Изучение цитотоксического эффекта препарата Фотолон в культивируемых клетках человека

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Введение

окислительный препарат мелатонин фотодинамический

Фотодинамическая терапия (ФДТ) представляет собой относительно новый, но уже хорошо зарекомендовавший себя способ лечения некоторых видов рака. ФДТ активно развивается во многих странах мира с конца семидесятых годов прошлого века [1].

ФДТ основана на взаимодействии трех нетоксичных компонентов - фотосенсибилизатора (ФС), способного селективно накапливаться в опухолевых тканях, света и кислорода. В основе метода лежит способность ФС при облучении светом определенной длины волны вызывать деструкцию опухолевой ткани. На сегодняшний день в мире имеются сотни исследовательских центров, занимающихся изучением ФДТ злокачественных опухолей, а также некоторых неопухолевых заболеваний человека [13].

Положительные результаты получены при ФДТ рака кожи, опухолей головы и шеи, рака молочной железы и гениталий. Использование современной лазерной и световой техники позволяет применять ФДТ у больных раком легкого, пищевода, желудка, мочевого пузыря и других злокачественных опухолей внутренней локализации [3].

Большое значение для понимания механизмов ФДТ имеют закономерности поступления ФС в клетки, его распределение по различным клеточным органеллам, а также форма вызываемой им клеточной гибели. Однако несмотря на то, что фотофизические и химические свойства ФС изучены достаточно полно [], цитологические аспекты ФДТ изучены значительно меньше.

Особого внимания заслуживают новые препараты для ФДТ, которые получают путем связывания молекул ФС с молекулами других веществ с целью улучшения селективности его накопления в опухолевых клетках. Одним из таких ФС является лекарственное средство Фотолон, которое выпускается предприятием «Белмедпрепараты» (Республика Беларусь) и уже применяется для лечения отдельных видов рака. Можно надеяться поэтому, что дальнейшее изучение молекулярно-клеточных механизмов цитотоксичности препарата Фотолон будет способствовать развитию ФДТ в нашей республике.

1. Обзор литературы

1.1 История метода ФДТ

Лечебные свойства света описаны еще древними греками. а Геродот считается отцом гелиотерапии. Однако первые попытки детально изучить механизм подобного лечебного воздействия, а также повысить его терапевтическую эффективность относятся только к началу XX в.

За начало современного научного и экспериментального подхода к изучению явления фотосенсибилизации принято считать работу Оскара Раба, опубликованную в 1900 г. [3]. Будучи студентом фармакологического факультета Мюнхенского университета он под руководством профессора Германа фон Таппинера обнаружил, что воздействие на парамециию солнечного света в присутствии небольших концентраций флуоресцентных красителей (акридина, эозина, флуоресцеина) приводит к их быстрой гибели. Уже в 1903 г. фон Таппинер и Ешёнек опубликовали первые данные об успешном лечении шести больных раком кожи, псориазом и герпесом при помощи совместного применения эозина и света [2]. Для обозначения этого эффекта фон Таппинером был введены термины «фотодинамическое действие» и «фотосенсибилизатор», чтобы отличить этот эффект от фотохимических процессов, наблюдаемых в фотографии.

Далее развитие и становление ФДТ шло по длинному извилистому пути, приведшему к разработке первых сенсибилизаторов на основе порфиринов, которые входят в состав гемоглобина, миоглобина, каталазы, пероксидазы и цитохромов. В 1911 г. были начаты эксперименты Хаусманом с гематoпopфиpинaми, выделенными из крови. Он первым сообщил о гибели клеток парамеций при облучения светом лампы и наличии в питательной среде гематопорфирина. Он также описал острую, подострую и хроническую фоточувствительность и фототоксичность, проявляющиеся под действием света у мышей, которым была введена смесь гематопорфиринов. Впервые действие гематопорфирина на человеческий организм испытал в эксперименте на себе самом Мейер-Бетц [4]. 14 октября 1912 г. он ввел себе внутривенно 0,2 г гематопорфирина и продемонстрировал солнечную фоточувствительность в виде отека и гиперпигментации, которые продолжались в течение 2-х месяцев. В 1924 г. французский ученый Поликар впервые описал появление интенсивной флуоресценции в красной области спектра опухолей у животных при облучении ультрафиолетовым светом после введения гематопорфирина. Это доказало наличие у данного класса веществ способности к селективному накоплению в опухолевых клетках. С целью поиска веществ, эффективно накапливающихся в опухолевых тканях, Фиге с коллегами [3] вводили мышам с перевитыми опухолями различные порфирины: гематопорфирин, копропорфирин, протопорфирин и цинкгематопорфирин. Все они накапливались в опухолях в течение 24-48 часов, после флуоресценция в них наблюдалась в течение 10-14 дней. Учитывая высокое сродство порфиринов к лимфатической ткани, авторы предположили, что они могут быть использованы для лечения лейкемии. Упомянутые выше исследования продемонстрировали также возможность флуоресцентной диагностики опухолей с помощью производных гематопорфирина. Однако применение их в качестве фотосенсибилизаторов для ФДТ было затруднено из-за высокой кожной фототоксичности.

Липсон с коллегами в период с 1960 по 1967 гг. работали в направлении усиления сродства гематопорфирина к опухолевой ткани путем его обработки уксусной и серной кислотами с последующим щелочным гидролизом. В результате был получен так называемый гематопорфирин-дериват, который авторы с успехом использовали для флуоресцентной диагностики рака шейки матки, легких и желудка. В 1974 г. из смеси производных гематопорфирина путем мембранной фильтрации была получена фракция, содержащая в основном тримеры. Полученный препарат был запатентован, получив название «Фотофрин I». В 1976-1983 гг. «Фотофрин I» применялся для создания эндобронхиальных и пищеводных обструкций, а также для лечения рака мочевого пузыря, кожи и головного мозга [17].

Огромный вклад в применении ФДТ для лечения опухолей внес Догерти - руководитель центра фотодинамической терапии в Институте рака в г. Буффало, штат Нью-Йорк, США. Так, в 1975 г. он впервые сообщил об успешном излечении почти 50% опухолей молочных желез у мышей и карциносаркомы Уокер-256 у крыс после введения «Фотофрина I» и активации его спустя сутки красным светом. Столкнувшись с высокой смертностью животных после ФДТ, авторы попытались снизить ее, увеличив интервал между введением препарата и фотооблучением до 48 ч, однако эффективность лечения значительно снизилась и излеченность составила всего 20% [17].

