Белки теплового шока семейства 70 кДа в оценке состояния организма человека в норме, при стрессе и патологии

Размещено на http://www.allbest.ru/

БЕЛКИ ТЕПЛОВОГО ШОКА СЕМЕЙСТВА 70 КДА В ОЦЕНКЕ СОСТОЯНИЯ ОРГАНИЗМА ЧЕЛОВЕКА В НОРМЕ, ПРИ СТРЕССЕ И ПАТОЛОГИИ

Андреева Л.И., Бойкова А.А.,

Маргулис Б.А.

Наряду со специальными мероприятиями в лечении конкретных заболеваний важно оценить и учитывать общее состояние организма пациента, куда, прежде всего, целесообразно отнести такие характеристики, как наличие стресс-реакции, уровень реактивности организма и его адаптационные возможности. Наиболее доступным и информативным биологическим материалом в данном случае служат клетки крови обследуемого человека. В этой связи невозможно не упомянуть исследования Л.Х. Гаркави и сотрудников, взявших за основу такой простой и очевидный показатель, как количественный состав форменных элементов лейкоцитов крови. В результате анализа большого количества фактического материала и теоретических разработок авторы сформулировали концепцию оценки качественного спектра множественных состояний организма. Динамизм смены состояний, в основе которого лежит колебательный характер изменений, обусловлен фундаментальными свойствами живой материи. По мнению авторов, существует закономерная смена состояний организма, которую отражает «Периодическая система реакций», включающая состояния тренированности, активации, стресса. После снятия стресса различные состояния организма закономерно сменяют друг друга, периодически могут возникать переактивация и состояние ареактивности [Гаркави и др., 1990]. Авторы считают, что все эти моменты необходимо учитывать при оценке состояния пациента и индивидуальном подходе к лечению [Гаркави и др., 1998]. Если помнить о преемственности в развитии науки, необходимо отдать дань уважения ученому, сделавшему новаторский прорыв в представлении об общей неспецифической реакции организма на стресс, являющийся предвестником болезни и неотъемлемой частью болезни, а также ввел понятие адаптационного синдрома, болезней адаптации, - Гансу Селье, столетний юбилей которого будет отмечаться в 2007 году.

Приступая к своим исследованиям, мы рассчитывали, что лейкоциты крови могут быть своеобразным зеркалом, отражающим состояние всего организма, а содержание в них белков теплового шока будет свидетельствовать о том, испытывает ли клетка (организм) какое-либо напряжение и какова степень этого напряжения. Вначале мы не предполагали, что сможем судить об адаптационном потенциале клеток и организма в целом. Основным показателем, который мог бы наиболее адекватно отразить неспецифическую реакцию клеток на вызов, предъявляемый извне, были выбраны белки теплового шока (БТШ) или, иными словами, белки стресса.

Активация генома клеток в ответ на тепловое воздействие впервые была отмечена в 1962 году F. Ritossa в слюнных железах дрозофилы, впоследствии был идентифицирован паттерн экспрессируемых белков теплового шока [Tissieres A. et al., 1974]. Однако почти одновременно с открытием активации экспрессии БТШ в ответ на нагревание было найдено, что химические вещества, физические воздействия, некоторые лекарства, например, аспирин также усиливают синтез БТШ. Количество агентов, способных вызвать повышенную экспрессию БТШ лавинообразно нарастало. Еще задолго до открытия БТШ крупный вклад в развитие идеи об определяющей роли белков в реакции клетки на действие самых разнообразных факторов химической и физической природы внесли отечественные ученые Д.Н. Насонов и В.Я. Александров. В 30-40 годы ими была обнаружена закономерность, что достаточно сильное раздражение или повреждение клеток любой природы приводит к состоянию паранекроза, сущность которого заключается в изменении состояния внутриклеточных белков [Насонов Д.Н., Александров А.Я., 1940, Насонов Д.Н., 1962, Насонов Д.Н., 1963]. Последнее проявляется в повышении вязкости протоплазмы, ее желатинизации, то есть возникают изменения денатурационной направленности, которые в начальной стадии обратимы. Наверное, легче было бы составить список агентов, не способных вызвать денатурацию белка, так как прижизненные денатурационные изменения внутриклеточных белков были отмечены при действии тепла, холода, лучистой энергии, ультразвука, поверхностного натяжения, высокого гидростатического давления, изменения рН, изменения ионной силы раствора, ионов тяжелых металлов, спиртов, детергентов, мочевины, неполярных растворителей, соединений, рвущих S-S связи, и многих других [Александров В.Я., 1985]. В этой связи становится понятной потребность в белках теплового шока, основной функцией которых является способность связываться практически со всеми функциональными клеточными белками, помогать приобрести нужную конформацию вновь синтезированным белкам, охранять их от действия протеаз, восстанавливать частично нарушенную структуру белков, либо сопровождать необратимо денатурированные белки в лизосомы, то есть выполнять функцию защиты и сопровождения (шаперонную функцию) для других белков. Отсюда следует, что действие факторов, изменяющих структуру или повреждающих клеточные белки, должно усиливать потребность в БТШ. Кроме того, становится ясно, что увеличение экспрессии БТШ - это универсальный механизм неспецифической реакции клеток на стресс подобно тому, как возникает неспецифическая реакция организма на стресс, особо выделенная Г. Селье, которая включает универсальное нейро-гормональное звено.

