Сравнительное изучение резистентности генотипически различных макрофагов к спонтанному апоптозу, некрозу и дистрофии в культурах перитонеальных клеток

Размещено на http://www.allbest.ru/

СРАВНИТЕЛЬНОЕ ИЗУЧЕНИЕ РЕЗИСТЕНТНОСТИ ГЕНОТИПИЧЕСКИ РАЗЛИЧНЫХ МАКРОФАГОВ К СПОНТАННОМУ АПОПТОЗУ, НЕКРОЗУ И ДИСТРОФИИ В КУЛЬТУРАХ ПЕРИТОНЕАЛЬНЫХ КЛЕТОК

Ильин Д.А., Архипов С.А.

Активное и повсеместное распространение заболеваний, в основе которых лежит хроническое гранулематозное воспаление [1] диктует необходимость изучения механизмов развития этого процесса с целью создания эффективных патогенетически обоснованных методов коррекции. Доказана существенная роль полинуклеарных фагоцитов в формировании очага хронического воспаления [7; 10]. Представлены убедительные свидетельства, показывающие взаимосвязь между генотипом и характером иммунного ответа организма, основанные на клиническом и экспериментальном материале [4].

Адекватная реакция иммунной системы зависит от характера межклеточной кооперации. Ведущая роль в интеграции клеток в гранулеме отводится макрофагам, однако генетические аспекты данного процесса во многих отношениях остаются не изученными. Настоящее положение является следствием недостаточного уровня современных знаний о механизмах развития и регуляции воспаления. Отсутствие необходимой информации несомненно сказывается на своевременности диагностики, достоверности прогнозирования рецидивов и осложнений, адекватности коррекции и профилактики заболеваний.

Согласно литературным данным регуляция иммунных процессов тесно связана с функцией апоптоза иммунокомпетентных клеток [9], а участие апоптоза в воспалительном процессе считается доказанным [5; 6]. Регуляция течения гранулематозного процесса тесно связана с регуляцией апоптоза клеток в очаге воспаления [8]. Апоптоз иммунокомпетентных клеток имеет важное значение в регуляции течения патологического процесса [2, 3]. Понимание механизмов нарушения своевременной и адекватной запрограммированной гибели клеток, участвующих на разных этапах формирования гранулемы, предоставляет возможность коррекции хронической патологии. Наблюдение апоптотических и некробиотических процессов in vitro на клетках, принадлежащих животным разных генетических линий, дает возможность получения информации о реализации генетически детерминированного потенциала фагоцитов, что позволило бы учитывать особенности функционирования полинуклеаров при коррекции гранулематозных заболеваний.

Изучали состояние фагоцитов в культурах перитониальных макрофагов, выделенных из брюшной полости мышей линий BALB/с, C57Bl/6, CBA и DBA. Животных забивали под эфирным наркозом, путем дислокации шейных позвонков. Последующие манипуляции проводили с соблюдением всех правил асептики и антисептики. Взвесь перитониальных макрофагов аспирировали шприцом и разливали по флаконам с покровным стеклом на дне. Клетки инкубировали в термостате при температуре 370 С. Препараты фиксировали 50 % раствором этанола в течении 2 минут и окрашивали азур - эозином. Подсчитывали количество фагоцитов, имевших признаки апоптоза, некроза, и клетки в состоянии дистрофии. Определяли концентрацию апоптозных телец на 100 клеток, отдельно подсчитывая число объектов подвергшихся и не подвергшихся фагоцитозу.

Подсчет проводили дифференцированно для одноядерных и полинуклеарных макрофагов. Результаты оценивали на 2, 24, 48 и 72 часа инкубации. Контролем служили культуры, инкубируемые в течении 2 часов. Все последующие изменения описаны относительно контроля.

