ПЦР-скрининг actinobacilus actinomycetemcomitans и porphyromonas gingivalis у больных разных возрастных групп с воспалительными заболеваниями пародонта

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПЦР-скрининг Actinobacilus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis у больных разных возрастных групп с воспалительными заболеваниями пародонта

Клюшникова М.О., Молоков В.Д.,

Балахонов С.В, Осадчая Т.А.

Основным этиологическим фактором воспалительных заболеваний пародонта считаются патогенные микроорганизмы зубного налета. Разные авторы (Дмитриева Л.А. 2001 г., Ivo Drizhal 2000 г) насчитывают от 300 до 400 видов микробов в полости рта человека. По данным литературы наиболее значимыми пародонтопатогенами являются Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis (Дмитриева Л.А. 2001г., Сивовол С.И. 2001г., Безрукова И.В., Грудянов А.И. 2004). Оценивая роль того или иного микроорганизма в этиологии воспалительных заболеваний пародонта учитывается комплекс его характеристик. Вирулентность патогенных микроорганизмов зависит от способности к адгезии, инвазивности, капсуло- и токсинообразования, наличия механизмов защиты макроорганизма. Как известно иммунная протекция человека с возрастом меняется. Инволютивные изменения тканей пародонта имеют большое значение не только потому, что знание их помогает в диагностике заболеваний пародонта, но и в связи с тем, что старение тканей является сложной и до конца не изученной общемедицинской проблемой. Оно обусловлено изменениями в генетическом аппарате околозубных тканей, снижением обмена веществ, физико-химическими процессами на молекулярном уровне. Большую роль в старении тканей играют изменения сосудов, коллагена, активности ферментов, иммунобиологической реактивности, когда процессы распада клеток начинают преобладать над процессами их восстановления. Возрастные изменения сопровождаются снижением резистентности клеточных и тканевых элементов к действию местных факторов (травма, инфекция). Но на данный момент остается не изученной частота встречаемости Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis у разных возрастных групп больных с воспалительными заболеваниями пародонта.

Этиологическая диагностика данных микроорганизмов нередко крайне затруднительна из-за длительности и сложности проведения исследования наиболее широко известным методом анаэробного культивирования. В современных условиях микробиологической диагностики инфекционных заболеваний стало возможным использование молекулярно-генетических технологий, таких как полимеразная цепная реакция (ПЦР). Быстрота, высокая чувствительность, которые позволяют выявить единичные молекулы специфической ДНК в течении нескольких часов, а также не обязательность присутствия живых микроорганизмов, что облегчает транспортировку материала в лабораторию - все это способствует более эффективному решению задач в клинической диагностике.

Детекция патогенов осуществлялась методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Материалом для исследования служили препараты ДНК, выделенные из образцов зубного налёта и отделяемого пародонтальных карманов больных с воспалительными заболеваниями пародонта. Забор материала для ПЦР осуществлялся стерильными разовыми зондами Accellon multi (Швеция) с синтетическим ворсом и стерильным стоматологическим экскаватором. Выделение ДНК проводилось щелочным методом как описано нами ранее () а также с помощью наборов "ДНК-экспресс" (НПФ "ЛИТЕХ", Москва). патоген микроорганизм пародонт пцр

В качестве ДНК-мишени использовались нуклеотидные последовательности генов 16S rRNK Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis (Tran, Rudney 1996). ПЦР-тест-система составлена нами из следующих ингредиентов: праймеры AaF, PgF, C11R - 12 пмоль/мкл каждого; фермент Taq-pol - 5 ед/мкл; дезоксинуклеотидтрифосфаты (дНТФ)- 2 мМ; реакционный буфер 10х (трис-НCl - 0,7 М, сульфат аммония - 0,2 М, Твин 20 - 0,1 %, рН 8,5); раствор хлорида магния (MgCl2) - 10 мг/мл; раствор БСА - 4 мг/мл; вода деионизованная стерильная; вазелиновое масло. Все праймеры синтезированы фосфоамитидным методом с использованием олигосинтезатора Cene Assembler Plus (Pharmacia Biotech, Швеция). Использованы реактивы фирмы "Sigma" (США), а также наборы для ПЦР ("Клинбиотех", или VDI “Fermentas”, Литва).

