Размещено на http://www.allbest.ru/

НАЦІОНАЛЬНА АКАДЕМІЯ НАУК УКРАЇНИ

Інститут фізіології ім. О.О.Богомольця

ДЖУРАН БОГДАН ВАСИЛЬОВИЧ

УДК 612. 7. 616. 003. 725

Вплив активаторів АТФ-залежних калієвих каналів на електрофізіологічні властивості гладеньких м'язів сечоводу ссавців при аутоімунному ураженні.

14.03.04. - патологічна фізіологія

Автореферат дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Київ - 2008

Мета та завдання дослідження. Метою цієї роботи було дослідження релаксуючих ефектів нових фторвмісних активаторів КАТФ - каналів (речовина ПФ - 5 та ПФ - 10) у гладеньких м'язах сечоводу людини та морської свинки за нормальних умов та при дії аутоантитіл, зініційованих запальними процесами нирках і сечовивідних шляхах (обструктивний пієлонефрит).

Для досягнення цієї мети було поставлено наступні завдання:

1. Вивчити вплив нових фторвмісних похідних гуанідину (ПФ - 5, ПФ - 10) на скорочувальну активність ізольованих смужок ГМК сечоводу.

2. Дослідити порівняльну релаксуючу активність нового активатора КАТФ - каналів і відомого активатора КАТФ - каналів - пінацидилу на ГМК сечоводу.

3. Вияснити мембранотропні механізми дії активатора КАТФ - каналів на скоротливу і електричну активність гладеньких м'язів сечоводу.

4. Імуноферментним методом та використанням імуноблотингу провести аналіз сироваток крові хворих на обструктивний пієлонефрит для виявлення аутоантитіл до антигенів скоротливих білків міоцитів сечоводу людини і морської свинки.

5. Дослідити дію антитіл на електрофізіологічні властивості ізольованих смужок сечоводу людини та морської свинки.

6. З'ясувати протекторний релаксуючий вплив ПФ - 5 - активатора КАТФ - каналів за умов антитілоіндукованих фазних скорочень і тонічного напруження гладеньких м'язів сечоводу.

Об'єкт дослідження: ізольовані смужки гладеньких м'язів сечоводу людини і морських свинок, а також сироватка крові хворих на гострий обструктивний пієлонефрит.

Предмет дослідження: електрофізіологічні ефекти нових фторвмісних активаторів КАТФ - каналів (речовини ПФ - 5 та ПФ - 10) на гладенькі м'язи сечоводу людини та морської свинки за нормальних умов та при дії аутоантитіл, що викликаються запальними процесами в нирках і сечовивідних шляхах (обструктивний пієлонефрит).

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Тема дисертації пов'язана з дослідженнями, які виконуються відділом імунології і цитотоксичних сироваток Інституту фізіології ім.О.О.Богомольця НАН України «Вивчення ролі оксиду азоту і ейкозаноїдів в механізмах розвитку гуморальних імунних реакцій та змін функціональної активності клітин під впливом антитіл» (2002 - 2004р.р.) № держреєстрації 0102U000829 та «Вивчення механізмів розвитку імунної патології печінки і жіночої репродуктивної системи та шляхів ії корекції»(2005 - 2008 р.р.). № держреєстрації 0105U003236.

Наукова новизна одержаних результатів. В результаті проведених експериментальних досліджень вперше було з'ясовано скоротливі і електричні (потенціали дії, електротонічні потенціали) реакції ГМК сечоводу людини і морської свинки за дії аутоантитіл та дилятаційні ефекти нових вітчизняних фтормісних активаторів АТФ - залежних калієвих каналів - ПФ - 5 та ПФ - 10.

Методом імуноферментного аналізу показано, що в сироватці крові хворих на обструктивний пієлонефрит присутні аутоантитіла, що у високих титрах реагують з гомологічним (тканина сечоводу людини) і гетерологічним (тканина сечоводу морської свинки) антигенами, якими є білки акто - міозинових комплексів ГМК сечоводу.

Вперше встановлено, що аутоантитіла впливають на електрофізіологічні властивості ГМК сечоводу людини і морської свинки, викликаючи деполяризацію плазматичної мембрани, зменшення амплітуди електротонічних потенціалів, збільшення частоти і амплітуди спонтанних скорочень, посилення тонічного напруження та розвиток осциляцій на плато потенціалів дії і їх тривалості.