При проведении экспериментов были получены следующие результаты. В группе культур BALB/c на 24 часа инкубации макрофагов отмечали увеличение численности клеток в состоянии апоптоза в 8 раз по сравнению с контрольным уровнем (на 2 часа). Подавляющее количество таких макрофагов составляли клетки с признаками фрагментации ядра. Этих фагоцитов было в 10 раз больше чем в контрольных культурах. Число клеток с фрагментированной цитоплазмой возрастало в 4 раза. Количество апоптозных клеток на 48 и 72 часа экспозиции было больше исходного в 4,3 и в 4 раза. В данный период отмечали максимальное количество апоптозных телец по сравнению с контрольным и последующими сроками инкубации. Единичные апоптозные тельца были фагоцитированы морфологически не измененными макрофагами. Некротизированные клетки отсутствовали на все сроки наблюдения. Количество макрофагов с дистрофическими изменениями достоверно не отличалось от исходного, достигая максимума к 72 часам экспозиции. На 2 часа инкубации многоядерные фагоциты не имели морфологических признаков, характерных для апоптоза. Через 24 часа экспозиции 15 % многоядерных макрофагов находились в состоянии апоптоза, о чем свидетельствовало наличие фрагментации ядра. С увеличением времени инкубации количество таких клеток прогрессивно снижалось и составляло 10 % и 5 % на 48 и 72 часа, соответственно. Фрагментацию цитоплазмы макрофагов не отмечали ни в одной культуре. Численность полинуклеаров с дистрофическими изменениями была максимальной (15 %) на 24 часа и снижалась в дальнейшем.

Для группы C57Bl/6 было характерно отсутствие макрофагов с признаками апоптоза в контрольных культурах (на 2 часа). Максимальное содержание таких клеток было зарегистрировано на 24 часа инкубации, которое превосходило аналогичные параметры в 3 и в 2,6 раза, соответственно на 48 и 72 часа наблюдения. Наиболее часто встречались клетки с фрагментированными ядрами. На 24 часа инкубации они составляли 2/3 всех апоптозных клеток. Число апоптозных телец достигало наивысшей концентрации на 48 часов экспозиции. Подавляющее количество данных объектов свободно располагалось между окружающих их клеток и лишь часть подвергалась фагоцитозу, причем наиболее часто на 24 часа инкубации. Количество некротизированных клеток достоверно не изменялось на все сроки наблюдения. Численность дистрофически измененных макрофагов имела тенденцию к прогрессивному увеличению. Возрастание этого параметра относительно контрольных значений было в 3,6, в 4,4 и в 7,4 раза, соответственно на 24, 48 и 72 часа. В контрольных культурах отсутствовали признаки апоптоза полинуклеарных фагоцитов. Они появлялись только на 24 часа инкубации и имели на этот срок максимальную концентрацию. Преобладали клетки с фрагментированными ядрами, что отмечали и при увеличении времени экспозиции. Клетки в состоянии некроза находили только через 72 часа от начала эксперимента. Количество дистрофически измененных фагоцитов на 24 и 48 часов возрастало, соответственно в 1,5 и в 3 раза относительно контрольного значения и опускалось до исходного уровня через 72 часа инкубации.

Морфологические признаки апоптоза макрофагов в группе культур СВА на 2 часа экспозиции отсутствовали. Такие клетки находили на 24 часа инкубации в максимальном для данных культур количестве. Численность этих фагоцитов снижалась на последующие сроки культивирования, и была меньше чем на 24 часа в 1,4 и в 1,8 раза - на 48 и 72 часа, соответственно. Наиболее часто встречались фагоциты с фрагментированными ядрами. Количество апоптозных телец на 48 и 72 часа инкубации достоверно не различалось между собой, и превосходило уровень этого параметра на 24 часа в 2,6 раза. Максимальное число апоптозных телец подвергалось фагоцитозу на 48 часов экспозиции и значительно снижалось на 72 часа. Число некротизированных фагоцитов на 72 часа экспозиции в 4 раза превосходило контрольный показатель и достоверно не отличалось от такового в промежуточные периоды. Количество дистрофически измененных клеток возрастало параллельно срокам инкубации. Оно увеличивалось относительно контрольных значений в 3,5, в 4,6 и в 4,7 раза на 24, 48 и 72 часа экспозиции, соответственно. Многоядерные макрофаги в состоянии апоптоза присутствовали в культурах на 2 часа инкубации и составляли 10 % от общего количества полинуклеарных фагоцитов. Их численность увеличивалась в 3 и в 1,8 раза, соответственно на 24 и 48 часов инкубации, и снижалась к 72 часам до исходного уровня. Отмечали преобладание клеток с фрагментированными ядрами. Отсутствовали некротически измененные макрофаги. Фагоциты с признаками дистрофических нарушений встречались одинаково часто на 24, 48 и 72 часа экспозиции и составляли 10 %. Наличие таких клеток в контрольных культурах отмечено не было.

