Размещено на http://www.allbest.ru/

пептидное соединение эритроцит гемоглобиновый

МЕХАНИЗМ ОБРАЗОВАНИЯ ПЕПТИДНЫХ СОЕДИНЕНИЙ В ЭРИТРОЦИТАХ ЧЕЛОВЕКА

Кленова Н.А., Кленов Р.О.

Многие биологические активные соединения имеют пептидную природу. Известно более 200 эндогенных пептидных соединений, которые являются фрагментами цепей гемоглобина. Функция гемоглобина как предшественника сигнальных молекул может быть сравнима по важности с ролью переносчика кислорода и представляет несомненный интерес. Образующиеся пептидные молекулы обладают широким спектром биологической активности - опиоидной, рилизинговой, антипролиферативной, эритропоэтиновой. По данным А.А. Карелина и соавторов [1] лизис гемоглобина осуществляется комплексом высокоспецифических протеаз, локализованных на внутренней стороне мембраны эритроцита. Механизмы активации данного комплекса ферментов в настоящее время неизвестны. Возможно, активация протеаз осуществляется через фосфорилирование специфическими протеинкиназами, которые в свою очередь активируются цАМФ в результате работы аденилатциклазного комплекса.

Включение аденилациклазной системы сигнальными молекулами в этом случае будет сопровождаться увеличением производства пептидных соединений внутри эритроцитарных клеток. Целью исследования стало определение содержания пептидных соединений в ТХУ-экстрактах эритроцитов в условиях активации и блокирования в-адренорецепции и доказательство их гемоглобиновой природы.

Материалы и методы. Работа проводилась на эритроцитах крови человека, предоставленной Областной станцией переливания крови. Объектом исследования служила чистая фракция эритроцитов человека, разделенная по возрасту на молодые и старые клетки [2]. минут. Фракции молодых и старых эритроцитов помещали в среду Рингера-Локка в отношении 1:

1. Добавляли растворы адреналина и обзидана в конечной концентрации 10 мкг/мл, что превышало физиологическую концентрацию в 10 раз. Затем пробы отмывали 0,154 М холодным раствором NaCl при 600 G однократно в течение 10 минут. Белки осаждали 10% ТХУ, добавляя к суспензии эритроцитов в отношении 1: 2, и центрифугировали при 1000 G в течение 10 минут.

В 0,2 мл надосадочной жидкости (ТХУ-экстракта) каждой пробы определяли содержание пептидных соединений по методу Лоури, с добавлением 0,2 мл фосфатного буфера (pH 7,2) для нейтрализации излишней кислотности проб. Измерение оптической плотности производили на спектрофотометре СФ-46.

1 мл экстракта каждой пробы фракции молодых эритроцитов без инкубации исследовали с помощью ионообменной хроматографии (колонка 8Ч210 мм, заполненная диэтиламиноэтилцеллюлозой, 0,1М трис-буфер pH 8,0 в качестве подвижной фазы, скорость элюции 0,5 мл/мин). Детекцию проводили на СФ-46 при длине волны 254 нм. Результаты выражали в усл. ед. - ОПЧ1000.

Деградацию гемоглобина под действием пепсина проводили по методу Асатиани [3], инкубируя препараты гемоглобина и пепсина (Serva,GFR) в течение 4 часов в термостате при 37^оС. 0,5 мл отбирали и депротеинировали 1 мл 10% ТХУ. Затем центрифугировали при 1000 G в течение 10 мин. 1 мл надосадочной жидкости использовали также для ионообменной хроматографии.

Для статистической обработки результатов использовали критерий Фишера-Стьюдента.

