Влияние низкочастотного магнитного поля на продукцию оксида азота клетками асцитной карциномы Эрлиха

Размещено на http://www.allbest.ru/

Влияние низкочастотного магнитного поля на продукцию оксида азота клетками асцитной карциномы Эрлиха

В течение ряда лет в работах по экспериментальной онкологии и биофизике исследуется феномен противоопухолевого действия слабых магнитных полей [4]. Показана нормализация электроповерхностных и пролиферативных показателей опухолевых клеток под влиянием сверхнизкочастотных магнитных полей со спектром 1/f, активизация противоопухолевого иммунитета, что проявлялось увеличением концентрации иммунокомпетентных клеток в опухолевой ткани, массы тимуса, селезенки, лимфатических узлов, числа лимфоидных клеток в тканях этих органов у животных-опухоленосителей [3].

Необходимым звеном процесса канцерогенеза и формирования неблагоприятных особенностей течения уже развившихся опухолей является ингибирование апоптоза. Поэтому изучение влияния магнитных полей с различными биотропными параметрами на процессы пролиферации и апоптоза неоплазм и регулирующие их факторы, в частности, на продукцию оксида азота (NO), представляется достаточно актуальным. Показано, что активация транскрипционных факторов под влиянием NO увеличивает экспрессию белков теплового шока (Hsp-70), антиоксидантной защиты (супероксиддисмутаза, глутатионпероксидаза), ядерного белка p53. Оксид азота изменяет экспрессию семейства белков Bcl-2, участвует в цитотоксической активности макрофагов. Вместе с тем установлено, что NO, продуцируемый опухолью, стимулирует ее рост, усиливая синтез простагландина E2, что увеличивает приток питательных веществ к опухолевой ткани вследствие повышения проницаемости капилляров, а также подавляет цитотоксическую активность макрофагов, ингибирует пролиферацию Т-лимфоцитов внутри опухоли и в соседних тканях [8,9,10,11].

Установлено, что клетки асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) в культуре вырабатывают оксид азота [1,5]. Способность клеток АКЭ вырабатывать NO в ответ на -ИФ позволяет им подавлять функцию внутриопухолевых Т-лимфоцитов, секретирующих -ИФ, т. е. наиболее активную часть лимфоцитарного пула. При этом противоопухолевое действие NO заблокировано, так как сами опухолевые клетки резистентны к его антипролиферативному действию [1].

Одним из ключевых проявлений апоптоза является блеббинг плазматической мембраны. В основе блеббинга плазматической мембраны лежит расщепление p21-активируемой киназы-2 и гельзолина. Каспазная инактивация таких ферментов как транслоказы фосфолипидов и скрамблазы, ответственных за поддержание липидной асимметрии плазматической мембраны, приводит к инверсии фосфатидилсерина (ФС) на наружный слой билипидной мембраны [2].

Целью данной работы явилось исследование комбинированного действия постоянного и переменного низкочастотного магнитных полей процессы апоптоза и некроза, блеббинг плазматической мембраны и продукцию оксида азота клетками асцитной карциномы Эрлиха.

Материалы и методы: В опытах использовали белых беспородных мышей-самцов по 10 животных в каждой серии. Асцитную карциному Эрлиха перевивали внутрибрюшинно, на 7 сутки производили забор асцита. Индукция постоянной составляющей 25 мкТл, переменной - 5 мкТл, частота - 3,12 Гц, что соответствует циклотронной частоте колебаний молекулы цистеина.

Для исследования эндогенной и стимулированной продукции NO клетками АКЭ использовали количественный анализ нитратов и нитритов в надосадочной жидкости, получаемой при центрифугировании нативного асцита. Для восстановления нитрат-ионов до нитрит-ионов применяли омедненный кадмиевый редуктор. Содержание нитрит-ионов определяли с помощью реактива Грисса фотокалориметрически с использованием калибровочного графика.