БТШ представлены в клетках всех ныне живущих организмов, включая археобактерии (одноклеточные гетеротрофы горячих источников), абсолютно всех представителей царств растений и животных. Этот факт свидетельствует о том, что белки теплового шока являются неотъемлемой частью эволюционного процесса и крайне необходимы для функционирования всех белков клетки, чем определяется в конечном итоге возможность ее существования. Некоторые представители БТШ постоянно присутствуют в клетке, обеспечивая структуру и функцию других белков, сопровождая вновь синтезируемые белки к местам их функционирования и участвуя в принятии ими нужной конформации. Стрессорные воздействия вызывают массивную экспрессию нескольких семейств БТШ [Burdon, 1988, Маргулис, Гужова, 2000]: высокомолекулярных белков (90-110 кДа), БТШ 70, БТШ 60, БТШ 40, БТШ 27 и низкомолекулярных БТШ убиквитинов (8,5-12 кДа). Более мелкие белки не являются частью более крупных, они представляют собой продукты разных генов и отличаются по первичной структуре. Однако, как выяснилось, всех их объединяет свойство повышенного сродства к широкому спектру функциональных клеточных белков, взаимодействие с которыми является энергозависимым и происходит с участием АТФ.

В наших исследованиях в качестве маркеров состояния клеток были выбраны два представителя семейства белков теплового шока, относящихся к семейству БТШ70. Индуцибельный белок heat shock protein 72 (HSP72) известен своим массивным синтезом в ответ на действие многих факторов: главным образом тепла, действия химических агентов, тяжелых металлов, также отмечено увеличение его содержания при гипоксии/ишемии. Вторым белком, попавшим в поле зрения наших исследований, был постоянно экспрессируемый в клетке представитель данного семейства конститутивный белок heat shock cognate 73 (HSC73). Мы использовали специфические моноклональные антитела: 2H9 к белку HSP72 и N69 к белку HSC73. Данные антитела были получены в лаборатории защитных механизмов клетки Института Цитологии РАН, возглавляемой Б.А. Маргулисом.

Следует подробнее остановиться на известных свойствах данных белков. Оба белка присутствуют в цитоплазме и ядре клеток. Они являются членами семейства БТШ70, к которому также относят постоянно экспрессируемые белок GRP78 эндоплазматического ретикулума и белок mt-HSP 70 (GRP75) митохондриального матрикса. Содержание конститутивных белков-шаперонов семейства БТШ70 может достигать 1% от общего количества клеточного белка в нормальных условиях, что свидетельствует об их незаменимой роли в обороте белков, регуляции их структуры, активности и субклеточной локализации [Gunther, Walter, 1994].

HSC73, являясь примером межвидовой консервативности, постоянно экспрессируется в клетках в отсутствие стресса, выполняет функцию молекулярного шаперона для вновь синтезируемых белков, участвует в их транспорте в клеточные органеллы, а также переносит необратимо поврежденные полипептиды и белки в протеасомы для их последующей деградации с участием убиквитина. Индуцибельная изоформа, HSP72, отвечает значительной экспрессией в ответ на стрессирующие воздействия. В связи с этим считают, что основным предназначением HSP72 является выполнение защитной функции по отношению к клеточным белкам. Взаимодействие HSP72 с денатурированными белками приводит к восстановлению их нативной конформации. В случае необратимой денатурации, белки, связанные с HSP72, в дальнейшем подвергаются протеолизу. Находятся свидетельства тому, что при стрессе не только HSP72, но и HSC73 также может выполнять защитную роль. Так, например, стабильный клон миоцитов сердца крысы с встроенным геном hsc73 становится более устойчивым к окислительному стрессу и тепловому шоку [Chong et al., 1998].

