Разработка плана направленного химико-токсикологического исследования диазепама в крови

Размещено на http://www.allbest.ru/

Государственное бюджетное образовательное учреждение высшего профессионального образования

Самарский государственный медицинский университет

Министерства здравоохранения и социального развития РФ

Кафедра химии фармацевтического факультета

КОНТРОЛЬНАЯ РАБОТА

на тему: «Разработка плана направленного химико-токсикологического исследования диазепама в крови»

Выполнила: студентка 5 курса

фармацевтического факультета 573 группы

Жданова Мария Александровна

Проверил: к. фарм. н. Воронин А.В.

Самара, 2012

Содержание

1. Распространенность и характер интоксикаций

2. Структурная формула, классификация, общая характеристика группы

3. Физико-химические свойства диазепама

4. Токсикокинетика

5. Объекты химико-токсикологического анализа в судебно-химической экспертизе, клинической токсикологии и наркологии

6. Методы пробоподготовки

7. Методы анализа диазепама

Библиографический список

1. Распространенность и характер интоксикаций

Диазепам (Валиум, Релиум) - широко используемое лекарство группы бензодиазепинов. Отравление диазепамом и препаратами группы бензодиазепинов широко распространено в связи с распространенностью и относительной доступностью этих лекарств.

По данным оригинального исследования, основывающегося на анализе суицидальных попыток, совершенных путем отравления, поступивших на лечение в токсикологический центр ГКБ № 2 Владивостока пациентов, за пятилетний период (2003--2007) в токсикологический центр было госпитализировано 1672 пациента с суицидальными отравлениями, среди которых число отравлений психотропными препаратами составило 718 (42,9%) [1]. Чаще всего с целью отравления использовались транквилизаторы. Группа транквилизаторов в большинстве наблюдений была представлена феназепамом (55%), остальная часть равномерно распределилась между нозепамом, реланиумом, нитразепамом и др. Данные препараты чаще использовали для отравления больные с пограничными состояниями и психическими заболеваниями, состоящие на учете у психиатра или невролога. Среди суицидентов преобладали женщины в возрасте 40--55 лет, можно отметить редкие случаи отравления среди подростков. В динамике за последние 5 лет и особенно в 2007 г. отмечено снижение количества отравлений транквилизаторами бензодиазепинового ряда практически в 2 раза( Табл.1), что, возможно, связано с ужесточением госнадзора за их распространением, а также со все более широким использованием в медицинской практике анксиолитических препаратов других химических групп без риска лекарственной зависимости. Несмотря на большую частоту отравлений, смертельные исходы при приеме этих препаратов крайне редки и за исследуемый период не отмечались.

Таблица.

препарат интоксикация диазепам бензодиазепин

2. Структурная формула, классификация, общая характеристика группы

(Diazepam) - лекарственный препарат длительного действия из группы бензодиазепинов, обладающий снотворным действием.

Классификация диазепама:

1) По химическому строению: является производным 5-арил-1,4-бензодиазепина (хлорпроизводное).

2) По источникам происхождения: синтетического происхождения

3) По нормативно-прававому статусу: сильнодействующие

Общая характеристика группы:

Производные бензодиазепина относятся к психотропным веществам.

По физико-химическим свойствам диазепам относится к слабому основанию, поскольку атомы азота не имеют свободных атомов водорода не проявляет амфотерных свойств в отличие от некоторых других бензодиазепинов (лоразепам, феназепам).В растворах кислот и щелочей легко гидролизуются с образованием аминобензофенонов (в кислых растворах) и производных глицина (в щелочных растворах).

Абсорбция производных 1,4 - бензодиазепинов в УФ- области изменяется в зависимости от рН их растворов:

- в кислой среде - за счет протонирования атома азота в положении 1 или 4

- в щелочной среде возможно изменение хромофорной системы.

Растворы 1,4 - бензодиазепинов более стабильны в спирте, чем в воде. В кислых водных растворах, особенно при нагревании, 1,4 - бензодиазепины гидролизуются с образованием производных аминобензофенона, имеющую желтую окраску. Особенно быстро гидролизуются диазепам и оксазепам.