Процессы блеббинга плазматической мембраны изучали методом фазово-контрастной микроскопии. Под иммерсией (900) анализировали по 300 клеток в каждом препарате при t=20. Отмечали проявления начального и терминального блеббинга, наличие некроза.

Анализ экспрессии фосфатидилсерина на наружной стороне цитоплазматической мембраны проводился методом регистрации связывания FITS-меченого аннексина V, проницаемость мембраны оценивали с помощью пропидия йодида (AnnexinVApoptosisDetectionKit, «БиоЛайн», Санкт-Петербург). Методом флуоресцентной микроскопии определяли относительное количество клеток трех субпопуляций: 1) жизнеспособные; 2) находящиеся на ранней стадии апоптоза; 3) некротические.

Для исследования стимулированной продукции оксида азота, блеббинга плазматической мембраны и экспрессии фосфатидилсерина invivo производили облучение в следующих режимах: 4-х кратно по 1 ч через равные промежутки времени на 6 сутки и 1-кратно на 7 сутки, непосредственно перед эвтаназией (режим 1); ежедневно в течение 1 ч со 2 по 6 сутки с момента инокуляции опухоли (режим 2). При эксперименте invitro нативный асцит облучали в течение 1ч.

Статистическую обработку результатов производили с использованием непараметрического теста Манна-Уитни и однофакторного дисперсионного анализа.

Результаты и обсуждение: Комбинированное воздействие постоянного и переменного магнитных полей invivo привело к достоверному увеличению продукции NO, более интенсивному при ежедневном облучении (0,30,05 мкМ / 106 клеток по сравнению с 0,190,05 мкМ / 106 клеток при втором режиме). Содержание нитритов в контрольном образце, взятом на 7 сутки с момента инокуляции, составило 0,080,01 мкМ / 106 клеток (p<0,02).

магнитный поле апоптоз некроз

Рис.1. Изменение продукции оксида азота клетками асцитной карциномы Эрлиха при воздействии магнитным полем invivo, мкМ / 106 клеток.

Воздействие магнитным полем invitro привело к значительному увеличению концентрации нитритов в супернатанте до 0,20,01 мкМ / 106 клеток по сравнению с контролем 0,070,02 мкМ / 106 клеток (p<0,02).

Таким образом, приведенные данные показывают принципиальную возможность регуляции продукции оксида азота клетками АКЭ с помощью резонансного действия на организм слабых магнитных полей. Не исключено, что усиление выработки NO опухолью Эрлиха является неблагоприятным фактором, подавляющим активность внутриопухолевых Т-лимфоцитов. Учитывая, что функциональный ответ клеток на действие NO многообразен и зависит от множества факторов (количества и редокс-состояния самого NO и окружающих его молекул, фенотипа клетки-мишени), для оценки влияния повышенной продукции NO на опухолевые клетки и организм в целом требуются дополнительные исследования.

При воздействии магнитным полем в режимах 1 и 2 не происходило достоверного колебания количества морфологически неизмененных и некротических клеток. Количество клеток с морфологическими признаками начального и терминального блеббинга после воздействия магнитным полем достоверно увеличивалось по сравнению с контролем, более значительно при облучении в режиме 2 (табл. 1). В результате однофакторного дисперсионного анализа показано, что режим облучения влияет на интенсивность начального и терминального блеббинга (P<0,001).

Таблица 1. Динамика морфологических изменений при действии комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на суспензию клеток АКЭ invivo (% от общего числа клеток)

Примечание: Достоверность отличий от контроля здесь и далее обозначена:* - P<0,05; ** - P<0,02; *** - P<0,001

Таким образом, воздействие низкочастотного магнитного поля вызывает блеббинг плазматической мембраны клеток асцитной карциномы Эрлиха invivo. Поскольку частота 3,12 Гц соответствует циклотронной частоте ионизированной формы молекулы цистеина, мы предполагаем, что изменение ее конформации является причиной индукции процессов, характерных для блеббинга плазматической мембраны.

