Полигенная модель острого панкреатита

Размещено на http://www.allbest.ru/

ПОЛИГЕННАЯ МОДЕЛЬ ОСТРОГО ПАНКРЕАТИТА

Маркова Е.В.

Зотова Н.В.

Титова Н.М.

Черданцев Д.В.

Рукосуева М.А.

ВВЕДЕНИЕ

Панкреатит, как острый, так и хронический, является актуальной проблемой современного здравоохранения. Обусловлено это ростом заболеваемости и увеличением числа деструктивных форм. Наследственный панкреатит - аутосомно-доминантное заболевание с 80%-й пенетрантностью (Whitcomb, 1999). Различные формы панкреатита рассматриваются в настоящее время как мультифакториальные болезни, развивающиеся в результате аддитивного действия множества генных локусов и внешнесредовых факторов (Witt, 2003). Сочетания генетических мутаций для каждой конкретной патологии - «генные сети». В каждой из таких сетей выделяют центральные гены и вспомогательные или гены-модификаторы (Баранов, 2003). В качестве генов «предрасположенности», согласно данным литературы, нами была выбрана своеобразная диагностическая панель из 5 генов. Исследовались гены ферментов системы биотрансформации ксенобиотиков (глутатион-S-трансферазы GSTM1 и GSTT1, где в качестве полиморфных вариантов выявлялись их протяженные делеции), ферментов поджелудочной железы (катионного трипсиногена PRSS1 и его R122H мутация, ингибитора трипсина SPINK1 с мутацией N34S) и ген трансмембранного регулятора муковисцидоза (CFTR) c 8 наиболее распространенными мутациями. При наличии мутаций в этих генах происходит блокирование реакций, сдерживающих активацию трипсина, в результате чего осуществляется избыточная активация каскада панкреатических ферментов, в конечном итоге приводящая к деструкции поджелудочной железы и развитию панкреатита (Truninger et al., 2001). При “нулевых генотипах” GSTM1 (GSTM1 0/0) и GSTT1 (GSTT1 0/0) снижается эффективность глутатион-зависимой системы биотрансформации в защите метаболической системы от воздействия патогенных факторов панкреатической паренхимы и, соответственно, повышается вероятность развития панкреатита (Standop et al., 2002; Morinville and Perrault, 2003).

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

В обследуемую группу вошли 69 здоровых донора и 49 пациентов ГКБ №7 с диагнозом острый панкреатит преимущественно алкогольной этиологии. ДНК выделяли из периферической крови с использованием протеиназы К и фенол-хлороформной экстракции. Молекулярно-генетический анализ проводили методом полимеразной цепной реакции (ПЦР). Для генов PRSS1 и SPINK1 использовали ПЦР-ПДРФ анализ (полиморфизм длин рестрикционных фрагментов) с рестриктазами BstFN1(«СибЭнзим») и TspR1 («New England BioLab») соответственно.

Анализ мутаций CFTR гена проводили с использованием диагностического набора фирмы «ДНК-лаборатория» на 8 наиболее распространенных мутаций: del21kb, delF508, delI507, 1677delTA, 2143delT, 2184insA, 394delTT, 3821delT.

Визуализацию осуществляли электрофоретически в 2% агарозном геле (для генов глутатион-S-трансфераз, PRSS1 и SPINK1) и в 7% полиакриламидном геле (для гена CFTR) с окраской в бромистом этидии.

Статистическую обработку данных проводили с помощью закона Харди-Вайнберга для аутосомных признаков, критерия ч2 и риска отношения шансов OR (odds ratio).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

При амплификации GSTM1 и GSTT1 в случае нормальных вариантов генов наблюдали соответствующие фрагменты: 219 bp - для GSTM1 (с внутренним контролем 187 bp) (рис.1) и 459 bp - для GSTT1 (с внутренним контролем 190 bp) (рис.2). При протяженных делециях (0/0-генотип) амплифицированные фрагменты не выявлялись.

Рис. 1. Электрофореграмма ПЦР-продуктов генов GSTM1 и CYP1A1: 1, 3, 4 - нормальные аллели GSTM1; 5 - генотип GSTM1 0/0.

Размещено на http://www.allbest.ru/

Рис. 2. Электрофореграма ПЦР продуктов генов GSTT1 и CYP1A1: 1, 3, 4 - нормальные аллели GSTT1; 5 - генотип GSTT1 0/0; 2 - отрицательный контроль

Рис.3. Электрофореграмма результатов рестрикции PRSS1 гена: 5 - R/H генотип, 1-4, 6 - R/R

ген панкреатит болезнь фермент

Обнаружено, что частота гомозиготных делеционных вариантов гена GSTM1 значительно выше в группе больных панкреатитом (50%), по сравнению с контролем (20,3%). Выявлено статистически значимое (2=12,55; р<0,001) различие частот GSTM1 0/0 в обследуемых группах. Величина OR для GSTM1 гена составила 3,93. Такие результаты свидетельствуют об ассоциации полиморфизма гена глутатион-S-трансферазы М1 с развитием острого панкреатита. Ассоциации риска развития панкреатита с делеционным аллелем GSTT1 не выявлено.

