Характеристика микобактериальной популяции у больных впервые выявленным туберкулезом легких

Размещено на http://www.allbest.ru

Характеристика микобактериальной популяции у больных впервые выявленным туберкулезом легких

Бадлеева М.В., Убеева И.П., Гончикова С.Ч.

Туберкулез - одно из самых распространенных инфекционных заболеваний в мире. В наши дни, как и в прошлые века, туберкулез остается ведущей причиной смерти среди всех инфекционных заболеваний взрослого населения. Ежегодно почти у 8 миллионов человек развивается активный процесс, около 3 миллионов человек умирает от этой болезни [WHO,1998; Nguen T.,1999).

Одной из основных причин нарастания заболеваемости по туберкулезу, происходящее на протяжении последнего десятилетия ХХ века во всем мире, является широкое распространение лекарственно-устойчивых штаммов Mycobacterium tuberculosis (Фармер П.Е. и др., 1999; Raviglione M.C. et al., 2001;).

Одновременно следует отметить, что приблизительно треть населения нашей планеты - около 1,9 миллиарда человек - инфицированы микобактериями туберкулеза (МБТ) и, наряду с носителями остаточных туберкулезных изменений, составляют в обществе огромный резервуар туберкулезной инфекции (Kochi A.,1991; Nguen T.,1999). Это представляет потенциальную опасность развития эндогенной реактивации и клинически выраженного активного туберкулезного процесса на протяжении всей жизни человека (Дорожкова И.Р.,1974; Шмелев Н.А. и др.,1976).

Выживание возбудителя в макроорганизме достигается благодаря его широкой изменчивости, в результате которой в организме инфицированных микобактериями туберкулёза людей формируются биологически активные формы персистирования возбудителя (L-формы) с резко измененными свойствами. L-формы МБТ являются закономерной формой филогенетического развития возбудителя и основной формой его персистирования в организме практически здоровых инфицированных МБТ людей. Именно они обусловливают потенциальную опасность развития эндогенной реактивации и рецидивов процесса. Выделение L-форм MБТ у практически здоровых в отношении туберкулеза людей является важным прогностическим признаком, свидетельствующим о начале эндогенной реактивации процесса и/или развитии рецидива (Дорожкова И.Р. и др.,1990, 1994).

Обнаружение микобактерий туберкулеза в диагностическом материале является наиболее достоверным доказательством наличия у больного активного туберкулезного процесса. Своевременное определение состава микобактериальной популяции (МБП) у больных впервые выявленным туберкулезом (ТБ) дает возможность клиницисту выбрать адекватную химиотерапию на ранних этапах лечения.

В настоящее время практически отсутствуют исследования, посвященные изучению состава микобактериальной популяции и ее лекарственной чувствительности в режиме реального времени, в то же время как быстрая диагностика ТБ с детальной информацией о составе микобактериальной популяции и лекарственной чувствительности позволит своевременно начать адекватное лечение.

Проведенные исследования в этом направлении помогли определить возможности ускоренного подтверждения туберкулезной этиологии заболевания с характеристикой микобактериальной популяции с одновременным определением ее лекарственной чувствительности возбудителя. Работа проводилась в микробиологической лаборатории НИИФ ММА им. И.М. Сеченова, Московском научно-практическом центре борьбы с туберкулезом Департамента здравоохранения г. Москвы. Защита состоялась при ММА им. И.М. Сеченова. В ходе исследований были использованы классические микробиологические методы выделения, идентификации и определения лекарственной чувствительности бактериальных и L-форм возбудителя туберкулеза, молекулярно-биологический метод - биологические микрочипы «ТБ БИОЧИП (РИФ)». Молекулярно-биологический метод включало выявление ДНК МБТ и определение ее лекарственной чувствительности, как непосредственно в клинических образцах, так и выделенных культур из этих же образцов исследуемого материала.

Исследования проводили в три этапа на протяжении 10 недель. Два первых этапа обследования больных проводили до назначения им противотуберкулезной химиотерапии. В течение указанного периода (8-9 суток) от каждого больного было получено 6 проб диагностического материала (2 пробы БАЛЖ, 4 пробы мокроты: 2 - до и 2 - после бронхоскопического исследования).