Праймеры AaF, PgF вносят в реакционную смесь в количестве 1 мкл каждого, C11R - 2 мкл, дНТФ - 2,5 мкл, 10хПЦР буфер - 2,5 мкл, MgCl2 - 1,0 мкл, БСА - 1,0 мкл, фермент - 0,25 мкл, пробу - 10 мкл, деионизованную воду до конечного объема - 25 мкл. Амплификацию осуществляли под контролем компьютерной программы МС 16 на мультициклере "Терцик" МС-2 (АО "ДНК-технологии"). Температурный режим реакции: предварительная денатурация ДНК при температуре 94 0С в течение 5 мин; 35 циклов, включающих в себя денатурацию ДНК при температуре 95 0С в течение 1 мин., отжиг праймеров при температуре 61 0С в течение 1 мин., синтез коплементарной цепи при температуре 72 0 С в течение 2 мин. После последнего цикла пробирки прогревают в течение 5 мин при температуре 72 0С. Учёт результатов ПЦР проводилась гель-элекрофорезом в 1,5% агарозе (Sigma, Type I, США) в трис-боратной буферной системе с цифровой видеодокументацией.. Для определения размеров ампликонов использовали маркеры молекулярного веса ДНК 100 и 1000 пар нуклеотидов (п. н.) с размерами фрагментов: 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 и 10000, 8000, 6000, 5000, 4000, 3000 x 2, 2500, 2000, 1500, 1000 x 2, 750, 500, 250 п. н. соответственно ("Медиген", Новосибирск). Результаты электрофореза документировали с помощью видеосистемы "DNA Analyzer" с программой "Gel Imager 3.0". Определение молекулярного веса ампликонов производили с использованием программы "Gel Analysis 1.0".

Нами проведено клиническое обследование больных с воспалительными заболеваниями пародонта. Кроме основных методов обследования (опрос, осмотр, пальпация, перкуссия, определение глубины пародонтальных карманов и др.), использовалась индексная оценка состояния тканей пародонта и рентгенологическое обследование. Для определения состояния тканей пародонта применялся индекс гигиены (ГИ) Федорова-Володкиной в модификации, проба Шиллера-Писарева, папиллярно-маргинально-альвеолярный индекс (PMA) пародонтальный индекс (ПИ) Рассела, степень кровоточивости и степень подвижности. Из рентгенологических методов обследования использовались ортопантомограмма и радиовизиография.

В ходе нашего исследования было обследовано 55 пациентов с воспалительными заболеваниями пародонта. Все обследуемые были разделены на 3 возрастные группы: первая группа включала 10 больных от 13 до 25 лет, вторая группа - 22 пациента от 26 до 45 лет, третья группа - 23 человека 46 лет и старше. В ПЦР выявлено 8 положительных результатов детекции A. actinomycetemcomitans и 18 - на наличие инфекции P. gingivalis, что составляет 14,5% и 33,7% соответственно. У 8 пациентов одновременно обнаруживались оба патогенна (14,5%). В первой возрастной группе данные патогены обнаруживались редко - всего 2 положительных пробы 1 на A. actinomycetemcomitans, другая выявила A. actinomycetemcomitans и P. gingivalis одновременно. Во второй группе наиболее часто выявлялся P. gingivalis - 9 положительных групп, 3 пробы были положительны на A. actinomycetemcomitans и в 2 пробах обнаружили оба патогенна. Третья группа характеризовалась высокой распостранненостью как A. actinomycetemcomitans (4 положительных пробы), так и P. Gingivalis (9 положительных проб) в 5 образцах выявлена комбинация P. Gingivalis и A. Actinomycetemcomitans. Для пациентов с положительной пробой на Actinobacillus actinomycetemcomitans характерна клиническая картина хронического генерализованного пародонтита средней и тяжелой степени тяжести (пародонтальные карманы глубиной от 4 до 6 более мм. II и III степень кровоточивости, I и II степень подвижности зубов ГИ = 3 и более, PMA =, ПИ =). Porphyromonas gingivalis определялся у пациентов с язвенно-некротическим гингивитом и хроническим генерализованым пародонтитом в стадии обострения. Воспалительные заболевания с микстовой детекцией Actinobacillus actinomycetemcomitans и Porphyromonas gingivalis отличались наиболее агрессивным течением, деструкция костной ткани была выражена в значительной степени, ПИ =, степень подвижности зубов II и III. На основании этих данных можно сделать вывод, наличие инфекции Actinobacillus actinomycetemcomitans или Porphyromonas gingivalis способствует развитию хронических форм пародонтита. Ассоциации двух данных микроорганизмов приводят к быстрому и в значительной степени деструктивному течению хронического генерализованного пародонтита.

Полученные данные показывают увеличение распространенности A. Actinomycetemcomitans и P. gingivalis с возрастом человека, что возможно связано с изменениями защитных систем организма и пародонта в частности. Учет указанных особенностей позволяет более точно и своевременно диагностировать поражения пародонта, а главное, проводить профилактику и квалифицированное лечение его заболеваний.

Размещено на Allbest.ru