В культурах группы DBA максимальное количество апаптотически измененных клеток находили на 24 часа экспозиции. Их было в 5,3 раза больше, чем в контрольный период. На 48 часов этот показатель несколько снижался и превосходил таковой на 2 часа в 3,6 раза. Отмечали преобладание количества клеток с фрагментированным ядром над числом клеток с фрагментацией цитоплазмы. Численность апоптозных телец увеличивалась по сравнению с контрольным параметром в 6,8 и в 5,3 раза, соответственно на 24 и 48 часов наблюдения. Наиболее часто они фагоцитировались макрофагами через 48 часов инкубации. Количество некротических фагоцитов достоверно не отличалось от контроля на все сроки экспозиции и составляло в среднем 1 % клеток. Макрофаги с дистрофическими изменениями находили одинаково часто (10 % клеток) на все сроки проведения эксперимента. Необходимо отметить, что на 72 часа экспозиции были обнаружены тотальные проявления апоптоза клеток в культуре. Находили макрофаги на разных стадиях апоптоза и многочисленные апоптозные тельца, размеры которых варьировали в широких пределах. Встречались единичные внешне не измененные фагоциты. Многоядерные фагоциты чаще подвергались апоптозу на 24 часа инкубации. На этот срок их было на 60 % больше, чем на 48 часов. Подавляющее количество составляли клетки с фрагментированным ядром. На 48 часов инкубации встречались единичные некротически измененные макрофаги. Клетки с морфологическими признаками дистрофии с одинаковой частотой обнаруживали на все сроки наблюдения.

Суммарные результаты по всем используемым в эксперименте группам в целом свидетельствуют о следующих, присущих макрофагам изменениях, в зависимости от длительности инкубации перитонеальных клеток. Максимальное количество клеток в состоянии апоптоза находили на 24 часа от начала эксперимента. В этот и во все другие периоды инкубации преобладали макрофаги с фрагментированными ядрами. Причем на 24 часа численность клеток с фрагментированной цитоплазмой достигала пикового (по сравнению с другими периодами) показателя и составляла 30 % от общего количества апоптозных клеток. Возрастание концентрации клеток с морфологическими признаками апоптоза по сравнению с контрольным значением (на 2 часа) было в 12, в 6,7 и в 6,6 раза, соответственно на 24, 48 и 72 часа инкубации. Численность апоптозных телец имела тенденцию к увеличению, превосходя в 25 раз исходную концентрацию, что наблюдали на 48 часов экспозиции. Количество таких образований значительно снижалось с увеличением сроков инкубации. Фагоцитозу апоптозные тельца подвергались одинаково часто (1/3 от их общего количества) на 24, 48 и 72 часа наблюдения. Число некротических клеток достоверно не изменялось по сравнению с контрольным уровнем, в целом не превышая 2 %. Отмечали плавное увеличение количества дистрофически измененных фагоцитов, которое к 72 часам инкубации превосходило контрольные параметры в 2,1 раза.

Наибольшее количество многоядерных макрофагов с признаками апоптоза присутствовало в культурах на 24 часа инкубации, что составляло восьми кратное увеличение их концентрации по сравнению с исходным уровнем. При увеличении времени экспозиции их численность имела тенденцию к снижению. На все сроки наблюдения преобладали полинуклеары с ядрами в состоянии фрагментации. Единичные фагоциты в состоянии некроза появлялись только через 48 часов инкубирования. Достоверные различия в численности дистрофически измененных клеток во все периоды инкубации отсутствовали.

При сравнении численности подверженных апоптозу клеток отсутствовали достоверные различия между многоядерными и одноядерными фагоцитами. Однако на 48 часов инкубации наиболее часто фрагментации цитоплазмы были подвержены многоядерные клетки при общем преобладании фагоцитов с фрагментированным ядром. Многоядерные макрофаги наиболее часто имели дистрофические повреждения на 2 часа инкубации, а одноядерные через 72 часа экспозиции. Одноядерные клетки с признаками некроза встречались на все сроки инкубации, достигая максимальной концентрации на 48 и 72 часа наблюдения, а многоядерные фагоциты подвергались некрозу в единичных случаях, начиная с 48 часов инкубации.