В 1978 г. Догерти сообщил о результатах успешного применения метода ФДТ препаратом «Фотофрин I» для лечения 25 больных с плоско- и базальноклеточным раком кожи, метастазами меланомы и рака молочной железы [2]. В качестве источника излучения была использована ксеноновая лампа. Фотооблучение осуществляли спустя 24-168 часов после введения фотосенсибилизатора. Из 113 очагов 98 были излечены полностью, 13 - частично и только 2 больных оказались резистентными к лечению. Из побочных эффектов были отмечены ожоги, некрозы кожи и эритемы. Тяжесть побочных эффектов снижалась при увеличении до 3 дней интервала между введением ФС и облучением. В 1984 г. Догерти с соавторами [2, 17] выделили активную фракцию гематопорфирина и дали ей название «Фотофрин II», которая отличалась от «Фотофрина I» не только повышенной селективностью накопления в опухолях, но и более выраженным противоопухолевым эффектом. Это позволило снизить вводимую дозу ФС без ущерба для эффективности лечения. Начиная с 1992 г. «Фотофрин II» в течение многих лет был единственным ФС, разрешенным для клинического применения. Он с успехом применялся при ФДТ больных с метастазами рака молочной железы, базальноклеточным и плоскоклеточным раком кожи, меланомой кожи, саркомой Капоши, раком языка, спизистой оболочки рта, носоглотки, глиомами, колоректальным раком. Полная регрессия опухолей после ФДТ с «Фотофрином II» наблюдалась в 40-70% случаев [13, 27].

В СССР А. Нокелем, А. Нижником и А. Мироновым (Московская государственная академия тонкой химической технологии им. М, В. Ломоносова) в 1982-1994 годах был создан первый российский фотосенсибилизатор «Фотогем», представлявший собой аналог «Фотофрина-II». С 1999 года препарат «Фотогем» разрешен для медицинского применения.

В 1990 г. канадцем Кеннеди с коллегами [3] был предложен принципиально другой подход к ФДТ, основанный на использовании эндогенных механизмов индуцирования фоточувствительности. Идея заключалась в создании таких условий в организме, при которых происходил бы синтез избыточного количества эндогенных порфиринов непосредственно в тканях опухоли. Для этого пациентам перорально назначали аминолевулиновую кислоту (АЛК), которая не является фотосенибилизатором, но природным предшественником протопорфирина IX (ПП-1Х). При экзогенном введении АЛК она временно «перегружает» нормальный путь биосинтеза гемма, что приводит к накоплению протопорфирина-IX в опухолевых клетках.

В нормальной ткани ПП-IX переходит в гем беспрепятственно в силу того, что в ней имеется достаточное количество железа. В опухоли же его недостаточно, поэтому переход ПП-IX в гем затруднен и создаются условия для накопления ПП-IX в опухолевой ткани. ПП-IX является достаточно активным ФС вследствие наличия интенсивной полосы поглощения с максимумом 630 нм и способности эффективно генерировать синглетный кислород. Кроме того, вследствие селективного накопления ПП-IX в злокачественных клетках, АЛК является эффективным флуоресцентным маркером опухоли.

Препараты на основе АЛК зарегистрированы в Канаде под коммерческим названием «Левулан» («Levulan», DUSA Pharma, Торонто, Канада) и в Норвегии под торговой маркой «Метвикс» («Metvix», PhotoCure ASA, Осло, Норвегия). Они с успехом используется для лечения кератозов, базальноклеточного рака, диагностики и лечения эзофагиомы Баррета, рака мочевого пузыря, опухолей головного мозга и желудка. Особенно эффективно использование препаратов на основе АЛК для эндоскопической диагностики опухолей, визуальное обнаружение которых при обычном белом освещении затруднено [3,17].

На основе АЛК в Институте биоорганической химии Национальной Академии наук Беларуси в 2005 г. разработан белорусский аналог «Аламин». Этот препарат зарегистрирован в Министерстве здравоохранения Республики Беларусь и разрешен для использования в клинике при проведении флуоресцентной диагностики рака мочевого пузыря [3].

Исследования А.А. Мохорта с коллегами, проведенные в ГУ «РНПЦ онкологии и медицинской радиологии им. Н.Н. Александрова» (Республика Беларусь), продемонстрировали эффективность использования «Аламина» в качестве диагностического препарата [].

1.2 Фотосенсибилизаторы

Фотосенсибилизаторы - это вещества, которые способны передавать энергию света другим веществам и тем самым запускать цепочку различных физических и химических процессов [10].

В 60-х годах прошлого века были получены ФС первого поколения - гематопорфирин и его производные [3]. На его основе изготовлены лекарственные формы «Фотофрин II», «Фотофрин II» и «Фотогем». Несмотря на обнадеживающие результаты, полученные при их применении, были выявлены и существенные недостатки, такие как длительная фототоксичность (2,5-3 мес), низкая избирательность накопления, малая глубина повреждения опухолей (3-5 мм), высокая стоимость производства и трудности в обеспечении стабильности характеристик, многочисленные побочные эффекты в виде ожогов кожи.

Наличие недостатов у фотосенсибилизаторов первого поколения стимулировали разработку более эффективных и безопасных фотосенсибилизаторов второго поколения [13]. К ним относятся хлорины - хлорин е6, мезотетрагидроксифенил хлорин, моноаспартил-хлорин е6 и др. Для их производства использовали растительное сырье, в частности водоросли рода Spirulina и листья крапивы [5].

В Европе для лечения опухолей довольно широко применяется фотосенсибилизатор второго поколения «Фоксан» (мета-тетрагидроксифенил-хлорин, который обладает максимумом поглощения на длине волны 652 нм. «Фоксан» отличается высокой противоопухолевой эффективностью при низких дозах введения и облучения. В то же время этому фотосенсибилизатору присущ ряд недостатков: относительно длительное время максимального накопления в опухолевой ткани (3-4 суток), пролонгированный период полувыведения из нормальных тканей, гиперчувствительность здоровых тканей и высокая частота развития фототоксических реакций. ФС «Фоксан» также не способен преодолевать гистогематический барьер.