3. Физико-химические свойства диазепама

Диазепам - представляет собой белый или белый с желтоватым оттенком кристаллический порошок. Почти не растворяется в воде (0,05 мг/мл), трудно растворяется в этиловом спирте (41,0 мг/мл), хорошо растворяется в хлороформе (500,0 мг/мл) в связи со слабо выраженной полярностью. Экстрагируется органическими растворителями как из кислой, так и из щелочной среды. По кислотно-основной классификации относится к слабым основаниям (рКb=3,4), поскольку атомы азота не имеют свободных атомов водорода. Введение карбонильных, гидрокси- и карбоксильных групп в молекулу снижает основный характер соединения. Не проявляет амфотерных свойств в отличие от некоторых других бензодиазепинов (лоразепам, феназепам). В растворах кислот и щелочей легко гидролизуются с образованием аминобензофенонов (в кислых растворах) и производных глицина (в щелочных растворах). Растворы 1,4- бензодиазепинов более стабильны в спирте, чем в воде.

4. Токсикокинетика

Пути поступления диазепама в организм - внутримышечное введение, внутривенное введение, перорально, сублингвально ректально. Диазепам приблизительно в 94--99% связывается с белками крови. Период полувыведения десметилдиазепама составляет 30-100 ч, темазепама - 9.5-12.4 ч и оксазепама - 5-15 ч. Диазепам хорошо и быстро всасывается из пищеварительного тракта, биодоступность составляет 98%. После перорального применения одной дозы препарата 20 мг, максимальная концентрация лекарства в сыворотке крови (Сmax) достигается через 50--90 минут и составляет приблизительно 500 нг/мл.

Диазепам метаболизируется в печени, с образованием очень активного метаболита десметилдиазепама и менее активных - темазепама и оксазепама. Метаболизм происходит в нескольких направлениях: N-деметилирование и гидроксилирование. Продукт N-деметилирования затем превращается в оксазепам, который выделяется с мочой в виде глюкуронида. Также в виде глюкуронида выделяется с мочой продукт гидроксилирования диазепама.

Терапевтические дозы варьируют от 0,125 до 0,75 мг/л. Токсические дозы составляют от 1,5 до 5 мг/л крови.

5. Объекты химико-токсикологического анализа в судебно-химической экспертизе, клинической токсикологии и наркологии

Объектами являются печень, почки, кровь, моча, желудок, тонкий кишечник, если препарат был принят перорально. Пробы мочи и крови следует консервировать натрия фторидом или борной кислотой, добавлять буферные растворы в связи с чувствительностью к изменению рН и микробной контаминации, хранить в холодном месте. Для хранения проб желательны полипропиленовые емкости, стеклянные емкости необходимо силилировать.

Правила пробоотбора:

Рекомендации по подготовке биологических объектов

Для отобранных биологических объектов готовятся две этикетки, одна из которых предназначена для контрольного образца, другая для анализируемого. На этикетках указывается штрих-код либо шестизначный код освидетельствуемого (для кодирования используется произвольный ряд чисел от 0 до 9, например: 003841, 658097 и т.д.), дата и код подразделения медицинской организации, в которой производится отбор биологических объектов. На этикетке контрольного образца после шестизначного кода либо штрих-кода освидетельствуемого ставится буква "К" (например: 003841-К).

Каждая этикетка крепится к флакону (пробирке, контейнеру и пр.) клейкой лентой таким образом, чтобы исключить возможность подмены содержимого флакона без нарушения целостности этикетки. Место соединения концов ленты пломбируется и опечатывается с использованием штампа структурного подразделения медицинской организации, в которой проводился отбор биологических объектов.

Подготовленные биологические объекты упаковываются в контейнер и с сопроводительной документацией помещаются в сумку-холодильник.

Рекомендации по транспортировке биологических объектов:

Транспортировку биологических объектов и документации осуществляет лицо, на имя которого составлена Справка о доставке биологических объектов на химико-токсикологические исследования (учетная форма N 451/у-06).