Сравнение результатов исследования, полученных для каждой группы, дает возможность выделить некоторые генетически детерминированные особенности поведения макрофагов в культурах перитонеальных клеток. На 2 часа инкубации апоптозу подвергались макрофаги только в культурах групп BALB/c и DBA. Достоверные различия между показателями численности данных клеток в этих группах отсутствовали. Апоптозные тельца чаще всего встречались в культурах группы DBA. Наибольшее количество некротизированных клеток выявляли в группе C57Bl/6. В то же время максимальная численность дистрофически измененных фагоцитов была в группе DBA. Через 24 часа экспозиции лидирующее положение по численности макрофагов в состоянии апоптоза занимали группы BALB/c и C57Bl/6. В культурах этих же групп присутствовало наиболее значительное количество апоптозных телец. Важно отметить, что на 24 часа и все сроки экспозиции в группе C57Bl/6 апоптозные тельца подвергались фагоцитозу значительно чаще, чем в других группах. Некротические клетки чаще встречались в культурах группы C57Bl/6, а фагоциты с дистрофическими изменениями - в группе DBA.

В группе BALB/c на 48 часов инкубации отмечали самую высокую концентрацию клеток, имеющих морфологические признаки апоптоза, которая в 2 раза превосходила аналогичный для остальных групп параметр. Максимальное количество апоптозных телец встречалось культурах группы C57Bl/6. В этой группе находили высокую концентрацию некротических клеток. Макрофаги с дистрофическими изменениями одинаково часто встречались во всех группах. Через 72 часа от начала культивирования группы BALB/c и C57Bl/6 лидировали по количеству апоптозных клеток. Чаще всего апоптозные тельца обнаруживали в препаратах группы C57Bl/6. Достоверные различия в концентрации некротизированных фагоцитов между исследуемыми группами отсутствовали. Группа C57Bl/6 имела максимальное количество фагоцитов с проявлениями дистрофии.

Полинуклеарные фагоциты через 2 часа от начала инкубации вступали в апоптоз только в культурах группы СВА. Эти клетки имели признаки фрагментации ядер. Максимальное количество дистрофически поврежденных клеток на этот срок находили в культурах группы DBA. Через 24 часа экспозиции наибольшая численность клеток в состоянии апоптоза определялась в группе CBA. Отсутствовали достоверные различия в численности дистрофически измененных клеток во всех представленных группах. На 48 часов инкубации во всех группах отсутствовали достоверные различия в количестве клеток, подверженных апоптозу. Единичные некротизированные клетки присутствовали в культурах группы СВА. Максимальную численность дистрофически поврежденных фагоцитов находили в культурах группы C57Bl/6. По прошествии 72 часов с начала наблюдения наивысшая концентрация апоптотически измененных и дистрофических полинуклеарных фагоцитов определяли в группе СВА. Максимальная численность многоядерных клеток в состоянии некроза была зарегистрирована в группе C57Bl/6.

На основании вышеизложенного представляется возможным сделать ряд обобщений. Прежде всего, обращает на себя внимание то, что фрагментация ядра, подвергшихся апоптозу фагоцитов наблюдалась значительно чаще, чем фрагментация их цитоплазмы. Вероятно, такое явление характерно для спонтанного апоптоза макрофагов в культуре перитонеальных клеток, либо имеет определенную взаимосвязь с отсутствием митотической активности. Наибольшее число макрофагов, вступивших в процесс апоптоза, принадлежало животным линии BALB/c. Это может указывать на генетически обусловленное отсутствие резистенции макрофагов данной линии животных к апоптозу. Максимальное количество апоптозных телец находили в препаратах от мышей группы C57Bl/6, что, возможно, свидетельствует как об активности течения процесса апоптоза, так и об относительной недостаточности фагоцитарной функции. Во всех исследованных группах культур перитонеальных макрофагов чаще всего апоптозные тельца встречались на 48 часов инкубации, что вполне объяснимо, так как большая часть клеток подвергалась апоптозу на предыдущий срок. Количество апоптозных телец, фагоцитированных макрофагами, уменьшалось к 72 часам инкубации, что было на наш взгляд связано с истощением к этому времени фагоцитарной функции клеток.