В России, начиная с 1994 г., а также в Республике Беларусь с 1999 г. проходили клинические испытания фотосенсибилизатора «Фотосенс», разработанный в МПО «НИО-ПИК» (России). «Фотосенс» обладает интенсивной полосой поглощения в красной области спектра на длине волны 675 нм. Было установлено, что этот препарат обладает существенными недостатками: наблюдается наличие выраженного болевого синдрома во время облучения опухали лазером и длительное выделение «Фотосенса» из организма.

Отдельного внимания заслуживают препараты третьего поколения, полученные путем связывания молекулы ФС с молекулами других веществ, наночастицами или липосомами с целью увеличения селективности накопления фотосенсибилизатора в опухолевых клетках [9]. Именно к этим ФС относится «Фотолон», который выпускается РУП «Белмедпрепараты» [3]. Действующей субстанцией препарата является хлорин е6, выделяемый из водоросли Spirullina platensis. Хлорин е6 относится к химическому классу порфиринов, фотосенсибилизирующие свойства которых широко известны. Будучи липофильными они способны связываться с мембранами клеток, прежде всего с плазмалеммой, и при возбуждении видимым светом генерируют синглетный кислород и другие его активные формы, котоорые вызывают повреждение биологических структур в радиусе 100 нм. Порфирины, однако, не обладают способностью избирательно накапливаться в опухолевых клетках [4].

Для улучшения селективности накопления порфиринов в клетках-мишенях их сочетают с различными молекулами-переносчиками. В препарате Фотолон в качестве молекулы-переносчика используется пировинилпирролидон (ПВП) - гидрофильный полимер с молекулярной массой 12 кДа. Препарат Фотолон представляет собой смесь хлорина е6 и ПВП, в которой три положительно заряженных атома натриевой соли хлорина образуют ионные связи с отрицательно заряженными молекулами ПВП (соотношение масс 1:1).

Показано, что аналогичные Фотолону композиции хлорина е6 и ПВП обладают избирательным накаплением в опухолях как in vitro, так и in vivo [4-5], что значительно повышает эффективность ФДТ опухолей. Активация препарата лазером с длиной волны 665 нм позволяет вызывать гибель глубоко расположенных в ткани опухолевых клеток [13]. Было показано, что оптимальное время введения препарата в культивируемые раковые клетки составляет 1-2 часа, а оптимальной для цитотоксического эффекта можно считать концентрацию Фотолона 10-40 мкг/мл [13].

Согласно данным литературы препарат вызывает выраженный цитотоксический эффект, опосредованный продукцией активных форм кислорода. Активированный Фотолон вызывает также и цитостатический эффект, значительно угнетая пролиферацию культивируемых клеток, но последний можно обнаружить только в более поздние сроки.

При неактивированном Фотолоне клетки остаются жизнеспособными, а при его активации светом наблюдается значительная гибель клеток, которая пропорциональна концентрации ФС (рис. 1).

Рисунок 1 ? Зависимость выжываемости клеток от концентрации активированного светом и неактивированного препарата Фотолон [21]

1.3 Механизмы фотосенсибилизации препарата Фотолон

ФДТ опухолей сопровождается массовой гибелью клеток. Большое значение при этом имеет форма клеточной гибели - некроз или апоптоз, поскольку молекулярно-клеточные механизмы и, соответственно, клинически значимые последствия этих процессов принципиально различаются. Более предпочтительным является, вероятно, апоптоз, т.к. эта форма гибели клеток развивается медленно, не подавляет иммунную систему и не вызывает воспалительной реакции [].

Фотохимические реакции с участием кислорода, названные процессами фотосенсибилизации, разделяют на два типа в зависимости от первичного вовлечения радикальных посредников. Фотохимические реакции первого типа включают прямое взаимодействие возбужденного светом ФС с субстратом и образование переходных радикалов, которые затем вступают во взаимодействие с кислородом. Вначале поглощая кванты света молекула ФС переходит из основного состояния в возбужденное. В последующем может происходить либо обратный переход в основное состояние с излучением кванта света (флуоресценция), либо триплетная форма ФС взаимодействует с биологическими молекулами и, отнимая у них электроны или атомы водорода, инициирует образование вызывающих окисление свободных радикалов. Этот тип реакций представляет собой фотоиндуцированную аутооксидацию [8, 9]. В фотохимической реакции второго типа перенос энергии происходит из возбужденного триплетного состояния ФС на молекулярный кислород с образованием синглетной формы кислорода, который активно реагирует с ненасыщенными липидами, холестерином, боковыми группами б-аминокислот и другими биомолекулами. Эффективность фотоповреждения в значительной степени связана с внутриклеточной локализацией ФС, поскольку время жизни синглетного кислорода составляет менее 0,04 микросекунды, и за время своего существования он может мигрировать на расстояние не более 20 нм [10]. Поэтому первичными мишенями цитотоксического действия ФС являются субклеточные структуры, в которых он локализуется при облучении [9].

В целом, механизм действия ФДТ включает целый комплекс прямых и непрямых реакций взаимодействия различных компонентов, в конечном итоге приводящих к цитостатическим и цитотоксическим эффектам.

Качественные и количественные изменения спектра флюоресценции, могут предоставить информацию о влиянии окружения на возбужденное состояние молекулы. Спектр флуоресценции комплекса Се6-PVP в H₂O, PBS и эмбриональной телячьей сыворотке (5% и 10%) исследовался при трех различный температурах - 4⁰C, 21⁰C, 37⁰C в течение 27 дней. Устойчивость СЕ6-PVP радикально ухудшилась при растворении этого комплекса в воде. К 27 дню интенсивность излучения Ce6-PVP снизилась до 98%, 72% и 100%, соответственно при 37⁰C, 21⁰C, 4⁰C. С другой стороны, когда Се6-PVP был растворен в PBS интенсивность Ce6-PVP снизилась до 27% при 37⁰C к 27 дню. В течение такого же периода интенсивность Ce6-PVP в PBS при комнатной температуре и 4⁰C снизилась до 45% и 44%. При растворении Ce6-PVP в 5% и 10%-ной сыворотке комплекс был устойчива 27 дней при всех трех температурах [19].

