формой. Можно полагать, что в основе высокого уровня ЭМ при гиперкинетической форме лежат более интенсивные процессы кластогенеза, чем при других формах ДЦП. Кроме того, дефекты веретена деления, возникающие в процессе созревания эритроцитов в костном мозге, проявляются интенсивнее у девочек с гиперкинезами, чем у мальчиков с гиперкинезами и у девочек с другими двигательными нарушениями. Не исключено, что в этиологии и патогенезе гинеркинетической формы именно у девочек наследственно-конституциональные особенности играют немаловажную роль. Эти предположения требуют дальнейшего изучения вклада генетической составляющей в генез ДЦП, особенно гиперкинетической формы.

Выраженность нестабильности генома зависит от зрелости ребенка к моменту рождения. У больных ДЦП массой тела при рождении менее 2500 граммов анеугенный эффект выражен в большей степени, чем у детей, родившихся массой 2500 граммов и более. Кроме того, у лиц с высоким числом дефектов веретена деления в эритроцитах периферической крови изменения головного мозга, выявляемые при нейровизуализации, чаще представлены аномалиями развития, в основном нарушениями нейрональной миграции.

Результаты исследования аберраций хромосом в лимфоцитах периферической крови больных ДЦП

Хромосомные перестройки в лимфоцитах периферической крови изучены у 10 здоровых детей и у 49 больных ДЦП - со спастической диплегией, гиперкинетической, гемипаретической правосторонней и левосторонней (по 10 человек) формами и двойной гемиплегией (9). Индивидуальные значения числа клеток с перестройками хромосом в периферической крови больных с различными формами ДЦП варьировали от 3,33 до 10,0%. Распределение уровня клеток с аберрациями хромосом (АХ) в лимфоцитах периферической крови носило асимметричный характер. Пороговый уровень АХ в периферической крови детей с ДЦП был в пределах 3,33-8,93%. У здоровых лиц спонтанный уровень аберраций хромосом составил 2,33%.

Уровень перестроек хромосом у больных мальчиков (n=28) и девочек (n=21) оказался неодинаковым (рис. 2).

Пороговое значение АХ у мальчиков (3,78-9,32%, Me - 6,5%) достоверно преобладало над аналогичным показателем у девочек (3,33-7,84%, Me - 5,5%; р<0,05). Сравнительный анализ числа перестроек хромосом у детей с различными формами заболевания показал, что наиболее высокая частота повреждений хромосом наблюдалась при двойной гемиплегии (рис. 3). У детей этой группы уровень АХ достигал в среднем 7,67%, что было достоверно (р<0,05) выше, чем в других группах и более чем в 3 раза превышал спонтанный уровень. Количество выявленных повреждений хромосом при других формах заболеваний было существенно ниже - от 5,5% при спастической диплегии до 6,0% у больных левосторонным гемипарезом и достоверно не зависело от формы заболевания.

Таким образом, в лимфоцитах периферической крови у больных ДЦП высок уровень клеток с перестройками хромосом. Достоверное превышение числа хромосомных перестроек над спонтанным уровнем АХ наблюдалось у 2/3 больных. Кластогенный эффект коррелирует с полом больного ДЦП - он достоверно выше у мальчиков, чем у девочек. Нестабильность генома высока у детей со всеми формами заболевания, но достоверно выше в группе с самой тяжелой формой двигательных расстройств - двойной гемиплегией.

Сравнительная оценка эффективности цитогенетических методов исследования стабильности генома (анализ микроядер и аберраций хромосом) в клетках периферической крови у больных ДЦП

Исследование генетических нарушений у больных ДЦП, проведенное двумя цитогенетическими подходами (микроядерный тест и метод учета клеток с нарушениями структуры хромосом), выявило практически у каждого обследованного нестабильность генома. Однако число детей с достоверно высоким уровнем повреждения генома и степень его повреждения при различных формах ДЦП оказались разными в зависимости от используемых методов (см. табл.). У каждого ребенка, обследованного микроядерным методом, обнаружено достоверное превышение уровня ЭМ по сравнению с контролем. В то же время оценка уровня АХ у детей с различными формами ДЦП выявила повышенное по сравнению с контролем количество перестроек хромосом в лимфоцитах крови. Вместе с тем статистическая обработка результатов исследования показала, что такое повышение числа хромосомных перестроек наблюдалось не у всех детей, а лишь у 2/3 из них. В зависимости от формы заболевания число детей с нестабильностью генома варьировало от 60% при гемипаретической форме до 78% при двойной гемиплегии, в то время как ЭМ регистрировались у каждого обследованного. С этих позиций микроядерный метод оценки нестабильности генома у больных ДЦП проявил себя надежнее.

Таким образом, у подавляющего большинства детей имела место дестабилизация генома - повышение уровня хромосомных аберраций в лимфоцитах и количества ЭМ в периферической крови. Сравнительная оценка результатов исследования, полученная разными методами, показала, что метод регистрации ЭМ в периферической крови более чувствителен при выявлении нестабильности генома, чем метод определения перестроек хромосом в лимфоцитах периферической крови. Это не распространяется на оценку степени повреждения генома. Чувствительность обоих методов в этом случае была примерно одинаковой, хотя повышение численности обследуемых выборок может внести определенные коррективы.

Предполагается, что в основе явления нестабильности генома лежит интенсификация в организме больных ДЦП процессов мутагенеза за счет усиленной генерации эндомутагенов и (или) ослабления антимутагенных систем защиты генома. Эти предположения требуют дальнейшего изучения патогенеза ДЦП в целях разработки методов фармакологической коррекции цитогенетической нестабильности.

Литература

1. Барашнев Ю.И. Перинатальная неврология. - М., 2001.

2. Бочков Н.П. .Чеботарев А.Н. Наследственность человека и мутагены внешний среды. - М., 1989.

3. Бочков Н.П. Клиническая генетика. - М, 2001.

4. Дурнев А.Д., Середин С.В. Мутагены. Скрининг и фармакологическая профилактика воздействий. - М., 1998.

5. Козинец Г.И., Погорелое В.М., Шмаров Д.А., Боев С.Ф., Сазонов В.В. Клетки крови - современные технологии их анализа. - М., 2002.

6. Кржановский Г.Н. (Под ред.). Дизрегуляционная патология. - М., 2001.

7. Hill А. // Pediatr. Neural. - 1999. - № 7(5). - P.317-325.

8. Maurer U. // Wien. Med. Wochensch. - 2002. - Vol. 152. - P.14-18.

9. Yin R., Reddihough D., Ditchfield M., Collins K. // J. Paediatr. Child Health. - 2000. - Vol. 36. - P.139-144.

Размещено на Allbest.ru