В литературе содержится большое количество сведений об особенностях экспрессии HSP72 и HSC73 в разных клетках, тканях, органах, организмах в норме и при стрессе. Наряду с различиями между HSC73 и HSP72 неоднократно отмечается сходство их физиологических функций [Brown et al., 1993, Rassow et al., 1995], что объясняют достаточно высокой структурной идентичностью, которая составляет более 90 % [Lindquist, Craig, 1988], по другим данным - 85 % [Gunter, Walter, 1994]. Структурное сходство молекул HSC73 и HSP72 больше в N-концевой АТФ-азной субединице, чем в пептид-связывающей С-концевой субединице, что, очевидно, является причиной особенностей связывания различающихся по структуре пептидов. Гены hsc73 и hsp72 различаются по их топологии и особенностям экспрессии. Гены, кодирующие индуцибельную изоформу, представлены в геноме человека в более, чем 10 локусах в 1, 5, 6, 11, 14, 20 и 21 хромосомах. Что касается генов конститутивной изоформы, то они рассеяны в геноме человека в виде псевдогенов, то есть вторично встроенных в геном обратных транскриптов. Это происходит на ранних стадиях эмбрионального развития [Gunther, Walter, 1994]. Была показана локализация гена hsc70 человека в 11 хромосоме в области 11q23.3-q25 [Tavaria et al., 1995]. Промотор большинства генов семейства БТШ70 компактный, содержит 200 нуклеотидов с часто повторяющимися HSE (heat shock element) [Gunther, Walter, 1994]. Несмотря на сходство регуляторных элементов промоторов, включающих TATA, GC, CCAAT boxes и другие, пока не охарактеризованы особенности и кооперативность их взаимодействия, обеспечивающие экспрессию генов hsc73 и hsp72 в норме и при стрессе. Усиление синтеза HSC73 достигается в мягких условиях, а индукция HSP72 требует более жестких условий, когда подключаются дополнительные регуляторные факторы и механизмы [Hung et al., 1998].

Глобальной задачей наших исследований являлось выяснить, как будет изменяться содержание данных белков, представителей семейства БТШ70, в мононуклеарной фракции лейкоцитов периферической крови людей при различного рода воздействиях на макро организм.

Первый пример - исследование содержания HSP72 и HSC73 в мононуклеарной фракции (лимфоциты и моноциты) клеток крови мужчин с легкой, средней и тяжелой степенью случайного отравления солями таллия [Андреева и др., 2001а]. Исследования проводили через 2 месяца после отравления. Известно, что таллий достаточно долгое время персистирует в организме и, несмотря на лечение с применением комплексонов и гемодиализа, может месяцами присутствовать в организме, что объясняют его сходством с ионами калия и заместительной способностью по отношению к ним. Таллий является сугубо токсичным металлом и оказывает повреждающее цитотоксическое действие даже в малых дозах. Замещая ионы калия в клетках организма, участвующего в образовании ионо-водо-белкового комплекса, таллий, по всей видимости, способен изменять структурно-функциональные свойства клеточных белков. Нами было обнаружено, что при отравлении солями таллия повышено содержание в сыворотке крови и в среде инкубации разбавленной крови фактора некроза опухолей, а в среде инкубации мононуклеарных клеток накопление нитрит иона превышало таковое у здоровых людей в 2-3 раза. Эти данные свидетельствуют об активации свободно радикальных процессов, что в совокупности с предполагаемой изменением конформации внутриклеточных белков в присутствии таллия, является стрессогенными факторами для клеток. Прежде всего, мы отметили возрастание в несколько раз содержания HSP72 во фракции мононуклеарных клеток крови (рис. 1б).

Интересно, что содержание HSC73 также несколько возрастало (рис. 1а).

Рис. 1. Выявление HSC73 (а) и HSP72 (б) иммуноблотингом в мононуклеарных клетках крови. С - стандартный белок; 1, 2, 3 - мононуклеары крови здоровых людей; 4, 5, 6 - мононуклеары крови отравленных таллием.

Самочувствие больных через 2 месяца после отравления солями таллия было удовлетворительным, они были выписаны из клиники и находились на амбулаторном лечении, поэтому можно было говорить о стабилизации их состояния и, по всей видимости, о возникновении компенсаторно-адаптационных изменений гомеостаза.

Второй пример - исследование воздействия двукратного значительного по силе нагревания на здоровых молодых людей. В исследовании участвовало 9 молодых мужчин в возрасте 19 лет, которые подвергались физическому разогреву в климатическом комплексе «Man-rated altitude chamber for physiological research work model V-18» (Tabai, Japan) [Андреева и др., 2001б]. В комплексе поддерживалась температура воздуха +45^оС, влажность 45%, скорость движения воздуха 1-2 м/с. Добровольцы находились в легкой одежде, для акселерации гипертермии периодически выполняли дозированную физическую работу на велоэргометре. Процесс разогрева контролировали постоянным мониторингом ректальной температуры. Критериями порога переносимости гипертермии были: достижение ректальной температуры 39,5^оС или ухудшение самочувствия обследуемых и их отказ от дальнейшего пребывания в условиях теплового воздействия. Кровь отбирали из локтевой вены в начале исследования (точка 1), после выхода из климатического комплекса (точка 2), и на следующий день (точка 3). По той же схеме забор крови осуществляли через неделю (точки 4, 5, 6).