1.4 Взаимодействие препарата Фотолон с липопротеинами

Липопротеины - сложные соединения, молекулы которых построены из липидов и белков, связанных между собой посредством гидрофобных и электростатических взаимодействий. Липопротеины входят в состав всех живых организмов, выполняют функцию транспорта и запасания липидов, являются необходимой составляющей различных структур клетки. Содержание липопротеинов в крови служит важным диагностическим тестом при ряде заболеваний (23).

Различают липопротеины свободные, или растворимые в водной среде (липопротеины плазмы крови, молока, желтка яиц и др.), и структурные (липопротеины мембран клеток, миелиновой оболочки нервов и др.). Наиболее изучены липопротеины плазмы крови человека. Их делят на четыре класса, в зависимости от размеров и локализации: липопротеины с высокой плотностью (HDL), низкой плотностью (LDL) и очень низкой плотностью (VLDL). Их главной функцией является внутриклеточный транспорт и транспорт жиров в крови (27).

Липопротеины являются ключевым компонентом, который регулирует транспорт фотосенсибилизаторов в сосудистой системе человека (16). Взаимодействие фотосенсибилизатора с липопротенами зависит от: неполярности частиц фотосенсибилизатора и липидов, их агрегационных свойств, полярности, кислотности среды, а также химической природы боковых групп фотосенсибилизатора (15,16). В этих работах было показано, что комплекс Ce6-PVP взаимодействует с VLDL и, следовательно, транспортными молекулами для данного фотосенсибилизатора является эта фракция липопротеинов.

Порфирины, как известно, имеют высокое сродство к сывороточным белкам, в частности, к липопротеинам и альбуминам, однако механизм этого явления еще до конца не изучен. Липопротеины плазмы крови способны доставлять любые фотосенсибилизаторы к клеткам - мишеням, прикрепляясь к их специфическим рецепторам. Наибольшим числом рецепторов к липопротеинам обладают активно пролиферирующие клетки, включая опухолевые. Так как LDL является главным компонентом липопротеина в крови, то он более подходит на роль переносчика фотосенсибилизатора (27).

Рис. 2 ? Транспорт фотолона е6-ПВП осуществляется с помощью липопротеинов низкой плотности, которые доставляют его к рецепторам

Было показано, что липофильные фотосенсибилизаторы имеют высокое сродство к LDL и VLDL, тогда как амфифильные фотосенсибилизаторы имеют высокое сродство к HDL. В противоположность этому гидрофильные фотосенсибилизаторы имеют высокое сродство к альбумину (23). Вероятно, что комплексы Ce6-PVP поступает в раковые клетки через VLDL-рецепторы (28).

Таким образом, специфичность комплекса Ce6-PVP по отношению к раковым клеткам может определяться как специфическим характером их транспорта (посредством рецеторов липопротеинов), так и сродством переносчика PVP к липидному компоненту клеточных мембран. Однако этот важный для понимания механизма цитотоксичности комплекса Ce6-PVP вопрос ранее не изучался.

2. Материалы и методы

Эксперименты были выполнены в условиях in vitro на культуре нормальных клеток HEK-293, Линия HEK-293 также широко используется в современной клеточной биологии. Эта перевиваемая линия была получена из первичной культуры клеток эмбриональной почки человека путем трансформации ее аденовирусной ДНК. Клетки HEK-293 легко культивируются, отличаются крупными размерами и структурированной, богатой органеллами цитоплазмой. Поскольку эта линия не демонстрирует выраженной спонтанной цитопатологии, мы использовали ее в качестве экспериментальной модели нормальных клеток.

Ход работы:

Разведение фотолона:

5,28 мг. навеска фотолона +20 мл.H2O =200 мг/мл

5,28/20=264

1. 264 - 20 мл. H2O

200 - X X=26,4 мл H2O

2. Берем 13,2 от 26,4 H2O, добавляем к фотонолу,

который в дальнейшем будет находиться в специальном флаконе, в затененном месте

Окрашивание клеток, отмывка и пригатовление препората:

2. Берем пробирку, вносим туда по 0, 5 мл. суспензии клеток (500 мкл), добавляем фотонола 500 мкл из флакона (конц фотонола в 2 раза падает)

3. Оставляем на 40 мин пригатовленную смесь

4. Центрифугируем (1400 оборотов, 10 мин), отбираем жидкость, оставляем осевшие на дне клетки.

5. Добавляе к осевшим клеткам такой же объем H2O (500 мкл), взбалтываем

6. Готовим предметные стекла, ставим на специальную планку для окрашивания. Добавляем по 10 мкл. пригатовленных клеток и покрываем покровным стеклом.

7. Смотрим под микроскопом и настраиваем съемку, снимаем через 1 мин, каждую мин. 1 снимок. Делаем стек.

Проводили опыт при различных концентрациях мелатонина (100 мкм, 50 мкм, 10 мкм, 1 мкм, 100 нм) каждую из этих доз добавляли в пробирки с фотолоном. Оставляли на 40 мин, Затем облучали.

Облучение проводим с помощью осветителя OH-19. Использовали фильтр с max поглащением (420 нм) и тепловым фильтром. При обработке клеток использовали луночную панель.

Калибровку источника света проводили с помщью люксметра Ю-117.

Энергетическая освещенность поверхности

Люмен - ед. измерения светового потока

1 люкс=1 люмен/ 1 мІ

1 lx=683* W/mІ

D (ячейки)=1 см

Время экспозиции составляло 0,5, 10, 15, 20, 25, 30 мин. Это время экспозиции соответствовало энергии 0, 300, 600, 900, 1200, 1500, 1800 Дж.

Энергия, Дж	Время, мин
0	0
300	5
600	10
900	15
1800	30

Перевиваемые культуры клеток выращивали в шестилуночных планшетах на среде DMEM с добавлением 10%-ной эмбриональной телячьей сыворотки, 100 ед/мл пенициллина и 100 мг/мл стрептомицина в CO₂ - инкубаторе при 37 ⁰С.

Для введения в клетки растворенный в PBS препарат Фотолон смешивали с равным объемом отмытых от среды клеток в концентрации 200-500 тыс/мл, затем инкубировали от 30 до 70 мин при комнатной температуре.