Полинуклеарные фагоциты в культурах группы СВА занимали лидирующее положение по количеству клеток в состоянии апоптоза на все сроки инкубации. Это подтверждает наличие межлинейных различий по данному показателю. В целом можно утверждать, что многоядерные макрофаги вступали в апоптоз чаще (судя по относительным показателям), чем одноядерные. Полинуклеары лишь в единичных случаях подвергались некрозу и значительно реже имели дистрофические повреждения, чем одноядерные клетки, что может объясняться большими потенциальными возможностями к субклеточной регенерации.

Существовали определенные различия в соотношении между интенсивностью протекания процессов апоптоза, некроза и дистрофии макрофагов в зависимости от сроков инкубации клеток. Средние показатели по всем группам свидетельствуют, что на 2 и на 72 часа экспозиции в высокой концентрации присутствуют дистрофически поврежденные клетки, а на промежуточные сроки инкубации (на 24 и на 48 часов) увеличивается доля апоптозных клеток. При этом количество дистрофических фагоцитов нарастало при увеличении времени культивирования клеток.

Таким образом, были выявлены межлинейные различия в отношении устойчивости одноядерных и полинуклеарных макрофагов к спонтанному апоптозу, некрозу и дистрофии в генетически различных культурах перитонеальных клеток. Многоядерные фагоциты были менее устойчивы к спонтанному апоптозу, чем одноядерные. Соотношения между интенсивностью протекания процессов апоптоза, некроза и дистрофии макрофагов изменялись в зависимости от сроков инкубации клеток. Полученные результаты могут быть использованы при моделировании хронического гранулематозного воспаления с различным уровнем активности течения апоптоза, некроза и дистрофии иммунокомпетентных клеток, что является важным этапом на пути создания эффективных методов профилактики и коррекции гранулематозных заболеваний, и их осложнений

гранулематозное воспаление полинуклеарный фагоцит

Список литературы

1. Васильев А.В., Гришко А.Н. // Внелёгочный туберкулёз. - СПб., 2000. С.11

2. Фильченков А.А., Абраменко И.В. Апоптоз в патогенезе заболеваний человека. - К.: ДИА, 2001. - 324 с.

3. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. 1996. - т. 6. - С. 10-23.

4. Alcais A., Sanchez F.O., Thuc N.V., Lap V.D., Oberti J., Lagrange P.H., Schurr E., Abel L. Granulomatous reaction to intradermal injection of lepromin (Mitsuda reaction)is linked to the human NRAMP1 gene in Vietnamese leprosy sibships // J. Infect. Dis. - 2000. - V. 181. - № 1. - P. 302 - 308.

5. Cohen J., Duke R. Apoptosis and programmed cell death in immunity. Annu. Rev. Immunol. - 1992. - № 10. - P. 267-293.

6. Haslett C., Savill J., Whyte M., Stern M., Dransfield I.,. Meagher L. Granulocyte apoptosis in the control of inflammation. // Philos. Trans. R. Soc. Lond. Ser. - 1994. - V. 345. - P. 327-333.

7. Jinnouchi K., Terasaki Y., Fujiyama S., Tomita K., Kuziel W.A., Maeda N., Takahashi K., Takeya M. Impaired hepatic granuloma formation in mice deficient in C-C chemokine receptor 2 // J. Pathol. - 2003. - V. 200. - № 3. - Р. 406 - 416.

8. Klinge U., Klosterhalfen B., Birkenhauer V., Junge K., Conze J., Schumpelick V.

Impact of polymer pore size on the interface scar formation in a rat model // J. Surg Res. - 2002. - V. 103. - № 2. - Р. 208-214.

9. Saito T., Kuss I., Dworacki G., Gooding W., Johnson J. T., Whiteside T. L. Spontanous in vivo apoptosis of peripheral blood mononuclear cells in patients with head and neck cancer. Clin. Cancer Res. - 1999. - № 5. - P. 1263-1273.

10. Tse G.M., Poon C.S., Law B.K., Pang L.M., Chu W.C., Ma T.K. Fine needle aspiration cytology of granulomatous mastitis // J. Clin. Pathol. - 2003. - V. 56. - № 7. - Р. 519 - 521.

Размещено на Allbest.ru