Контрольные образцы биологических объектов при поступлении в ХТЛ сразу же помещаются на хранение в запираемые или опечатываемые холодильные шкафы и хранятся при температуре не менее минус 18 град. C. Срок хранения контрольного образца - 2 месяца со дня поступления в ХТЛ. Если в течение этого срока отсутствовала необходимость в повторных химико-токсикологических исследованиях, то по истечении 2-х месяцев контрольный образец биологического объекта уничтожается.

Рекомендации по отбору крови:

Отбор крови у освидетельствуемого проводится на рабочем месте, которое оборудуется в соответствии с требованиями, предъявляемыми к оборудованию процедурного кабинета. Отбор крови проводится в резиновых перчатках, с соблюдением правил асептики.

Перед проколом кожа освидетельствуемого обрабатывается стерильным тампоном, смоченным не содержащим спирт дезинфицирующим раствором. После взятия крови к раневой поверхности прикладывается новый стерильный тампон, смоченный таким же дезинфицирующим раствором.

Кровь для проведения химико-токсикологических исследований отбирается из поверхностной вены одним из следующих способов:

Самотеком в сухой флакон с раствором гепарина (3-5 капель на каждые 10 мл крови). Отбирается 15 мл крови в два флакона объемами 10 и 5 мл. Флаконы закрываются стандартной резиновой пробкой, которая фиксируется алюминиевым колпачком. Содержимое флаконов сразу же перемешивается. Флакон с 5 мл крови хранится как контрольный образец. Второй флакон с 10 мл крови (анализируемый образец) используется для проведения химико-токсикологических исследований.

С использованием вакуумных пробирок (одноразовых устройств для ускоренного взятия крови с содержанием гепарина и иглами с двух концов) один конец вводится в вену, другим концом прокалывается резиновая мембрана пробирки. Отбирается 15 мл крови в две вакуумные пробирки по 5 мл и 10 мл (контрольный и анализируемый образцы), пробирки опечатываются.

6. Методы пробоподготовки

Выделяют два основных направления анализа по продуктам гидролиза и по нативному диазепаму и его метаболитам. Первое направление предусматривает кислотный гидролиз (соляная кислота при Т = 140-145°С) диазепама и его метаболитов после предварительной экстракции методами жидкость-жидкостной экстракции (ЖЖЭ) (метанол и боратный буфер рН=9) или твердофазной экстракции (ТФЭ) после подщелачивания до рН = 9 на патронах диапак карбокси, Clean Screen.

Второе направление включает изолирование нативных соединений и ряда гидрофобных метаболитов экстракцией подкисленной водой с последующим концентрированием с помощью ЖЖЭ или ТФЭ (системы те же). Для биологических жидкостей используется экстракция органическими растворителями при значении рН = 6-8 (изоэлектрическая точка). Преимущество отдается исследованию по продуктам гидролиза в связи с их большим количеством в анализируемой крови.

К 5 мл крови прибавляют равный объем фосфатного буферного раствора (рН = 7,0). Полученную жидкость 2 раза по 5 мин взбалтывают с новыми порциями диэтилового эфира. Объем диэтилового эфира, применяемого для взбалтывания, должен быть равным объему водной фазы. Соединенные эфирные вытяжки дважды взбалтывают с 0,1 н. раствором гидроксида натрия (по 2 мл), а затем с 2 мл воды. После отделения водной фазы эфирную вытяжку взбалтывают с 3 мл 2 н. раствора соляной кислоты в течение 10 мин, а затем от эфирного слоя отделяют солянокислую вытяжку. Оптическую плотность этой вытяжки измеряют в диапазоне длин волн от 200 до 300 нм.

Параллельно измеряют оптическую плотность диазепама, обработанного указанным выше способом. Наличие максимумов поглощения при 242 нм указывает на наличие диазепама в крови.