В разбавленных водных растворах спектр поглощения вещества совпадает со спектром его возбуждения. Поэтому при возбуждении в первом или втором пиках Фотолон флуоресцирует красным светом с длиной волны 665 нм, что позволяет исследовать его распределение в живых клетках и тканях с помощью флуоресцентной микроскопии.

Исследование проводилось с помощью флуоресцентного микроскопа Eclipse 50i (Nikon, Япония), снабженного цветной телекамерой DigitalSpot-5M под управлением программного обеспечения NIS-Elements. Для обработки и анализа снимков использовали программу ImageJ [12]. Полученные численные результаты обрабатывали с помощью программ Statistica 6.0 и Origin 7.0.

Рисунок 3

3. Результаты и обсуждение

3.1 Распределение препарата Фотолон в клетках HeLa

Как видно из рисунка 1, спектр поглощения хлорина е6 имеет три четко выраженных пика.

Рисунок 4. - Структурные формулы хлорина е6 (А) и пировинилпирролидона (В), спектр поглощения хлорина е6 (С)

Первый из них, наиболее сильный, расположен около 400 нм в т.н. полосе Соре. Он позволяет возбуждать флуоресценцию Фотолона с помощью набора фильтров с дихроическим зеркалом на 420 нм (например, Zeiss №02). Этот набор фильтров имеет также то преимущество, что позволяет одновременно наблюдать флуоресценцию хлорина е6 и ДНК-специфических флуорохромов Hoechst 33342/33258 и акридинового оранжевого (АО). Возбуждение с помощью такого набора фильтров вызывает, однако, ряд нежелательных эффектов, в т.ч. быстрое выгорание препарата и аутофлуореценцию некоторых субклеточных структур и артефактов. Для устранения этих эффектов флуоресценцию хлорина е6 можно также возбуждать зеленым светом (пик поглощения около 500 нм). Однако в этом случае требуется более интенсивное освещение, которое можно получить в микроскопе AxioImager (Zeiss), набор фильтров №14. Третий пик поглощения с длиной волны 665 нм используется при возбуждении монохроматическим излучением лазера для фотодинамической терапии

Более детальное исследование внутриклеточного распределения препарата Фотолон проводилось в клетках HEK-293 при возбуждении его в полосе Соре, как это показано на рисунке.

Рисунок 5. - Постепенное проникновение препората в течение 10-15 мин., Микроскоп Nikon E50i, объектив 60х

Из этих наблюдений следует, что в клетках HEK-293 Фотолон накапливается в локализованных около ядра областях цитоплазмы. Необходимо отметить, что клетки HEK-293 могут сильно различаться размерами и конфигурацией цитоплазмы, и, как следствие, распределением Фотолона в цитоплазме. Тем не менее можно видеть, что препарат преимущественно связывается с мембранами, в частности, с легко идентифицируемыми плазмалеммой и нуклеолеммой. Основное количество препарата, однако, распределяется по цитоплазме, вероятно по мембранам эндоплазматической сети (ЭПС), концентрируясь в зоне расположения комплекса Гольджи(17).

Нами было также замечено, что распределение препарата в цитоплазме клеток HEK-293 медленно изменяется во времени. Если после приготовления слайда он распределялся по цитоплазме равномерно, то через 15 минут скапливается в отдельных участках, расположенных около клеточного ядра.

Рис. 6. Интенсивность проникновения фотолона с учетом времени (через каждые 5 мин) Обозначения: треугольник - проникновение в клетку, квадрат-фон

Во многих клетках, особенно небольшого размера, таких участков может быть два с обоих сторон ядра. У других клеток Фотолон распределяется в виде неровного кольца вокруг ядра. У третьих Фотолон накапливался преимущественно с одной стороны ядра. Предположительно, что препарат по мере проникновения в клетку поступает сначала в ЭПС, а затем перемещается к комплексу Гольджи. В этом случае препарат должен поступать в клетку путем эндоцитоза, связанного с потоком одноконтурных везикул от плазмалеммы к ЭПС, а его накопление в комплексе Гольджи может отражать защитную реакцию клеток.

Рассмотрим на графике распределение препарата

Рисунок 7. Самые высокие точки(пики), где находится нуклеоплазма (оклолоядерная зона) показывают самую большую вместимость препарата

Тоже самое можно наблюдать и на других клетках:

Рисунок 8. Самые высокие точки(пики), где находится нуклеоплазма (оклолоядерная зона) показывают самую большую вместимость препарата

В клетках HEK-293 Фотолон накапливается в компактных зонах цитоплазмы, которые по размерам, форме и локализации обладают сходством с комплексом Гольджи и прилежащими к нему участками ЭПС. Для строгого доказательства этого необходимо использовать специфические маркеры органелл.

3.2 Выцветание препарата при его возбуждении в полосе Соре

Факторы, влияющие на выгорание:

1. Присутствие кислорода, что увеличивает скорость выгорания

2. Возбуждение интенсивности излучения, также должно быть принято во внимание, так повышенная интенсивность предполагает высокие темпы выгорания.

3. Химическая микросреда, в которую погружен флуорохром

4. Химические связи

В ходе эксперимента мы рассмотрели клетки, которые при возбуждении выгорали.

Для удобства анализа, мы пользовались программой ImageJ и камерой, при создании стека (полноценного ролика, созданного из нескольких снятых кадров), в результате мы увидели равномерное выгорание. Нет различий в выгорании мембраны, цитоплазмы, нуклеосомы.

Эффект выгорания мы наблюдали в пределах каждые 5 сек на 1 снимок.

Для эффективности результатов сравнили несколько клеток. (на примере 3-х клеток)

Если мы могли заметить изменения, так только во времени и интенсивности выгорания, но само выгорание шло равномерно. Это можно понаблюдать на графике.