Физиологические показатели при первичном и повторном нагреве претерпевали однонаправленные изменения. Так, частота сердечных сокращений (ЧСС) при первичном нагреве возрастала в среднем на 80%, минутный объем дыхания в среднем на 60%, потребление кислорода и энергозатраты в среднем на 40%. Однако при повторном нагревании выраженность компенсаторных реакций была меньше, статистически достоверно увеличивалась лишь ЧСС в среднем на 60%. Адаптационные изменения при повторном нагревании отчетливо выявились в результате анализа кривой разогрева организма: латентный период до начала подъема температуры тела несколько увеличился и средняя скорость разогрева в первые 60 минут пребывания в климатическом комплексе снизилась почти в 2 раза.

Тепловое воздействие приводило к выраженной гормональной реакции организма. Так, в сыворотке крови выявлено значительное увеличение содержания гипофизарного гормона пролактина в ответ на гипертермию. Содержание гормонов надпочечников: кортизола и альдостерона также увеличивалось. Изменения со стороны тиреотропного гормона и гормонов щитовидной железы были не столь выражены. Однако разогревание приводило к некоторому угнетению выхода ТТГ, при этом содержание трийодтиронина (Т3) и тироксина (Т4) вслед за небольшим увеличением также имело тенденцию к снижению. Выявленная гормональная реакция свидетельствует о возникновении теплового стресса.

Воздействие тепла на целый организм, вызвавшее реакцию со стороны нервной и эндокринной систем, не могло не отразиться на метаболизме и функциональном состоянии отдельных клеток. Инкубация разбавленной в 10 раз культуральной средой крови в течение суток выявила повышение продукции NO клетками. Содержание нитрита возрастало в образцах крови, полученных после первого нагрева, но максимум фиксировали после повторного нагрева, когда генерация NO увеличивалась в 3 раза по сравнению с исходными образцами крови. Исследование экспрессии HSP72 и HSC73 в мононуклеарных клетках крови показало, что свежевыделенные клетки хотя и демонстрируют несколько повышенное их содержание после нагревания по сравнению с исходным состоянием (точка 1), но по большей части эти изменения происходят не одинаковым образом у разных людей. Инкубация мононуклеарных клеток с фетальной сывороткой коров позволила выявить их готовность к экспрессии белков теплового шока. При нагревании клеток in vitro содержание HSP72 увеличивалось в клетках, в ряде случаев значительно, в 10-20 раз превышая исходное содержание, особенно в точках 3 и 4. Последнее свидетельствует о том, что тепловой шок in vitro приводит к исключительно массивной экспрессии HSP72 в особенности у тех людей, которые подверглись нагреванию (рис. 2). Важно отметить, что содержание HSC73 после инкубации мононуклеарных клеток прогрессивно увеличивалось, достигая максимальных значений в точках 5 и 6 (рис. 3). При этом в отличие от HSP72 в ответ на тепловой шок in vitro содержание HSC73 в мононуклеарных клетках не увеличивалось.

Таким образом, индукция экспрессии разных белков теплового шока с молекулярной массой 70 кДа или готовность к ней при тепловом стрессе происходит по-разному. Повышенная температура, возможно, окислительный стресс, то есть факторы, способствующие денатурационным изменениям белков, в первую очередь, индуцируют HSP72 и его содержание может быть значительным, доходя по нашим расчетам до 1 и более пикограмм на клетку. Для HSP72 характерна массивная экспрессия в ответ на «аварийную ситуацию» в клетке, вероятно, когда денатурационные изменения белков значительны.

С 1 2 3 4 5 6

Рис. 2. Увеличение содержания HSP72 в мононуклеарных клетках крови (16 ч в культуре) после теплового шока in vitro у людей, подвергшихся нагреванию. C - стандартный белок; 1, 3, 5 - клетки без теплового шока; 2, 4, 6 - клетки после теплового шока.

С 1 2 3 4 5 6

Рис. 3. Прирост содержания HSC73 в мононуклеарных клетках крови по срокам исследования после инкубации клеток с фетальной сывороткой плодов коров. С - стандартный белок; 1- 6 - точки взятия крови по срокам исследования.