В результате исследования полиморфного варианта гена катионного трипсиногена, среди 34 обследованных больных острым панкреатитом мутантный аллель гена зафиксирован у одного человека (2,5%). Обнаруженный вариант оказался гетерозиготой - R/H (один из аллелей содержал замену R122H). В этом случае вследствие исчезновения сайта рестрикции при электрофорезе присутствует исходный фрагмент (911 bp), наряду с рестрицированными (566 bp и 345 bp) (рис.3). Во всех остальных случаях наблюдалось полное разрезание амплифицированных фрагментов, что свидетельствовало о «диком» генотипе (R/R).

Частота аллеля «R» составила 98,7%, мутантного аллеля «H» - 1,3%. Можно заключить, что мутация PRSS1 гена в популяции жителей г. Красноярска не является предрасполагающим фактором развития панкреатита, по крайней мере, для пациентов с острой алкогольной формой данного заболевания.

В результате исследования полиморфного варианта гена ингибитора трипсина, среди 23 обследованных больных острым панкреатитом мутантный аллель гена не зафиксирован. В случае наличия мутации N34S должно наблюдаться разрезание исходного фрагмента (307bp) на два (117 и 190bp) (рис.4).

Можно заключить, что мутация N34S SPINK1 гена в популяции жителей г. Красноярска также не является предрасполагающим фактором развития панкреатита, по крайней мере, для пациентов с острой алкогольной формой данного заболевания.

Рис.4. Электрофореграмма результатов рестрикции: 1-3 - SPINK1 гена, 4 - ДНК фага л.

При амплификации CFTR гена, в случае его нормального варианта, наблюдали при электрофорезе 4 фрагмента: 99, 88, 80 и 72 bp. При наличии мутаций выявляются дополнительные фрагменты: 212 bp при del 2 1kb (в к+), 96 bp при ДF508 и характерные гетеродуплексы (Рис. 5).

Рис. 5. Электрофорез результатов амплификации CFTR гена: 1, 4-8 - отсутствие мутаций, 2 - ДF508/-, 3 - положительный контроль: ДF508/-; del 21kb

Только у одного пациента из 45 выявлена «мажорная» мутация ?F508 CFTR в гетерозиготе (2,2%). Частота аллеля «?F508» составила 1,1%, аллеля «дикого» типа - 98,9%. Для сравнения произведена амплификация PRSS1, SPINK1 и CFTR генов у нескольких индивидуумов контрольной группы, где ни одного случая мутаций не выявлено.

Таким образом, по нашим данным, в патогенезе заболевания можно выделить роль «главного гена» GSTM1 и «генетический фон» - GSTT1, PRSS1, SPINK1 и CFTR. Учитывая физиологическое значение глутатион-S-трансферазы в биотрансформации ксенобиотиков можно заключить, что роль генетических систем, осуществляющих регуляцию взаимодействия с внешней средой, так называемых генов «внешней среды», и самих средовых факторов достаточно значима в этиологии острого панкреатита (рис.6).

Рис. 6. Полигенная модель острого панкреатита в популяции жителей г. Красноярска

В то же время, большинство современных полигенных моделей панкреатита большую роль отводят генам систем, непосредственно вовлеченных в функционирование клеток поджелудочной железы, таким как PRSS1, SPINK1 и CFTR.

ЛИТЕРАТУРА

1. Whitcomb D.C. Hereditary pancreatitis: new insights into acute and chronic pancreatitis/ Gut.-1999.-Vol.45, №9.-P.317-322.

2. Witt H. Chronic pancreatitis and cystic fibrosis/ Gut.- 2003.-№52.-P.31-41

3. Баранов В.С., Баранова Е.В., Иващенко Т.Э. Научные основы предиктивной медицины / Молекулярно-биологические технологии в медицинской практике /Под ред.А.Б. Масленникова.-Вып.4.-Новосибирск.: Альфа-Виста, 2003.-52с.

4. Truninger K., Ammannb R.W., Bluma H.E., Witt H. Genetic aspects of chronic pancreatitis: insights into aetiopathogenesis and clinical implications/ Swiss. Med. Wkly.-2001.-№131.-P.565-574.

5. Standop J., Schneider M.B., Ulrich A., et al. The pattern of xenobiotic-metabolizing enzymes in the human pancreas/J Toxicol Environ Health.- 2002.- Vol.65, №19.-P.1379-400.

6. Morinville V. and Perrault J. Genetic disorders of the pancreas/Gastroenterology Clinics of North America.-2003.- Vol.32, №3.-P. 763-787.

Размещено на Allbest.ru