Особенности метаболизма лимфоцитов у больных раком легкого в зависимости от полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1

Размещено на http://www.allbest.ru/

ОСОБЕННОСТИ МЕТАБОЛИЗМА ЛИМФОЦИТОВ У БОЛЬНЫХ РАКОМ ЛЕГКОГО В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ПОЛИМОРФИЗМА ГЕНОВ GSTM1 и GSTT1

Маркова Е.В.

Ушакова Н.В.

Савченко А.А.

Лапешин П.В.

Московских М.Н.

Слепов Е.В.

ВВЕДЕНИЕ

Проблема исследования роли различных факторов в формировании рака легкого в современных условиях жизни человека актуальна в России и во многих индустриально развитых странах мира, особенно с учетом интенсивного воздействия вредных потенциальных канцерогенов, недостаточности ферментативных систем организма при наличии генетических полиморфизмов ферментов биотрансформации (в частности, генов GSTM1 и GSTT1) [Аничков, Кветной, Коновалов, 2004]. Все это оказывает огромное влияние на этиологию и патогнез рака легкого. Это сопровождается нарушениями в обменных процессах и изменениями активности окислительно-восстановительных ферментов в иммунокомпетентных клетках организма, в частности, НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ. Из-за этого снижается сопротивляемость к различным инфекциям [Баранов, 2000].

Большой интерес представляет фенотипическое проявление делеционных полиморфизмов генов GSTM1 и GSTT1 на уровне клеточного метаболизма лимфоцитов периферической крови у больных раком легкого. Связано это с тем, что система катаболизма ксенобиотиков с одной стороны использует субстратные и энергетические ресурсы клетки, а с другой стороны, осуществляя биотрансформацию ксенобиотиков, защищает метаболическую систему от воздействия патогенных факторов [Савченко и др., 2004; Баранов, 2000]. Полученные результаты могут служить основой для создания современных моделей развития рака легкого и, соответственно, разработки новых методов лечения на уровне клеточного метаболизма.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Проведен биолюминесцентный анализ активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови у 62 больных раком легкого с различными гистологическими типами (100% мужчины, 21-75 лет; средний возраст - 62 года) [Савченко, Сунцова, 1989]. Из них 42 человека имели плоскоклеточную форму рака легкого, 25 - аденокарциному, 12 - мелкоклеточный рак легкого, 2 - бронхоальвеолярный и 1 - крупноклеточный. Диагноз и гистологическая форма рака легкого устанавливались на основании гистологического исследования в Красноярском краевом онкологическом центре.

Выделение лимфоцитов осуществляли по стандартной методике в градиенте плотности фиколл-верографина.

Определялась активность следующих НАД(Ф)-зависимых ферментов: глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (Г6ФДГ), глицерол-3-фосфатдегидрогеназы (Г3ФДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции лактатдегидрогеназы (ЛДГ и Обр. ЛДГ), НАДФ-зависимой малатдегидрогеназы (НАДФМДГ), НАД- и НАДН-зависимой реакции малатдегидрогеназы (МДГ и Обр. МДГ), НАД- и НАДН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДГДГ и Обр. НАДГДГ), НАДФ- и НАДФН-зависимой глутаматдегидрогеназы (НАДФГДГ и Обр. НАДФГДГ), НАД- и НАДФ-зависимых изоцитратдегидрогеназ (НАДИЦДГ и НАДФИЦДГ) и глутатионредуктазы (ГР). Активность дегидрогеназ выражали в ферментативных единицах (1 Е=1 мкмоль/мин [Березов, Коровкин, 1998]) на мг белка ткани.

Для всех данных, полученных в ходе биолюминесцентного определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах, определяли среднее арифметическое значение (М) и ошибку средней арифметической (m). Оценка статистической достоверности различий уровня активности дегидрогеназ в лимфоцитах при различных полиморфных генотипах генов GSTM1 и GSTT1 проводилась с помощью расчета непараметрического критерия Мани-Уитни (пакет “Statistica 6.0”) в группах “GSTM1 (+/+, +/0) - GSTM1 0/0”, “GSTT1 +/+, +/0 - GSTT1 0/0”. Полученные результаты по данным группам у больных с различными гистологическими типами рака легкого сравнивали между собой для определения возможных различий.

Исследование делеционного полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 проводили с помощь мультиплексной ПЦР (полимеразная цепная реакция). Результаты ПЦР анализировали электрофоретически в 2%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия и визуализацией в проходящем УФ-свете. Нормальные аллели генов характеризовались присутствием ПЦР-продуктов: 219 п.н. для GSTM1 (гомозиготы GSTM1 +/+ и гетерозиготы GSTM1 +/0) c внутренним контролем PRSS1 (911 н.п.) (ген катионного трипсиногена) и 456 п.н. для GSTT1 (гомозиготы GSTT1 +/+ и гетерозиготы GSTT1 +/0) c внутренним контролем CYP1A1 (199 пн) (ген цитохрома Р450 класса 1А1). Делеционные (“нулевые”) гомозиготные варианты (GSTM1 0/0 и GSTT1 0/0) выявлялись по отсутствию фрагментов GSTM1 и GSTT1 (рис. 1, рис. 2).

РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

На рис. 1 и 2 представлены результаты мультиплексной ПЦР генов GSTM1 и GSTT1 при совместной ко-амплификации с генами PRSS1 и CYP1A1 соответственно.

рак легкое лемфоцит ген

При проведении сравнительного исследования уровней активности НАД- и НАДФ-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови у больных раком легкого обнаружено, что при генотипе GSTM1 0/0 наблюдается статистически достоверное снижение активности НАДИДГ - в 2,4 раза (28,0348,825 мкЕ/мг, р<0,0454) и Обр. НАДМДГ - в 7,8 раз (19,5887,61 мкЕ/мг, р<0,000001) (таблица 1) по сравнению с активностью данных ферментов у больных с генотипом GSTM1 +/+ или GSTM1 +/0. Максимальное снижение активности Обр. НАДМДГ - в 32,94 раза (5,6271,919 мкЕ/мг, р<0,0011) - наблюдается у больных с аденокарциномой, а у больных с плоскоклеточной формой рака легкого выявлено снижение активности данного фермента в 3,9 раз при генотипе GSTM1 0/0 по сравнению с “диким” генотипом гена GSTM1 (34,67813,443 мкЕ/мг, р<0,01644). Кроме того, у больных с плоскоклеточной формой рака легкого при делеционном генотипе GSTM1 0/0 выявлено также статистически достоверное незначительное повышение активности НАДГДГ (10,73,285 мкЕ/мг, р<0,044) и НАДФГДГ (25,7099,438 мкЕ/мг, р<0,0112) - в 1,13 и 1,5 раза соответственно. Больные с аденокарциномойпри при генотипе GSTM1 0/0 показывают повышение активности Г3ФДГ в 2,4 раза (1,0710,338 мкЕ/мг, р<0,0424) и снижение в 3,2 раза активности НАДФИДГ (1,1950,284 мкЕ/мг, р<0,05) (таблица 1).

Таблица 1. Результаты определения активности НАД(Ф)-зависимых дегидрогеназ в лимфоцитах периферической крови у больных с различными гистологическими типами рака легкого в зависимости от полиморфизма генов GSTM1 и GSTТ1

При генотипе GSTT1 0/0 выявлено статистически достоверное снижение активности НАДФИДГ - в 9,8 раз (10,7813,456 мкЕ/мг, р<0,016) и повышение активности для Г6ФДГ - в 3,4 раза по сравнению с группой больных раком легкого с “диким” генотипом гена GSTT1 (12,412,141 мкЕ/мг, р<0,006). Максимальное повышение активности данного фермента - в 8,3 раза - показано для больных с мелкоклеточной формой рака легкого (10,2581,815 мкЕ/мг, р<0,01674), а больные с плоскоклеточным раком легкого показывают повышение в 2,4 раза (812,342,725 мкЕ/мг, р<0,0057) (таблица 1). Уровни активности других исследуемых ферментов в зависимости от полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 статистически достоверно не различались.

Таким образом, в лимфоцитах больных раком легкого при генотипе GSTM1 0/0 выявляется снижение активности ферментов ряда пластических процессов (Обр. НАДМДГ, НАДИДГ). Следовательно можно предположить, что лимфоциты больных раком легкого с генотипом GSTM1 0/0 более аэробны по с равнению с лимфоцитами больных при “диком” генотипе GSTM1. Происходит активация ключевой реакции цикла Кребса (Обр. НАДМДГ) при одновременном лимитировании на стадии вспомогательных дегидрогеназных реакций лимонного цикла (НАДИДГ). Однако компенсаторное повышение активности Обр. НАДФГДГ (больные с плоскоклеточной формой рака легкого) позволяет стимулировать субстратный поток по циклу трикарбоновых кислот и, соответственно, усилить роль аэробной энергетики. В лимфоцитах больных раком легкого при генотипе GSTT1 0/0 также показано снижение анаэробной энергетики. Это связано с ингибированием НАДФИДГ. Однако повышение активности Г6ФДГ свидетельствует о компенсаторном пути биосинтеза кофакторов для липидного обмена.

Выявленные особенности метаболизма лимфоцитов больных раком легкого в зависимости от полиморфизма генов GSTM1 и GSTT1 необходимо учитывать при разработке современных методов медикаментозной терапии, которые могли бы быть специфичны для различных гистологических типов рака легкого.

ЛИТЕРАТУРА

1. Аничков Н.М., Кветной И.М., Коновалов С.С. Биология опухолевого роста (молекулярно-медицинские аспекты). - СПб.: Изд-во “Прайм-еврознак”, 2004. - 224с.

2. Баранов B.C., Баранова ЕВ., Иващенко Т.Э., Асеев М.В. Геном человека и гены "предрасположенности" (введение в предиктивную медицину). - СПб.: Интермедика, 2000. - 271с.

3. Березов Т.Т., Коровкин Б.Ф. Биологическая химия. - М.: Медицина, 1998. - 704с.

4. Савченко А.А., Лапешин П.В., Маркова Е.В. и др. Российский биотерапевтический журнал. - 2004. - Т3, №3. - С.24-27.

5. Савченко А.А., Сунцова Л.Н. // Лаб. дело. - 1989. - № 11. - С.23-25.

Размещено на Allbest.ru