Результаты и обсуждение. Полученные нами ранее данные показали, что инкубация в течение 20 минут при 37⁰С гетерогенной популяции эритроцитов, а также отдельно фракций старых клеток в условиях активации и блокады адренорецепции не сопровождается достоверным увеличением количества пептидных соединений при активации аденилатциклазной системы. Инкубация молодых клеток характеризовалось повышенным фоном содержания пептидов и достоверным их увеличением при совместном действии лиганда и антагониста [4]. Мы предположили, что это связано с повреждением мембраны эритроцита и выходом части пептидных соединений в инкубационную среду. Вероятно также, что процесс генерации пептидов, как и производство цАМФ, определяется энергоресурсами клетки. Также на производство пептидных молекул внутри клетки может оказывать длительность воздействия сигнальных молекул. Чтобы проверить эти предположения, мы определили содержание пептидных соединений во фракции молодых эритроцитов после инкубации с адреналином и обзиданом, а также без инкубации во фракциях клеток, различающихся по энергостатусу и состоянию мембран: молодых и старых.

Таблица

Содержание пептидных соединений в ТХУ-экстрактах фракций эритроцитов в условиях активации и блокады в-адренорецепции (мкг/мл) (n=6)

Примечание: * - достоверность различия р<0,05; ** - достоверность различия р<0,01.

Исследования, проведенные без инкубации на клетках, различных по возрасту подтвердили возникшие предположения. Фракция молодых эритроцитов при воздействии адреналина имела достоверно более высокую концентрацию пептидных соединений (табл). Процентное повышение составило 42,3%. При блокировании в-адренорецепции обзиданом, содержание пептидных соединений не отличалось от контрольной пробы. Совместное воздействие адреналина и обзидана сопровождается только тенденцией к повышению содержания пептидных молекул. Вероятно, это объясняется эффективной конкуренцией обзидана за в-адренорецептор в первые мгновения действия лиганда и антагониста [5,6].

Фракция старых эритроцитов отличалась гораздо меньшим фоновым значением содержания пептидных молекул (р<0,01). Возможно, это связано с ухудшением состояния эритроцитарных мембран и энергообеспечения клеток, вызванное возрастными изменениями в составе мембраны и в активности некоторых ферментов [6,7]. Вероятно, по этим причинам в пробах фракций старых эритроцитов не наблюдалось достоверных различий в содержании пептидных соединений. Однако в этих пробах присутствует сходная с фракцией молодых эритроцитов тенденция изменений. Для подтверждения предположения, что пептидные молекулы экстрактов являются продуктами протеолитической деградации гемоглобина, мы провели сравнение их хроматограмм, полученных ионообменной хроматографией, с хроматограммами пептидов, полученных в результате инкубации пепсина с гемоглобином в течение 4 ч. с постадийным забором проб для хроматографии из инкубационной среды. Хроматография экстрактов из инкубационной среды гемоглобина с пепсином показала наличие двух, четко разделенных пиков: на 18 мл и на 27-33 мл элюата. В зависимости от времени инкубации менялась лишь высота пиков, что возможно определялось изменением количественного состава пептидных соединений и их соотношения, обусловленное работой фермента (рис.1.).

Рис. 1. Ионообменная хроматография пептидных соединений, полученных деградацией гемоглобина пепсином в течение 4 ч. инкубации (усл.ед.)

Рис. 2. Ионообменная хроматография пептидных экстрактов эритроцитов в условиях активации и блокады адренорецепторов (усл.ед.)

Хроматография экстрактов фракции молодых эритроцитов также показала наличие пика на 27-33 мл элюата и в пробах, содержавших адреналин пик на 18 мл (рис.2.). Появление дополнительного пика при внесении в пробу сигнальных молекул может свидетельствовать о том, что адреналин не только повышает общий уровень содержания пептидных соединений внутри эритроцитов, но и качественно изменяет их состав.

Если судить по второму пику, характерному для всех проб, то можно сказать о подтверждении данных, полученных ранее о количественном содержании пептидных соединений в присутствии сигнальных молекул. Добавление адреналина повышало этот уровень на 35% (p<0,001), а совместное внесение адреналина с обзиданом вызывало повышение содержания пептидов на 31% (р<0,05), что связано с некоторой конкуренцией этих молекул за рецептор.

Таким образом, появление пептидных соединений в эритроцитах человека обусловлено протеолитической деградацией гемоглобина. Обнаружение эффекта увеличения скорости производства пептидов при кратковременном воздействии лиганда подтверждает сигнальный механизм активации примембранного комплекса протеолитических ферментов, зависящий от уровня производства цАМФ.

Литература\