На двух первых (амбулаторный этап наблюдения и в момент поступления больного в стационар) этапах исследования из всех проб диагностического материала были выделены 39 и 37 (соответственно по этапам) бактериальных и 6 L-форм МБТ. На третьем этапе (через два месяца химиотерапии) из диагностического материала выделено 26 культуры возбудителя туберкулеза и 17 культур L-форм МБТ.

К завершению третьего этапа исследований было установлено, что выделение бактериальных форм МБТ статистически достоверно снизилось (ч2=78,73; р < 0,001), тогда как количество выделенных L-форм МБТ увеличилось практически в 3,5 раза (ч2=37,3; р < 0,001).

Одной из задач нашего исследования явилась оценка возможности использования биологического микрочипа «ТБ-БИОЧИП (РИФ)» для выявления ДНК МБТ непосредственно в диагностическом материале, полученных от больных туберкулезом легких.

С этой целью мы сопоставили результаты выделения МБТ с помощью классического микробиологического метода культивирования на плотных питательных средах с данными параллельного выявления ДНК МБТ с помощью «ТБ-БИОЧИП (РИФ)» в динамике по этапам исследования.

С помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП (РИФ)» ДНК МБТ была обнаружена в 91,7 % проб исследованного диагностического материала, т.е. в 2,5 раза чаще (ч2=15,33; р < 0,001), чем с помощью классических микробиологических методов посева. Уровень ее выявления оставался практически стабильным на протяжении всех трех этапов наблюдения, тогда как частота выделения МБТ на фоне лечения (на третьем этапе наблюдения) микробиологическим методом посева статистически достоверно снизилась (ч2=32,71; р < 0,001).

Это обстоятельство можно объяснить тем, что тест-система «ТБ-БИОЧИП (РИФ)» позволяла выявлять ДНК МБТ вне зависимости от того, была ли это ДНК МБТ в составе бактериальных форм возбудителя или в составе его L-трансформированной популяции.

Более того, использование тест-системы «ТБ-БИОЧИП (РИФ)» позволило обнаружить ДНК возбудителя даже в случаях низкого ее содержания в исследуемом образце в силу высокой чувствительности (80%) и специфичности (93,8%) молекулярно-биологического метода.

Метод световой микроскопии мазков из осадка материала, окрашенных по Ziehl-Neelsen, оказался мало информативным: кислотоустойчивые микобактерии обнаружены всего в 11,5% исследованных проб.

В то же время число микобактерий, выявленных с помощью люминесцентной микроскопии, в несколько раз превысило данные световой микроскопии (51,8%).

Однако при параллельном культуральном исследовании рост МБТ был получен далеко не из всех микроскопически положительных проб материала (36,7%), что соответствует наблюдаемой в настоящее время тенденции снижения жизнеспособности МБТ и частоты их культурального выявления.

Культуральный метод исследования на бактериальные формы МБТ обладал значительно меньшей эффективностью по сравнению с тест-системой «ТБ-БИОЧИП (РИФ)». Он позволил выявить около 55,2% бактериовыделителей.

Эффективность культурального выявления L-форм МБТ зависела от стадии течения процесса: на начальных этапах процент выявления оставался невысоким (11%), а к моменту завершения интенсивной фазы лечения резко возрастал (53,3%).

Определение лекарственной чувствительности МБТ к противотуберкулезным препаратам проводили параллельно двумя методами: методом абсолютных концентраций и с помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП (РИФ)». С помощью тест-системы «ТБ-БИОЧИП (РИФ)» лекарственную чувствительность МБТ к рифампицину определяли непосредственно в биологическом материале, у выделенных из него культур и у L-форм МБТ.

При динамическом исследовании лекарственной чувствительности МБТ к рифампицину на протяжении всех трех этапов наблюдения методом абсолютных концентраций выявили тенденцию уменьшения количества чувствительных к рифампицину и увеличения количества устойчивых к рифампицину штаммов МБТ. Установленные в динамике изменения уровня лекарственной чувствительности МБТ к рифампицину статистически достоверны (ч2 =10,49; р < 0,005).