Вперше вияснено, що досліджувана речовина ПФ - 5 володіє бінарним ефектом: є активатором не лише калієвих АТФ - залежних каналів, але і викликає блокуючу дію на функціональну активність кальцієвих каналів L - типу плазматичної мембрани ГМК сечоводу, - збільшує амплітуду електротонічних потенціалів, спричиняє гіперполяризацію мембрани міоцитів, що супроводжується розвитком розслаблення ізольованих м'язових смужок сечоводу.

Вперше виявлено, що в умовах in vitro аутоімунного ураження ГМК сечоводу людини і морської свинки використання ПФ - 5, активатора калієвих АТФ - каналів вирогідно зменшує активуючий ефект аутоантитіл за їх ініціації в розвитку фазних скорочень і запобігало формуванню тонічного напруження ізольованих смужок сечоводу.

Практичне та теоретичне значення одержаних результатів. Теоретичне значення цієї роботи полягає в тому, що вперше досліджено модулюючий вплив нового активатора калієвих АТФ - каналів, речовини ПФ - 5, на функціональну активність гладеньких м'язів сечоводу людини і морської свинки за умов аутоімунного ураження. Це відкриває широкі можливості для подальшого вивчення запропонованих фармакологічних засобів при захворюваннях сечовивідної системи з порушеною уродинамікою. Отримані результати є обгрунтуванням для врахування ролі аутоантитіл у формуванні скоротливих реакцій ГМК сечоводу людини при запальних процесах сечовивідної системи. Крім того, викликана речовиною ПФ - 5 активація калієвих АТФ - каналів, спричиняє розвиток запобіжного антитілоіндукованого тонічного напруження ГМК сечоводу людини, що супроводжується порушенням уродинаміки при обструктивному пієлонефриті. В роботі також отримано нові результати щодо властивостей активатора калієвих АТФ - каналів, речовини ПФ - 5, її бінарної дії: активації АТФ - залежних калієвих каналів з одночасним блокуючим впливом на кальцієві канали плазматичної мембрани міоцитів ГМК. Це розкриває широкі перспективи його застосування та можливого фармакологічного вдосконалення. Отримані результати свідчать про високий вибірковий модулюючий вплив активатора калієвих АТФ - каналів мембран ГМК, що може бути основою для розробки методів фармакологічного впливу на м'язи сечоводу для корекції уродинаміки за наявності аутоімунної компоненти при захворюваннях сечовивідної системи: сечокам'яній хворобі, нирковій кольці, порушенні прохідності сечоводу та уретероскопії.

Особистий внесок здобувача. Автором здійснено науковий пошук та обгрунтування напрямку досліджень, особисто виконано весь обсяг експериментальних електрофізіологічних та імунологічних досліджень гладеньких м'язів сечоводу ссавців, проведено статистичне опрацювання одержаних результатів, самостійно підібрана та опрацьована наукова література за темою дисертаційної роботи, описано результати досліджень та їх обговорення, сформульовано основні висновки, підготовлено до публікації матеріали за темою дисертації.

Апробація результатів дисертації. Основні положення дисертаційної роботи доповідались та обговорювались на: ІV Національному конгресі патофізіологів України «Клінічна та експериментальна патологія» (Чернівці, 2004); симпозиумі з міжнародною участю «Мембранные и молекулярные механизмы регуляции функций гладких мышц» (Россия, Томск, 2004); ІІІ Львівсько - Люблінській конференції з експериментальної та клінічної біохімії (Львів, 2004); ІІ Міжрегіональній науково - практичній конференції «Актуальні питання біології та медицини» (Луганськ, 2004); Joint International Meeting of The Physiological Society and FEPS (Bristol, 2005); 27 Міжнародній науково - технічній конференції «Проблеми електроніки» (Київ, 2007); Всеукраїнській науково - практичній конференції молодих учених «Сучасні аспекти медицини і фармації - 2007» (Запоріжжя, 2007); XIV Міжнародній конференції «Інформотерапія: теоретичні аспекти та практичне застосування» (Київ, 2008).

Публікації. Матеріали дисертаційної роботи опубліковано в 10 публікаціях: чотирьох наукових статтях у фахових наукових виданнях, затверджених ВАК України та в 6 тезах доповідей.