При возбуждении препарата Фотолон в полосе Соре наблюдается его быстрое выцветание. При этом происходит не только значительное падение интенсивности флуоресценции, но и изменяется и ее спектр. Следует отметить, что в области плазмалеммы красная флуоресценция хлорина е6 сохраняется лучше. Основным механизмом выцветания флуорохрома при его интенсивном возбуждении (photobleaching) считают фотодеструкцию его молекул в присутствии кислорода. (6,7)

Рисунок 9. - Обесцвечивание Фотолона в культуре клеток HEK при возбуждениив полосе Саре через 5 минут после начала облучения. Микроскоп Nikon E50i, объектив 60х

Поэтому на динамику деструкции молекул флуорохрома могут влиять физиологическое состояние клетки, в особенности параметры ее энергетического обмена. С другой стороны, если Фотолон поступает в клетку путем эндоцитоза, то он может подвергаться биотрасформации в ходе защитной реакции клетки на окислительный стресс. На такую возможность косвенно указывают наблюдаемые иногда различия в темпах обесцвечивания внутриклеточных органелл и даже отдельных клеток.

При возбуждении флуоресценции введенного в клетки HEK-293 препарата Фотолон в полосе Соре (400 нм) наблюдается его обесцвечивание. Возможными механизмами этого явления могут быть фотохимическая деструкция молекул флуорофора в присутствии кислорода, а также процессы биотрансформации компонетов препарата в условиях вызванного им окислительного стресса.

Хорошо видно, что с увеличением дозы доля погибших клеток в популяции увеличивается в соответствии с экспоненциальной зависимостью кривой, но последняя точка (30 мин) резко отличается от предыдущих (100% гибель). Мы полагаем, что график свидетельствует о наличии двух типов клеток в культуре. Первый тип клеток отличается повышенной чувствительностью к ФДЭ (фотодинамическому эффекту). Популяция этих клеток при экспозиции 20 мин погибает практически полностью. Второй тип клеток более устойчивый к окислительному стрессу вызванному ФДЭ погибает при экспазиции более 20 мин.

Полученные нами ранее микрофотографии клеток культуры НЕК-293, после их обработки фотолоном в течение 40 мин свидетельствует о наличие в клеточной популяции гетерогенности по количеству вошедшего в клетку препарата. Как видно на рис2 эти клетки отличаются более сильной флуарисценцией препарата и более крупными размерами. Можно предполагать, что эти клетки (полиплоидные или в G-2 клеточном цикле) могут отличаться по чувствительности к фотодинамическому эффекту. Это предположение будет экспериментально исследоваться в ближайшее время.

Для изучения действия мелатонина, продукта метаболизма триптофана, мы использовали разные его концентрации. В экспериментах мы вводили мелатонин для уменьшения проявлений окислительного стресса и убедились из полученных графиков, что он способствует сохранению жизнеспособности клеток. Графики наглядно показали, что при большей концентрации (100 мкм) процент выживших клеток больше.

Таблица. 1 Средние значения динамики ФДЭ и стандартных отклонений в пределах 300Дж, 600Дж, 900Дж, 1800 Дж

Доза энергии	% погибших клеток	Среднее	SD
0	11,8	17	17,1	15,3	3,0315
300	21,7	27,2	45	31,3	12,17908
600	37,7	43,5	69,3	50,16667	16,82181
900	37,3	39,6	69,8	48,9	18,13643
1800	100	99.3	98.2	99,2	1,85

Таблица 2. Средние значения динамики ФДЭ и стандартных отклонений в пределах 300 Дж., 600 Дж, 900 Дж, 1200 Дж, 1500 Дж, 1800 Дж

Доза энергии	% погибших клеток	Среднее	SD
0
300	3	2,8	2,9	2,9	0,1
600	15,7	12	13,85	13,85	1,85
900	38,2	46,8	42,5	42,5	4,3
1200	71,1	55,45	63,27	63,27333	7,825
1500	93,1	93,4	93,5	93,33333	0,20817
1800	96,3	100	98,15	98,15	1,85

Таблица 3. Контроль с фотолоном без мелатонина. Средние значения динамики ФДЭ и стандартных отклонений в пределах 300 Дж., 600 Дж, 900 Дж, 1200 Дж, 1500 Дж, 1800 Дж

Доза энергии	% погибших клеток	Среднее	SD
0	18,1	14,5	12,2	14,93333	2,97377
300	34,8	55,3	46,6	45,56667	10,28899
600	43,5	47	46,5	45,66667	1,89297
900	73,4	75,6	73	74	1,4
1200	77,6	83	85,7	82,1	4,12432
1500	87	86,3	88,2	87,16667	0,9609
1800	100	90,9	90,1	93,66667	5,49939

Таблица 4. Опыт с фотолоном и мелатонином. Средние значения динамики ФДЭ и стандартных отклонений в пределах 300 Дж., 600 Дж, 900 Дж, 1200 Дж, 1500 Дж, 1800 Дж

Доза энергии	% погибших клеток	Среднее	SD
0	16,5	13,1	11,7	13,76667	2,46847
300	20,4	24	24	22,8	2,07846
600	13,1	31,1	31,1	25,1	10,3923
900	32	50,9	37,9	40,26667	9,66971
1200	32	50,8	30,5	37,76667	11,31209
1500	51,3	40,2	40,2	43,9	6,40859
1800	72	31,7	31,7	45,13333	23,26722

Рис. 10. Среднее значение динамики ФДЭ в пределах 300 Дж, 600 Дж, 900 Дж, 1800 Дж. (соответственно 5 мин, 10 мин, 15 мин и 30 мин)

Зависимость фотодинамическго эффекта (ФДЭ) препарата Фотолон от времени облучения клеток HEK светом с длиной волны 460 нм. На верхнем снимке представлена динамика ФДЭ в пределах 30 минут эксперимента (среднее из трех повторностей).



Рис. 11. Среднее значение динамики ФДЭ в пределах 300 Дж., 600Дж, 900 Дж, 1200 Дж, 1500Дж, 1800Дж (соответственно 5 мин 10 мин, 15 мин, 20 мин, 25 мин, 30 мин)

Рис. 12. Динамика ФДЭ и исследование защитного эффекта мелатонина

Рис. 13. Эффективность выживаемости клеток при различных концентрациях мелатонина (100 мкм, 50 мкм, 1 мкм, 0.1 мкм)

Мелатонин (N-ацетил-5-метокситриптамин), продуцируемый в эпифизе, сетчатке глаза, клетках APUD системы пищеварительного тракта, печени, желчном пузыре, почках, надпочечниках, легких, плаценте, эндометрии, яичниках, предстательной железе, тимусе, эндотелии, клетках крови (лейкоцитах, тромбоцитах), регулирует циркадную динамику физиологических функций [Барабой В.А., 2000; Комаров Ф.И. и др., 2004; Бондаренко Л.А., Бабенко Н.А., 2006].