Комбинированное воздействие постоянного и переменного магнитных полей invivo приводило к достоверному увеличению количества клеток на ранней стадии апоптоза, более интенсивному при ежедневном облучении в режиме 2. При этом количество некротических клеток достоверно не изменялось (табл. 2). В результате однофакторного дисперсионного анализа показано, что режим облучения влияет на количество AnnexinV (+) - клеток (P<0,001).

Таблица 2. Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на процессы апоптоза и некроза клеток АКЭ invivo (% от общего количества клеток)

Воздействие магнитным полем invitro не увеличивало процент аннексин V+ клеток, а приводило к незначительному, но достоверному снижению их числа по сравнению с контролем, находящимся при комнатной температуре в течение 1ч вне магнитного поля, и не вызвало заметных колебаний количества некротических клеток (табл. 3).

Таблица 3. Влияние комбинированных постоянного и переменного магнитных полей на процессы апоптоза и некроза клеток АКЭ invitro (% от общего количества клеток)

Результаты, полученные invitro, по-видимому, позволяют исключить прямое апоптогенное или повреждающее действие магнитного поля с заданными параметрами на клетки АКЭ. Вероятно, увеличение количества клеток на ранней стадии апоптоза в эксперименте invivo связано с системным действием магнитного поля на организм животного-опухоленосителя, что подтверждается удлинением продолжительности жизни облученных животных. Возможно, определенную роль играет активизация иммунной системы, ферментов антиоксидантной системы нейронов и гепатоцитов [6,7].

Литература

1.Бельский Ю. П. Клетки опухоли Эрлиха стимулируют продукцию интерферона-? Т-клетками и не чувствительны к аутокринному оксиду азота / Ю. П. Бельский, Н. В. Бельская, М. Г. Данилец и др //Вопр. онкол. - 2004. - Т.50, №6. - С. 689-692.

2.Введение в молекулярную медицину / Под ред. М. А. Пальцева. - М.: ОАО «Издательство «Медицина», 2004. - 496 с.: ил.

3.Музалевская Н. И. Противоопухолевое действие слабого сверхнизкочастотного стохастического магнитного поля со спектром 1/f / Н. И. Музалевская, В. М. Урицкий // Биофизика. - 1997. - Т. 42, № 4. - С. 961-970.

4.Новиков В. В. Кооперативные эффекты при действии слабых магнитных полей на опухолевый процесс invivo / В. В. Новиков, Н. И. Новикова, А. К. Качан //Биофизика. - 1996. - Т. 41, № 4. - С. 934-938.

5.Патрушев В. К. Роль оксида азота в иммуносупрессорной и противоопухолевой активностях естественных супрессорных клеток (экспериментальное исследование): Автореф. дис. … канд. мед. наук / В. К. Патрушев. - Томск, 2004. - 22 с.

6.Ставицкая Е. Ю. Здоровьеобразующие факторы: влияние магнитных полей на антиоксидантную систему / Е. Ю. Ставицкая, Н. М. Титова, Е. В. Маркова и др. // Физическая культура и спорт в системе образования. Здоровьесберегающие технологии / Материалы международного симпозиума. - 2004. - С. 259-260.

7.Франциянц Е. М. Роль антиоксидантных систем мозга в механизме антиканцерогенного влияния сверхнизкочастотных магнитных полей / Е. М. Франциянц, А. И. Шихлярова, Т. И. Кучерова // Вопр. онкол. - 2002. - Т.48, №2. - С. 216-222.

8.Bustamante J., Bersier G., Badin R. A. et al. //Nitric Oxide. -2002. -Vol.6, N 3. - P.333-341.

9.Jaiswal M., LaRusso N. F., Burgart L. J. et al. //Cancer Res. - 2000. - Vol.60. - P.184-190.

10.Kim P. K., Zamora R., Petrosko P. et al. //Immunopharmacol. - 2001. - Vol.1, N 8. - P.1421-1441.

Размещено на Allbest