Структура та обсяги дисертації. Дисертацію викладено на 142 сторінах друкованого тексту та ілюстровано 28 рисунками і 1 таблицею. Робота складається зі вступу, огляду літератури, розділу опису методів дослідження, розділу результатів власних досліджень, їх аналізу та обговорення, списку використаних наукових джерел, що налічує 228 найменувань, із них 152 іншомовні.

Основний зміст роботи

Матеріали та методи дослідження. Дослідження проведено на ізольованих смужках гладеньких м'язів сечоводу людини і морських свинок з використанням методики одинарного та подвійного сахарозного містка для відведення електричної активності - потенціалів дії ( ПД і ан - і кателектротонічних потенціалів) і реєстрації ізометричного скорочення (Артеменко и др., 1982).

Взяття експерементального матеріалу від пацієнтів із клінікою гострого обструктивного пієлонефриту проводилось лише під час хірургічних втручань на нирці з дотриманням норм біоетики ( Перший Національний конгрес з біоетики, Київ 2000). Із отриманих поздовжніх смужок сечоводу, взятих від рівня ниркової миски чи мисково-сечовідного сегменту (для збереження спонтанної активності) довжиною 1 - 2 см. шириною 0,2 - 0,5 см. готували 3 - 4 препарати (шляхом розрізання в довжину волокна), які поміщали в розчин Кребса-Ханзеліста (в мілімолях: NaCl - 118.4; KCl - 4.7; NaHCO3 - 15.5; MgSO4 - 1.2; CaCl2 - 2.5; KH2PO4 - 1.2; глюкоза -11.5 (pH 7.4) з подальшою фіксацією в експериментальній камері для відведення ПД (за допомогою хлорсрібних електродів) і реєстрації скоротливої активності за допогою механо-електричного перетворювача сили в електричний сигнал (FT 106).

Контролем слугували смужки сечоводу, взяті під час патолого - анатомічного розтину людей (не пізніше ніж 10 годин після смерті) померлих від загальних хвороб (ішемічна хвороба серця, гіпертонічна хвороба, інсульт).

Потенціали дії викликались короткими (5-10мс) прямокутними імпульсами постійного електричного струму. Ан - і кателектротонічні потенціали викликали дією прямокутних імпульсів постійного струму (силою 10-7 А і тривалістю до 5с). Перед дослідженням гладеньком'зові смужки закріплювалися в експерементальній камері. Їх перфузували протягом 30 хв. сольовим розчином Кребса для врівноваження частоти і амплітуди скорочення. В залежності від мети експерименту смужки перфузували розчином хлориду калію (60, 30, 25 або 15 ммоль/л). Робочі розчини насичували газовою сумішшю 9,5% О2 і 5% СО2, рН 7.4. Автоматичний термостат дозволяв підтримувати температуру розчину в експериментальній камері 37 ± 0,5 оС.

Для проведення експериментів на ізольованих смужках сечоводу тварин використовували морські свинки (самці і самки) масою 0,3 - 3,5 кг з дотриманням усіх вимог щодо роботи з лабораторними тваринами (Міжнародна конвенція, Страсбург, 1985). Підготовка препаратів сечоводу морських свинок для дослідження дії нових активаторів КАТФ - каналів гладеньких м'язів і антитіл була такою, як описано для ГМК сечоводу людини.

Кров (до 50 мл) для імунологічних реакцій (визначення титру аутоантитіл) у хворих з клінікою гострого обструктивного пієлонефриту брали із кубітальної вени. Кожен хворий був попереджений про важливість взяття матеріалу для дослідження та давав письмову згоду, що відмічено в кожній історії хвороби. Контролем слугували зразки сироватки крові, взятих у хворих із діагнозом сечосольового діатезу та призовників, які проходили обстеження у відділенні та в процесі обстеження урологічної патології у них не виявлено.

Аутоантитіла проти отриманих білків актоміозину (сечоводу людини і морських свинок) виявляли методом імуноферментного аналізу (ELISA) з модифікаціями (Matsiota et ol. 1987). Препарати актоміозину із тканини (сечоводу, кровоносних судин, нирок, серця, скелетного м'язу) отримували за методом Мargossion S.(1985). Для виявлення антитілопозитивних хворих використовували рівень антитіл (аутоантитіл), що перевищував аналогічні титри у групі здорових донорів на велечину 1д (стандартне відхилення).