Данный гормон является универсальным эндогенным адаптогеном, который поддерживает гомеостаз организма на определенном уровне и обеспечивает приспособление к непрерывно меняющимся условиям внешней среды [Анисимов В.Н., 2008]. Воздействие постоянного освещения усиливает активность свободнорадикальных процессов и снижает уровень АОС [Илюхина В.А. и др., 2005], тогда как введение мелатонина уменьшает эти изменения [Hussein M.R. et al., 2007].

Известно, что мелатонин является мощным антиоксидантом.

Способность гормона проникать через биомембраны обеспечивает возможность защиты от окислительных повреждений как мембранных структур, так и ядерной ДНК [Барабой В.А., 2000]. Отмечается, что мелатонин, с одной стороны, проявляет прямые антиоксидантные свойства, выступая в роли «ловушки» свободных радикалов (гидроксил-радикала, перокси-радикала, супероксид-аниона, синглетного кислорода, NO и пероксинитрита), и подавляет активность процессов ПОЛ, а с другой - может усиливать активность ферментов АОС и повышать их уровень (СОД, каталаза, GSH - пероксидазы и др.) Его способностью хорошо растворяться как в воде, так и в липидах, благодаря чему он проникает через клеточные мембраны и обеспечивает осуществление различных физиологических процессов [Catalб A., 2007; Анисимов В.Н., 2008].

Мелатонин взаимодействует с мембранными рецепторами (МТ 1 и МТ 2), G-белками, которые расположены в разных участках ЦНС, сетчатке глаза, кровеносных сосудах, желудочно-кишечном тракте, печени, почках, коже, клетках иммунной системы, а также с внутриклеточными белками

1. Взаимодействие мелатонина с реактивными формами (свободными радикалами)

Гидроксильный радикал (ОН ^-)

ОН ^- при случайном столкновении с молекулой способен разрушать клетки.

Взаимодействие включает в себя прямое удаление ОН к мелатонину, где у мелатонина есть ловушка, 5-5 диметилпуролин-N-оксид для ОН. Этот процесс происходит после фотолиза Н₂О₂ с 254 нм ультрафиолетовым светом и излучением.

Электрон спиновой резонанс (ESR) используется для спектроскопического распознавания DMPO-WHO (продукт присоединения, который формируется при ультрафиолетовом фотолизе из H₂O₂₎ Когда к повышенной дозе мелатонина добавили эту смесь (DMPO-WHO), то ESR сигнал стал в большей степени угасать, что свидетельствовало о понижении количества DMPO-WHO и высвобождении ОН.

Еще у мелатонина есть одна ловушка ABTS для WOH. Это приводит к устойчивости тиозольного радикала. Подсчитано, что нормальная константа взаимодействия метанола с ОН = 0,6. Когда в первом случае она была равна 2,7.

Продукт взаимодействия мелатонина с ОН - циклический 3-гидроксимелатонин (3ОНМ). Продукт имеет молекулярную массу 248 и был описан при использовании жидкой хроматографии высокого разрешения. Этот продукт был также идентифицирован MS, 1H NMR and COSY 1H NMR. При проведении экспериментов на крысах и человеке 3ОНМ нашли в моче. Его количество в моче было повышенно, когда мелатонин вводили крысам. Кроме того, когда крысы были подвергнуты ионизирующему излучению, что вызвало большое количество WHO и экзагенно передало мелатонин, в результате этого количество3 ОНМ заметно увеличилось.

Н2О2

Чтобы предотвратить образование WHO, могут быть эффективны методы, которые позволят снизить образование WОН.

1. H2O2 может проникать через клеточные мембраны, а внутри клеток реагировать с Fe2+ или Cu2+ по реакции Фентона, образуя активную форму ОН*[Halliwell B., Gutteridge J.M.S., 1999]

2. Мелатонин реагирует с H2O2 и как номинальная доза ответа понижается в концентрации при смешивании, что ведет к повышении количества мелатонина. При взаимодействии образуется N1 ацетил-N2-формил-5 метоксикинурамин (AFMK). Молекула имеет значительный выход. Затем идет преобразование AFMK (при взаимодействии AFMK с CAT) в N1-ацетил-5 метоксикинурамин (AMK). Это приводит к каскадным реакциям, которые помогают увеличить эффективность мелатонина как антиаксиданта с образовавшимися продуктами.

Если мелатонин действительно реагирует с Н2О2 in vivo, то это важно, так как это магло бы пропорционально ослабить формирование WHO.

Супероксид

Мелатонин не способен прямо высвобождать О2. О2 получают гипоксантин-ксантин оксидазными системами в присутствии любого цитохрома С с мелатонином или без него.

Еще не совсем ясно как происходит понижение количества О2, когда мелатонин присутствует.

Используя угасание ESR сигнала DMPO-O2 как индекс мелатонина способен высвобождать О2. Другие предполагают, что индольный радикал может нейтрализовать О2.

Синглетный кислород

1О2 - высоко энергетическая форма. Наиболее часто образуется при фотосенсибилизации субстратов. Рассмотрим на примере рибофлавина (В2), подвергаемому яркому белому свету, катализируется с образованием 1О2, который подавляется мелатонином. Данные показывают, что мелатонин изменяет цитоксичность 1О2мозжечковых гранулярных клеток культивируемых на фоточувствительность при подвержении светом.

NO

Физиологически активная молекула, является регулятором многих функций в организме. Ее образование происходит из аминокислоты L-аргинина под действием NO-синтазы с участием никотинамидадениндинуклеотида (HAD(P) H) и ряда других кофакторов. В зависимости от микросреды NO может преобразовываться в различные другие реактивные формы азота (RNS), такие как NO1, NO2, ONOO2. Некоторые физиологические эффекты могут быть промежуточными посредниками: S-нитроцистеин или S-нитроглутатион.

Наиболее значимыми радикалами в биорегулировании являются супероксид и NO. Эти радикалы формируются двумя группами ферментов (NAD(P) H) оксидазы и NOS изоформы, соответственно. Многие регуляторные эффекты являются преходными формами к перекиси водорода и другим реактивным формам кислорода, которые являются производными от супероксида.