белок тепловой шок кровь

Данный белок характеризует лабильная динамика его экспрессии: cрочное реагирование, которое можно объяснить быстрой активацией транскрипционных факторов и отсутствием интронов в гене hsp72, но и такое же быстрое снижение экспрессии в случае возвращения клетки в нормальное состояние. По всей видимости, длительная массивная экспрессии HSP72 не способствует нормальному функционированию клетки, так как синтез большинства функциональных белков при этом репрессирован. Накопление HSC73 в мононуклеарных клетках крови усиливается после нагревания организма и не является столь значительным, каким может быть накопление HSP72, носит устойчивый характер и, возможно, необходимо для шаперонирования и фолдинга различных вновь синтезируемых функциональных белков. Впервые мы предположили, что белок HSC73 необходим для адаптационных изменений в клетках, формирования адаптационного следа и повышения достаточно продолжительной устойчивости клеток после испытания организмом теплового стресса.

Проведенные исследования касались ситуаций, когда имелись признаки стресс-реакции на клеточном и организменном уровне. Мы показали, что существует параллелизм между стрессом, который испытывает организм и клеточным стрессом, то есть накоплением в мононуклеарной фракции клеток крови HSP72. Таким образом, HSP72 является маркером стресса как мононуклеарных клеток крови, так и всего организма [Андреева, Бойкова, 2004]. Содержание конститутивного белка HSC73 при тепловом стрессе не изменяется, а в период последействия тепла начинает увеличиваться, что, по-видимому, связано с усилением синтеза клеточных белков при адаптации. Чтобы проверить это предположение мы прибегли к воздействию, которое по известным данным не приводит к инициации стресс-реакции на уровне организма, но повышает степень его неспецифической резистентности. Таким воздействием может быть нормобарическая гипоксическая тренировка.

Физиологические исследования показали, что интервальная гипоксическая тренировка способствует совершенствованию механизмов обеспечения организма кислородом на системном и тканевом уровнях. Адаптационные изменения при действии гипоксии происходят также на молекулярно-клеточном уровне, что выражается в экспрессии генов, кодирующих белки, которые участвуют в энергетическом обмене, антиоксидантных метаболических системах, а также кодирующих регуляторные белки, например, эритропоэтин, фактор роста эндотелия сосудов [Semenza, 1999]. В исследовании участвовало 10 практически здоровых лиц, из них 8 мужчин в возрасте 20-22 года и 2 женщины в возрасте 52 года. Дыхание обедненным по кислороду воздухом, поступающим от блока с селективной мембраной гипоксикатора ГИП 10-1000, осуществлялось через маску. Курс нормобарической гипокситерапии состоял из 10-15 сеансов, проводимых ежедневно, кроме выходных дней, по 30 мин каждый сеанс. Содержание кислорода в гипоксической газовой смеси снижали от 12% до 10% в первые три дня, затем оставляли на нижнем уровне в течение всего курса [Бойкова и др., 2006].

Все обследованные лица до, в процессе и после нормобарической гипоксической тренировки не жаловались на плохое самочувствие. По субъективной оценке у части обследуемых в первые дни выхода на режим с минимальным содержанием кислорода отмечались незначительные проявления дискомфорта во время сеансов, которые затем проходили. В основном жалобы касались неудобства выдыхания через клапан и ощущения нехватки воздуха. В конце курса нормобарической гипоксической тренировки у всех обследуемых повышалась физическая активность, улучшалась работоспособность, сон, снижалась утомляемость, исчезали признаки астенического состояния и депрессии. Ранее при разработке режимов нормобарического гипоксического воздействия на используемых нами гипоксикаторах были проведены развернутые исследования по оценке состояния испытуемых с дополнительными нагрузочными пробами. Было показано, что после курсов нормобарической гипоксической тренировки, в том числе и в использованном нами режиме, улучшалась умственная и физическая работоспособность, повышалась устойчивость к неблагоприятным температурным, гравитационным и шумовым воздействиям [Горанчук и др., 2003].

Признаков, соответствующих состоянию стресса, по окончании курса нормобарической гипоксической тренировки мы не обнаружили. Так, было показано, что после сеансов гипоксии не происходило увеличения уровня кортизола в сыворотке крови обследуемых людей. Во всех случаях содержание кортизола находилось в пределах величин, соответствующих нормальным значениям, и составляло до курса нормобарической гипоксической тренировки 464,1 + 71,6, а после него - 445,5 + 81,8 наномоль/л.

Анализ формулы крови до и после сеансов нормобарической гипоксической тренировки, также не показал наличия стресс-реакции у обследованных. Не было отмечено увеличения количества лейкоцитов. Нейтрофилез и лимфопения также не возникали. Судя по морфологическому составу белой крови, а именно росту в пределах нормальных значений количества моноцитов и палочкоядерных нейтрофилов, наметились сдвиги в сторону увеличения напряжения [Гаркави и др., 1998]. Это свидетельствует об активационном воздействии нормобарической гипоксической тренировки. Кроме того, данные, характеризующие состояние свободно-радикальных процессов в организме, свидетельствуют о том, что имела место тенденция к их активации. А именно, в сыворотке крови наметилось увеличение содержания продуктов, реагирующих с тиобарбитуровой кислотой (стимулированный уровень), снижение восстановленных SH-групп и увеличение содержания окисленных S-S связей. Таким образом, нормобарическая гипоксическая тренировка в выбранном нами режиме не привела к развитию стресс-реакции к концу сеансов, но имело место активационное воздействие на организм.