Таким образом, мы проследили в динамике изменение состава микобактериальной популяции с момента выявления заболевания до окончания периода интенсивного лечения и установили, что ее состав изменялся: число выделенных бактериальных форм МБТ статистически достоверно снизилось (ч2=78,73; р < 0,001), тогда как количество выделенных L-форм МБТ увеличилось в 2,8 раза (ч2=37,3; р < 0,001).

Сопоставление результатов всех использованных при проведении исследования методов показало не только высокую информативность биологического микрочипа «ТБ - БИОЧИП (РИФ)», но и возможность определения с его помощью лекарственной чувствительности как бактериальных, так и L-трансформированных вариантов возбудителя туберкулеза.

Применение указанного комплекса методов не только повышает эффективность микробиологической диагностики ТБ, в том числе и микобактериальной популяции, но и значительно ускоряет определение лекарственной устойчивости к рифампицину. Это позволяет своевременно корректировать лечебную тактику, а также прогнозировать риск развития активного ТБ при латентной инфекции.

Литература:

микобактериальная популяция туберкулез

Бадлеева М.В., Борисов С.Е., Купавцева Е.А. и др. // Туберкулез сегодня: материалы Рос. съезда фтизиатров, 7-го. - М., 2003. - С. 81-82.

Дорожкова И.Р., Земскова З.С., Круду В.Н. Значение персистирующей туберкулезной инфекции в эндогенной реактивации процесса // Нац. конгр. по бол. орг. дыхания, 4-ый. - М., 1994. - № 214.

Земскова З.С., Дорожкова И.Р. Скрыто протекающая туберкулёзная инфекция.- М.: «Медицина», 1984.- 224 с.

Мороз А.М., Скотникова О.И., Соболев А.Ю., Михайлович В.И. и др. Молекулярно-генетические методы выявления рифампицин-резистентных штаммов Mycobacterium tuberculosis // Вестн. РАМН. - 2002. - № 2. - С. 36-39.

Скотникова О.И., Носова Е.Ю., Бадлеева М.В., Дорожкова И.Р., Мороз А.М. Новые технологии определения лекарственной чувствительности // Пробл.туберкулеза. - 2004. - № 6. - С. ….

Фармер П.Е., Кононец А.С., Борисов С.Е. и др. // Полирезистентный туберкулёз: угроза человечеству.- М.: Ред. «Институт «Открытое общество», М., 1999.- 61 с.

Шилова М.В. Особенности распространенности туберкулеза в разных Федеральных округах России. // В сб.: Туберкулез сегодня: Материалы рос. Съезда фтизиатров, 7-го., М. - 2003, С. 31.

Шмелёв Н.А., Дорожкова И.Р., Земскова З.С. Персистирование возбудителя туберкулеза в организме в виде L-форм и их повреждающее действие. // Вестник АМН. - 1976. - № 5. - С. 29-37.

Badleeva M.V., Borisov C.E., Kupavcheva E.A., Scotnicova O.I., Galkina K.Yu., Moroz A.M., Dorozhkova I.R. Latent tuberculosis infection as a cause of tuberculosis disease. Eur. Resp. J. 2003; 22: 157-158.

Farmer P, Shin S, Bayona J, Kim J, Furin J, Brenner J. Multidrug-resistant tuberculosis. Kluwer Academic Publishers 2000; 285-305.

Kochi A, Vareldris B, Styblo K. Multidrug-resistant tuberculosis and its control. Res. Mycrobiol. 1993; 144: 104-110.

Nguen T. The current status of global tuberculosis control. Family Health Intern. (FHI) 1999; 2.

Raviglione M, Gupta R, Dye C, Espinal M. The Burden of Drug-Resistant Tuberculosis and Mechanisms for Its Control. New York Academy of Sciences 2001; 953: 88-91.

WHO. Guidelines for surveillance of drug resistance in tuberculosis. Int J Tuberc Lung Dis 2002; 2(1): 72-89

Размещено на Allbest.ru