Влияние мелатонина на антиоксидантные и прооксидантные ферменты

Главные антиоксидантные ферменты включают SOD, CAT, CPx, которые играют важную роль в метаболизме реактивных форм О2 и способны уменьшать окислительное повреждение. Мелатонин может стимулировать экспрессию генов для этих ферментов, увеличивать их активность.

Некоторые антиоксидантные ферменты (супероксиддисмутаза, глутатионпероксидазы, каталазы, тиоредоксин) являются мощными акцепторами, но происходят в клетках только при относительно низких концентрациях. Аминокислоты и белки тоже акцепторы, но аминокислоты менее эффективны чем классические антиоксидантные ферменты по молярной массе.

Ученые определили антиоксиданты как вещества, способные при низких концентрациях конкурировать с другими окислительными субстратами, и таким образом задерживать или значительно препятствовать окислению этих субстратов (ферменты SOD, глутатионпероксидазы, каталазы, токоферол, витамин Е, керотин, витамин С, глутатион.

Есть соединения которые обладают относительно низкой удельной антиоксидантной активностью по молярной массе, но при высоких концентрациях, что способствует действию АФК (свободные аминокислоты, пептиды, белки) Практически все аминокислоты могут служить в качестве мишени для окислительной атаки АФК. Но некоторые аминокислоты, такие как триптофан, тирозин, гистидин, цистеин особенно чувствительны к ROS. Т к концентрация свободных аминокислот равна 1021 М

Теперь рассмотрим за что отвечает каждый из ферментов. SOD (дисмутаза) преобразует супероксид в перекись водорода. Существует 2 изоформы SOD Mn SOD и CuZn SOD. Высокое давление SOD при отсутствии соответствуещего увеличения в любом другом ферменте CAT или GPx или обоих может вызвать мутацию (трисомию по 21 хромосоме) Были проведены эксперементы на крысах, которые имели острые или хронические заболевания. Им вводили мелатонин. Происходила экспрессия генов при MnSOD и CuZn SOD, в результате чего происходило их увеличение в мозгу. Действие мелатонина нуждается в геномной активации и это возможно ответ на рецепторные медиаторы, где мелатонин защищает мозг от окислительного повреждения. SOD еще защищает нервные ткани от свободных радикалов.

Два главных фермента, которые участвуют в преобразовании перекиси водорода - CAT или GPx (каталаза и глутатионпероксидаза)

Мелатонин может стимулировать GPx активность. Активность фермента продвигается через рецептор-зависимый механизм. Этот стимуляторный эффект мелатонина GPx активности в мозгу может быть частью антиоксидантной значимости в тканях, который играет важную роль в детоксификации H2O2 через CAT. Мелатонин имеет возможность повышать GPx активность невыходя за границы мозга и живой ткани. Паблос обнаружил, что к 90 мин. После введения определенной дозы мелатонина (500lg/kg) в ткани цыпленка GPx активность значительно увеличивалась на 90 мин. в легких, в кишечнике, почках, сальных железах, печени, мозгу, сердце, с процентным увеличением от 22 до 138% Эта активность была выдвинута с привлечением ядерного рецептора для индола.

Метаболизм перекиси водорода и гидропероксида каталитически поддерживается GPx. GSH окисляется до дисульфида GSSG. Более чем 99% глутатиона в клетках существует как GSH. Сформировавшийся GSSG может вновь быстро преобразоваться в GSH с помощью фермента GRd

В глутатионпероксидазе реакция глутатиона окислевшегося глутатиондисульфидом, который может обратно превращаться в глутатион с помощью глутатионредуктазы и NADHP. Исследования проведенные на цыплятах и мышах тоже показали, что увеличение дозы мелатанина увеличивает активность GRd через механизмы вовлекающие в себя ядерные рецепторы. Для активности GRd необходим ко-фактор NADHP, который вырабатывается ферментом глюкоза-6-фосфат дегидрогеназой(G6PD) G6PD тоже относят к антиоксидантным ферментам. Индол увеличивает активность G6PD.

CAT обеспечивает каталитическое детоксифицирование Н2О2 через клетки.

СAT преимущественно локализуется в пероксисоме, в мозгу его меньше чем в других тканях. Активность САТ как и дугих ферментов понижается при условиях окислительного стресса.

Одна из способностей про-оксидантных ферментов это способность подавлять(замедлять) действие мелатонина. Азотная окись синтетезы (NOS) вызывает образование NOW от аргинина. NOW когда образуется в больших количествах может быть высокотоксичным и кроме того может соединяться с О2 и образовывать высоотоксичный агент ОNOO -.

Исследования последних лет привели к пониманию того, что большинство патологических процессов в человеческом организме сопряжено с нарушениями прооксидантно - антиоксидантного баланса [Владимиров Ю.А., 1998; Донскова Ю.С. и др., 2004].

Из рисунка видно, что супероксиддисмутаза продуцирует нерадиактивный кислород, перекись водорода. Перекись водорода превращается в ОН под воздействием ферментов: каталазы и глутатион пероксидазы. В результате метаболизма происходит понижение глутатиона(GSH) к дисульфиду. (GSSG). GSSG возвращается обратно к GSH с помощью других антиоксидантных ферментов (глутатион редуктазы)

Окислительные процессы, сопровождающиеся образованием токсических, вследствие своей высокой реактивности, активных форм кислорода (АФК), органических и неорганических перекисных соединений, являются неотъемлемой частью функционирования живого организма так же, как и антиоксидантные механизмы, осуществляющие их инактивацию [Скулачев В.П., 1995, 1999]. При нарушении баланса этих компонентов на фоне тяжёлых патологических состояний происходит избыточное накопление свободных радикалов.

Выводы

1 Препарат для фотодинамической терапии Фотолон входит в цитоплазму культуры клеток HEK-293, но не входит в клеточное ядро. В цитоплазме он распределяется неравномерно, проявляя сродство к мембранным структурам.

2 Использование флуоресцентноймикроскопии живых клеток в сочетании с методами компьютерногоанализаизображений позволяет изучить динамику идущих в клетке процессов, в частности исследовать поступление препарата Фотолон в культивируемые клетки человека

Размещено на Allbest.ru