Анализ содержания двух изоформ белков теплового шока 70 в мононуклеарах крови выявил, что у всех обследуемых не происходило увеличения содержания HSP72 - основного белка данного семейства, экспрессируемого в ответ на стресс, после сеансов гипоксии. У большинства лиц содержание HSP72 даже снижалось. Это указывает на то, что и на клеточном уровне выбранный нами режим нормобарической гипоксической тренировки не оказал стрессирующего воздействия (рис. 4а). Однако были получены интересные результаты, подтверждающие наши предыдущие наблюдения об участии HSC73 в адаптационных процессах. Так, мы обнаружили, что у 6 человек содержание HSC73 увеличивалось в 1,5-2,0 раза (рис. 4б), у остальных не изменялось.

Рис. 4. Изменение содержания двух изоформ белков теплового шока 70 кДа в мононуклеарных клетках крови у отдельных лиц после курса нормобарической гипоксической тренировки (НГТ). С- стандартный белок; 1 - до курса НГТ; 2 - после курса НГТ. а - HSP72, б - HSC73.

В настоящее время стало известным, что набор и количественный состав клеточных белков меняется в зависимости от вида и стадии любого активирующего, раздражающего, нагрузочного воздействия на организм, и имеет как неспецифические компоненты, так и специфические, определяемые особенностями действующего фактора. Так, например, при падении напряжения кислорода в клетке накапливается активный транскрипционный фактор, индуцируемый гипоксией, что приводит к активации экспрессии нескольких десятков генов, кодирующих синтез белков, обеспечивающих адаптацию к гипоксии [Semenza, 2004]. Из неспецифических генов, активируемых при различных воздействиях, выделяются, в первую очередь, быстро экспрессируемые гены раннего ответа, такие как с-fos, c-myc, c-jun. Пептидные продукты последних связаны с возможным вступлением клетки в клеточный цикл деления и/или с ее гипертрофией. Активируемые при стрессе гены индуцируемых белков теплового шока также относятся к неспецифическим генам.

Любое стрессирующее воздействие на организм вызывает напряжение энергопродуцирующих систем. По мнению Ф.З. Меерсона, высказанному еще в 70 годы, энергодефицит в клетках организма не только сопровождает стресс, но и необходим для индукции адаптационных изменений в них при разного рода воздействиях, в том числе при гипоксии. Митохондрии оказываются центральными органеллами в процессе развития неспецифической адаптации, вызванной возросшей потребностью клетки в энергетических субстратах. Cогласно данным Ф.З. Меерсона и цитируемых им авторов, при адаптации к гипоксии увеличивается активность митохондриальных ферментов и возрастает количество митохондрий на единицу массы ткани сердца, скелетной мышцы. Активация функций митохондрий и рост митохондриальных структур при гипоксии происходят также в клетках эндотелия сосудов, в нейронах головного мозга [Меерсон, 1974].

Нарастание числа митохондрий в какой-то мере компенсирует качественные дефекты их функционирования, что подтверждают данные о росте мощности митохондриальных структур в скелетных мышцах с возрастом, либо в случае генетических дефектов митохондриальных ферментов [Сухоруков, 2004]. С возрастом точность репликации генома митохондрий может быть нарушена мутациями, так как ДНК митохондрий плотно упакована и не содержит интронов, что делает ее более уязвимой к точечным мутациям и делециям, накапливающимся при старении [Wallace, 1992]. Увеличение количества митохондрий можно рассматривать как адаптационную реакцию клеток организма, направленную на компенсацию возникающего энергодефицита.

Каким же образом можно связать увеличение содержания конститутивной изоформы HSC73 с приобретаемой клеткой адаптацией? Ф.З. Меерсоном и соавторами одними из первых с позиций патофизиологов была исследована роль белков теплового шока 70 в приобретении клеткой, организмом неспецифической устойчивости к различного рода стрессорным воздействиям, которое было удачно названо «феноменом адаптационной стабилизации структур» [Меерсон и др., 1991, Меерсон и др., 1993]. Авторы в то время еще не могли вычленить роль отдельных изоформ данного семейства белков в транзиторной устойчивости клеток организма к стрессу и в приобретении ими продолжительной адаптации. Отдельные работы по поводу причастности именно HSC73 к обеспечению функционирования митохондрий только появлялись [Deshaies et al., 1988, Gupta, 1990, Sheffield et al., 1990]. В дальнейшем была показана защитная роль HSC 73 при гипоксии в отношении структурной целостности митохондрий, а именно: воздействие гипоксических эпизодов на астроциты крысы в первичной культуре приводило к набуханию митохондрий, при этом отмечали уменьшение содержания в клетках HSC73. Сохранение повышенного уровня HSC73 с помощью альмитрина предотвращало набухание митохондрий [Copin et al., 1995].