Імуноблотинг найбільш реактивних сироваток проти досліджуваних антигенів проводили за відомим методом (Ternynck et ol.,1990).

Електрофорез отриманих білкових препаратів проводили у градієнті концентрацій ПААГ (поліакриламідний гель) (7-22%) в денатуруючих умовах за Laemmli (1970), а також у 14,5% ПААГ.

Із отриманих імуноактивних сироваток виділяли антитіла (г- АТ- сумарна гама-глобулінова фракція) шляхом висолювання за допомогою сірчано - кислого амонію (Фримель, 1987). Концентрацію білку визначали за методами Лоурі- Фоліна (Lowry et аl., 1951), а також Бредфорда (Bredford, 1976). Для контрольних дослідів використовували сироватку крові здорових донорів, із якої виділяли загальну гама-глобулінову фракцію описаним вище методом.

Нові фторвмісні активатори КАТФ - каналів (ПФ - 5 і ПФ - 10) були надані розробниками (академіком НАН України Мойбенком, професором Ягупольським), за що автор щиро вдячний. Перед використанням активатори калієвих АТФ - каналів розчиняли в диметилацетаміді. Глібенкламід розчиняли в суміші з диметилсульфоксиду і етилового спирту (1:1). Глібенкламід, пінацидил, диметилсульфоксид були виробництва «Sigma Chemical» (США). Активатори і блокатори вивільнення гістаміну відповідно речовина 4880 клемастин використовували фірми Sandoz (Швеція).

Результати дослідження обробляли методом варіаційної статистики за допомогою редактора MS Excel 2003, та програмового пакета Statistica 6.0.

Результати досліджень та їх обговорення

Ефекти нових активаторів калієвих каналів на ізольовані м'язові смужки сечоводу іn vitro. Встановлено, що у відповідь на електричне подразнення міоцити нормального сечоводу людини генерували складної форми ПД, їх амплітуда складала 31,8 ± 2,1 мВ, а тривалість - 1,33 ± 0,1с (n=19). Розвиток ПД супроводжувався формуванням фазних скорочень, сила яких знаходилась в межах від 20 до 100 мН, а їх тривалість складала 2,3 ± 0,3 с (n=19). Амплітуда ПД міоцитів сечоводу морської свинки складала 28,7 ± 2,4 мВ, а тривалість - 0,74 ± 0,26 с (n=52). Сила фазних скорочень визначалася варіабельністю і коливалася в межах 2,0 - 12 мН (n=52).

При порівнянні з результатами, отриманими від нормального сечоводу та при досліджуваній патології з'ясувалося, що швидкість наростання пікових потенціалів, їх амплітуда плато і амплітуда скорочення були значно меншими за контрольні. Відмінності в реакції гладенько'язових клітин сечоводу при обструктивному пієлонефриті спостерігалися за дії гіперкалієвого розчину та гістаміну. При цьому амплітуда скорочень була значно меншою від контрольної величини. Зменшення реактивуючого впливу гістаміну на міоцити при гострому обструктивному пієлонефриті, можливо, обумовлено десенсибілізацією гістамінових рецепторів через високі концентрації в крові біологічних амінів і медіаторів запалення. За умов патологічного стану, викликаного обструктивним пієлонефритом, порушується скоротлива здатність міоцитів, що може впливати на зміну просвіту сечоводу. Таке твердження випливає із того, що при цьому захворювані зменшується амплітуда скорочень, швидкість наростання пікових потенціалів і тривалість плато, викликаних електричним подразненням чи гіперкалієвим розчином.

При дослідженні порівняльної дозо-залежної дії активаторів КАТФ - каналів ПФ - 5 і ПФ - 10 виявилося, що їх порогові концентраційні ефекти суттєво відрізняються. Так, для ПФ - 5 вона складала 0,001 мкмоль, а для ПФ - 10 - 0,0031 мкмоль.

Напівмаксимальна ефективна доза ПФ - 5 сладала 0,3 мкмоль, тоді як для ПФ-10 - 1,1 мкмоль. Виходячи із отриманих, даних подальші дослідження були сконцентровані лишена діях ПФ - 5.