7. Методы анализа диазепама

1. Методы предварительного анализа

- Иммунохимические методы

- Тонкослойная хроматография

ТСХ анализ с использованием силикагеля G на высущенных стеклянных пластинах, элюентом является система А: хлороформ-ацетон 40:20,В: хлорофом-метанол 90:10, С: циклогексан-толуол-диэтиламин 75:15:10. Детектируют при длине волны 245 нм затем обрабатывают 2н серной кислотой и нагревают до 80 градусов, детектируют при длине волны 366 нм, проявляют подкисленным йодплатинатом калия. Фактор удерживание в разных системах элюэнтов R_fa = 70, R_fb = 87, R_fc = 30.

- Реакция Браттона -- Маршалла

Обнаружение диазепама методом хроматографии в тонком слое сорбента. Для обнаружения диазепама и других производных бензодиазепина с помощью этого метода применяют пластинки, покрытые тонким закрепленным слоем силикагеля КСК или пластинки «силуфол». В качестве системы растворителей применяют смесь этилацетата, 25 %-го раствора аммиака и метилового спирта (26 : 1,6 : 3,3) или смесь хлороформа и ацетона (9: 1). Пятна на пластинках проявляют с помощью реактива Драгендорфа.

Обнаружение диазепама по УФ- и ИК-спектрам. Диазепам в 2 н. растворе соляной кислоты имеет максимумы поглощения при 242 и 287 нм, в 0,1 н. растворе серной кислоты имеет максимумы поглощения при 241, 284 и 359 нм; в ИК-области спектра диазепам (диск с бромидом калия) имеет основные пики при 1681, 1484 и 1313 см.

2. Методы подтверждающего анализа

- Проведение газохроматографического анализа (ГЖХ).

Хроматографическое разделение осуществляют с применением термоионного (ТИД) и электронно-захватного детекторов (ЭЗД) на кварцевых капиллярных колонках с полярными или слабополярными неподвижными фазами: 5% фенилдиметилсиликон (фаза НР-5 или НР-5MS). Наиболее чувствительным является ЭЗД. Температурные режимы термостата колонок программируются с начальной температурой 150°С (1 мин) до конечной 250°С (5 мин) со скоростью 20°С/мин. Температура инжектора соответственно поддерживается на уровне 250°С. В качестве газа-носителя используют гелий. При проведении ГЖХ-анализа с ЭЗД в качестве внутреннего стандарта используется диметилброманалин, с ТИД - дифениламин.

- Газовая хроматография с масс-селективным детектированием (ГХ/МС).

Неподвижные фазы и температурные программы аналогичны ГЖХ. При определении диазепама регистрируют две группы ионов: 1 группа - 242, 207, 270 m/z - для внутреннего стандарта; 2 группа - 256, 221,284 m/z - для анализируемого вещества. В качестве внутреннего стандарта используют мезапам. Предел обнаружения диазепама составляет 0,5 нг/мл.

- Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ).

Для обнаружения диазепама с помошью ВЭЖХ рекомендуются следующие условия: обращено-фазные сорбенты С18 («Сепарон», «Zorbax»), С8 , подвижная фаза - смесь 0.05 М раствора аммония гидрофосфата и ацетонитрила (65:35) для разделения нативных 1,4 - бензодиазепинов и система тех же растворителей в соотношении 45:55 для аминобензофенонов; режим элюирования - градиентный. Детектирование нативных 1,4- бензодиазепинов проводится при длине волны 230 нм, аминобензофенонов и мезапама - при 220 нм. Предел обнаружения диазепина 15,0 * 10-6 , мг.

Библиографический список

1. Кравченко, И.В. Суицидальные отравления психоактивными препаратами/ И.В. Кравченко// Тихоокеанский медицинский журнал. - 2008. - №4. - С. 51-53.

2. Приказ Министерства Здравоохранения России № 40 от 27.01.2006 г. «Об организации проведения химико-токсикологических исследований при аналитической диагностики наличия в организме человека алкоголя, наркотических средств, психотропных и других токсических веществ».: офиц. текст. - 4 с.

3. Еремин С.К. Анализ наркотических средств / С.К. Еремин, Б.Н. Изотов, Н.В. Веселовская; Под ред. Б.Н. Изотова. - М.: Мысль, 1993. - 271с.

Размещено на Allbest.ru