Безусловно, уникальная роль HSC 73 в приобретении клеткой, организмом адаптации к гипоксии не ограничивается его участием в поддержании функциональной активности и биогенеза митохондрий, исходя из того, что HSC73 взаимодействует на рибосомах с вновь синтезируемыми специализированными белками, выполняющими в клетке различные функции. Так, в частности, HSC 73 является незаменимым шапероном при сопровождении ряда белков в ядро [Iamamoto et al., 1992, Tsukahara, Maru, 2004], клеточные органеллы. Именно HSC73, а не HSP72, имея сродство к транслоказным участкам мембран органелл клетки, поддерживает импортируемые пептиды в не сложенном состоянии, что дает им возможность транспортироваться внутрь органелл [Brodsky J.L., 1996]. Это справедливо для эндоплазматического ретикулума и митохондрий [Gupta, 1990]. Для печени крысы было достаточно убедительно показано наличие прочно связанного с внешней мембраной митохондрий HSC73, его количество составляло 12 нанограмм на 1 мкг мембранного белка [Lithgow et. al., 1993].

Биогенез митохондрий вовлекает координированное действие как митохондриального, так и ядерного геномов. У человека митохондриальный геном содержит 37 генов, из них 13 генов кодируют белки дыхательной цепи внутренней мембраны митохондрий [Anderson et al., 1981]. От 1000 до 2000 митохондриальных белков в зависимости от вида клеток закодировано в ядерном геноме [Neupert, 1997], поэтому транспорт вновь синтезируемых митохондриальных белков с участием HSC73 имеет первостепенное значение при адаптации, когда происходит усиление биосинтеза митохондриальных структур.

На протяжении последнего десятилетия были получены доказательства специализированного участия HSC73 в транспорте конкретных белков в митохондрии. Так, опыты с ингибированием активности HSC73 с помощью антител к нему показали, что HSC73 участвует в транспорте орнитинтранскарбамилазы в митохондрии [Terada et al., 1995]. Было обнаружено, что связывание HSC73 с вновь синтезируемыми на рибосомах цитозоля в виде предшественников митохондриальными белками происходит уже во время трансляции [Terada et al., 1996]. HSC73 поддерживает не полностью сложенное состояние белка-предшественника, которое позволяет белку проходить через транслоказный участок митохондриальной мембраны. В митохондриях происходит протеолиз препептида и его складывание в активный белок. В настоящее время принята точка зрения, что HSC73 проявляет свою шаперонную активность только в связи с кошаперонами dj2 и dj3, относящихся к семейству белков теплового шока с молекулярной массой 40 кДа. Шаперонная активность данной системы усиливается антиапоптотическим белком bag-1 [Terada, Mori, 2000]. Кроме того, в импорте белков в митохондрии участвуют еще несколько белковых факторов цитоплазмы. Таким образом, HSC73, поддерживающий транспортируемый белок в не сложенном состоянии в составе комплекса с другими белками, на первом этапе участвует в переносе белка через TOM (translocase of the outer membrane) комплекс внешней мембраны митохондрий. Далее, подобно храповому механизму, белок преодолевает внутреннюю мембрану митохондрий через комплекс TIM (translocase of the inner membrane), как полагают, с участием конститутивного HSC75 матрикса митохондрий [Stojanovski et al., 2003].

По-видимому, функции двух изоформ белков теплового шока 70-kD могут перекрываться, особенно в условиях стресса, когда появляются поврежденные белки. Однако помимо орнитинкарбамилазы была обнаружена специфическая функция HSC73, но не HSP 72, в отношении транспорта еще одного митохондриального белка аспартатаминотрансферазы, которая связывается и транспортируется в митохондрии только при участии HSC73 [Artigues et al., 1998]. Вопрос о структурно-функциональных особенностях присутствия обеих изоформ данного белка в клетках во многом нашел ответ в работе S. Ellis и соавторов, проведенной на яйцеклетках китайского хомячка [Ellis et al., 2000]. Авторы использовали метод меченных коллоидным золотом специфических антител к каждой изоформе белка, так как обычная иммуногистохимическая методика не позволяла выявить различий в их локализации. Удалось показать, что в не стрессированных клетках HSP72 был расположен предпочтительно в ядрах, локализован в районах с гетерохроматином и в ядрышках. HSC73 встречался в различных компартментах клетки, но в наибольшей степени этот белок был представлен на поверхности митохондрий. После теплового шока HSP72 обнаруживался в ядрах и ядрышках, а HSC73 - в ядрах, ядрышках и цитоплазме, с увеличенной меткой около митохондрий. Митотические хромосомы также содержали много HSC73.