Як видно із рис.1 префузія смужок сечоводу речовиною ПФ - 5 в концентрації 1мкмоль/л протягом 15 хв. викликала вирогідне зменшення амплітуди тривалості фазних скорочень. Так, після зміни вихідного розчину Кребса на тестуючий із вмістом активатора АТФ - каналів речовини ПФ - 5 (1 мкмоль) відбулись часозалежні зміни електричної і скоротливої активності. Пригнічення амплутуди фазних скорочень детермінувалося зменшенням тривалості ПД. За аналогічних умов тривалість ПД на 10 хв. аплікації ПФ - 5 складала 31,3 ± 10,3%, а скорочення - 52,4 ± 11,2% (n=6, р < 0,05), а на 15 хв. - відповідно 24,3 ± 5,3% і 44,8 ± 9,3% (n=5, р < 0,05) від вихідних величин. Тривала дія ПФ - 5 в аналогічній концентрації викликала подальше пригнічення реєструючих параметрів електричної і скоротливої активності. Відмічені зміни були зворотниними. Однак, при концентрації ПФ - 5 більше 20 мкмоль, його пригнічуюча дія навіть при тривалій перфузії нормальним розчином Кребса (до 60 хв.) не призводила до величини їх вихідних показників. На ізольованих смужках сечоводу морської свинки і людини встановлено, що ПФ - 5 (1мкмоль) викликає їх розслаблення на тлі гіперкалієвої деполяризації (КСl - 60, 25, 15 ммоль), що засвідчує його міорелаксуючий ефект. Збільшення концентрації ПФ - 5 до 20 мкмоль викликало додаткове розслаблення ГМК сечоводу. Вирогідне зменшення тонусу смужок через активацію КАТФ - каналів залежало від ступеня вираженості попередньо змодельованої котрактури та концентрації ПФ - 5. Якісно ефект ПФ - 5 завжди представляв собою гальмування - генерацію ПД і скорочення. Але якісно охарактеризувати часозалежну дію цієї речовини на генерацію ПД виявилося затрудненим із-за високої варіабельності ефектів.

Рис. 2 Електрична і скоротлива активність ізольованої смужки гладеньких м'язів сечоводу людини в нормальному розчині Кребса (А) та на 5-й (Б) і 10-й (В) хвилині дії ПФ - 5 (10 мкмоль).

Слід зауважити, що викликані зміни ПД і скорочення за дії ПФ - 5 не завжди співпадали з часовими параметрами, що продемонстровано на рис.2 (А, Б, В) ГМК сечоводу людини. Не дивлячись на відсутність формування плато ПД, м'яз розвивав скорочення. Однак, їх амплітуда була вирогідно пригніченою. При цьому деполяризуючий початковий пік потенціалу дії не зазнавав істотних змін. Такі розбіжності в ефектах ПФ - 5 можна пояснити різним ступенем функціонального стану гладеньких м'язів сечоводу при обструктивному пієлонефриті. Для порівняння уретерорелаксуючого ефекту ПФ - 5 в експериментах був використаний широко відомий активатор АТФ - залежних каналів - пінацидил. Дослідженнями встановлено, що останній володіє вирогідно меншим спазмолітичним ефектом. Так, напівмаксимальний ефект ПФ - 5 складав 0,3 мкмоль, тоді як пінацидилу 0,71 мкмоль.

З метою ідентифікації ПФ - 5, як активатора КАТФ - каналів був використаний ефективний їх інгібітор - глібенкламід. Так, після попередньої перфузії смужок сечоводу глібенкламідом (1мкмоль) протягом 10 хв., на її тлі ПФ - 5 зменшувала спазмолітичний ефект і за таких умов напруженість м'язів складала лише 46,3 ± 3,9% (n=6 p < 0,02) від вихідних величин. Збільшення концентрації глібенкламіду до 3 мкмоль при тій же концентрації ПФ - 5 (1 мкмоль) приводило до зменшення пригнічуючого ефекту активатора АТФ - залежних калієвих каналів, а амплітуда скорочення складала 83,7 ± 3,9% (n=5 p < 0,05) від вихідних величин, індукованих гіперкалієвим розчином (60 ммоль). Глібенкламід вірогідно зменшував релаксуючий ефект ПФ - 5 і зсував криву дозу - ефект вправо. Якщо напівмаксимальний ефект ПФ - 5, що направлений на зменшення гіперкалієвої контрактури, складав 0,30 мкмоль, то при спільній дії із глібенкламідом - 0,49 мкмоль. Саме в такій конкурентній дії ПФ - 5, як активатора АТФ - залежних калієвих каналів, на фазно-тонічну компоненту скорочення ГМК і глібенкламіду - блокатора цих каналів проявляється його ефективність в модуляції скоротливої активності ГМК сечоводу. Це дає підставу стверджувати, що ПФ - 5 є потужним релаксатором гладеньких м'язів сечоводу. Сказане підтверджується ілюстрованими матеріалами одного із 6 дослідів цієї серії на рис. 3 (А, Б, В, Г).