Согласно имеющимся в литературе сведениям, две основные цитоплазматические изоформы белков теплового шока семейства 70 kDa у позвоночных животных имеют большую идентичность структуры и обладают сходными физиологическими свойствами. Наряду с этим на сегодняшний день между ними выявлено достаточно много различий, а именно: особенности экспрессии, функционирования и распределения в клетке, взаимодействия с клеточными белками и липидами.

В наших исследованиях было показано, что мононуклеарная фракция лейкоцитов крови человека может содержать разные количества как HSP72, так и HSC73 в зависимости от состояния всего организма. У здоровых людей, не испытывающих стрессирующих воздействий на организм, содержание HSP72, как правило, низкое, но может быть значительно увеличено, например, в условиях гипертермии [Андреева и др., 2001б]. Увеличенное содержание HSP72 является одним из признаков, характеризующих стрессированность целого организма [Андреева, Бойкова, 2004]. Повышение содержания HSC73 в мононуклеарных клетках крови, мы связываем с возрастанием адаптационного потенциала клеток, и с приобретаемой организмом адаптацией.

Исходя из особенностей экспрессии генов hsc73 и hsp72 в разных условиях, различий в функциональных свойствах HSC73 и HSP72, незаменимой роли HSC73 в защите вновь синтезированных белков и их транспорте, мы предполагаем существование повышенной потребности именно в HSC73 для осуществления биосинтеза белков и их импорта в клеточные органеллы при адаптации. HSC73 необходим для предохранения митохондрий клеток от набухания [Copin et al., 1995] и является незаменимым компонентом комплекса, транспортирующего белки из цитоплазмы в митохондрии, без чего невозможно представить их функционирование и биогенез. Формирование адаптации, в первую очередь, связано с повышенной потребностью в энергообеспечении клетки, то есть с повышением функциональной активности и структурной мощности митохондрий [Меерсон, 1974]. Мы склонны считать, что наблюдаемое нами увеличение содержания HSC73 в мононуклеарных клетках крови человека при нормобарической гипоксической тренировке во многом отражает эти процессы. При этом нельзя не принимать во внимание участие HSC73 при адаптации в синтезе многих клеточных белков-ферментов, регуляторных белков, структурных белков цитоплазмы и клеточных органелл. Для подтверждения и уточнения выдвигаемых нами положений о связи HSC73 с процессом клеточной адаптации нужны дополнительные исследования.

Полагаем, что обнаруженное нами увеличение содержания HSC73 в мононуклеарной фракции клеток крови человека после курса нормобарической гипоксической тренировки может отражать адаптационные изменения, в том числе связанные с увеличенной нагрузкой на митохондрии клетки, повлекшей потребность в сохранении и усилении их функции. Специализированная роль именно HSC73, которая не может быть замещена участием HSP72, в импорте ряда белков в клеточные органеллы, а для процесса клеточной адаптации к гипоксии, в первую очередь, в митохондрии, является объяснением возрастания потребности в HSC73. В виду отсутствия увеличения содержания HSP72 в мононуклеарах крови лиц после курса нормобарической гипоксической тренировки, даже чаще наблюдали его снижение, в данном случае, вероятно, отсутствуют изменения структуры белков денатурационной направленности, связанные с клеточным стрессом. Напомним, что отсутствовали также признаки стресс-реакции целого организма. Еще более рельефно на этом фоне выступает увеличение содержания HSC73 в 1,5-2 раза, которое, по нашему мнению, можно рассматривать как признак происходящих в клетке адаптационных процессов. Полученные нами данные являются подтверждением сложившегося мнения о различной функциональной роли двух цитоплазматических изоформ белков теплового шока 70-kD, конститутивной и индуцибельной, в норме, при стрессе и при адаптации.

Таким образом, состояние организма человека и изменения, происходящие в нем при различного рода воздействиях и при патологии, находят отражение не только в количественных параметрах форменных элементов белой крови, но и в содержании двух изоформ БТШ70. Последнее обстоятельство дает возможность судить о выраженности стресс-реакции и происходящих в организме адаптационных процессах. Мононуклеарная фракция крови может быть удобным объектом для изучения воздействия лекарственных препаратов, обладающих адаптогенными свойствами, на клетки как in vitro, так и in vivo.

Размещено на Allbest.ru