Встановлено, що між ПФ-5 і глібенкламідом прослідковується конкуренція за місця, які є причетні до формування скоротливої активності міоцитів сечоводу. Наші результати підтверджуються описаними раніше у фаховій літературі, що демонструють специфічну селективність ПФ - 5 в активації АТФ - залежних калієвих каналів на міоцитах гладеньких м'язів кровоносних судин (Струтинський, 2002) та сечового міхура (Лимаренко, 2006).

Таким чином, новий активатор калієвих АТФ - залежних каналів - фторвмісний похідний гуанідину (аналог пінацидилу) є ефективним модулятором скоротливої і електричної активностей гладеньких м'язів сечоводу людини і морської свинки. Дія останнього концентраційно залежить від його концентрації та експозиції (до 30 хв.). Крім того, він володіє міорелаксуючою дією на ізольовані смужки гладеньких м'язів сечоводу. Встановлені факти дозволяють стрверджувати, що речовина ПФ - 5 може бути ідентифікована як активатор калієвик АТФ - опосередкованих каналів міоцитів гладеньких м'язів сечоводу ссавців.

Мембранні механізми впливу ПФ-5 на електричну і скоротливу активність міоцитів сечоводу ссавців. Досліджено дію ПФ - 5 на іонну проникливість мембран та функціональну активність потенціалокерованих кальцієвих каналів міоцитів сечоводу. Були використані викликані постійним струмом підпорогові зміни мембранного потенціалу міоцитів сечоводу - ан - і кателектротонічні потенціали. Встановлено, що вже на 3 хв. дії ПФ - 5 (1мкмоль) збільшувалась амплітуда ан- і кателектротонічних потенціалів на 13,15 ± 2,1% від початкової вихідної величини в нормальному розчині Кребса, а на 5 хв. відповідно на 16,01 ± 2,9 %, на 10-й хв. - 18,36 ± 3,1% , на 15 хв.- 20,52 ± 3,9% (n=11, p < 0,05).

Збільшення амплітуди електротонічних потенціалів за дії ПФ - 5 засвідчують про розвиток гіперполяризації мембран гладеньком'язових клітин, збільшення опору клітинних мембран і, відповідно, зміною їх іонної проникливості.

За таких умов дія ПФ - 5 може реалізувати свій гіперполяризуючий ефект за рахунок збільшення проникливості мембрани міоцитів гладеньких м'язів до іонів К+ (його виходу із клітини), або зменшення входу іонів Na+ і Ca2+. Відомо (Quale, 1997), що КАТФ - канали підтримують рівень потенціалу спокою, причому їх активація не залежить від величини потенціалу на мембрані гладеньком'язових клітин і концентрації внутрішньоклітиних іонів кальцію.

Дія активатора КАТФ - каналів в діапазоні концентрацій 0,1 - 10,0 мкмоль на тлі змодельованого іонами калію патологічного стану - гіперкалієвої контрактури і стійкої калієвої деполяризації виявилося неефективною. Тільки збільшення концентрації ПФ - 5 до 20 - 30 мкмоль, або зменшення іонів калію до 20 - 15 ммоль, сприяло розвитку гіперполяризуючого ефекту активатора КАТФ - каналів. Однак і за таких умов мембрана ГМК сечоводу залишалась деполяризованою на 4,3 ± 1,6 мВ (n=5, p < 0,05). Активатор КАТФ - каналів (0,1 - 1 мкмоль) за умов гіперкалієвої контрактури пригнічував амплітуду тонічного скорочення до його вихідної величини, однак для додаткового розслаблення необхідне збільшення концентрації ПФ - 5 до 10 - 20 ммоль (рис.4).

Таким чином, встановлено, що за умов гіперкалієвої контрактури ГМК смужок сечоводу, яка модельно відображає патологічний стан (порушення уродинаміки), формується тонічна компонента скорочення. Дія ПФ - 5 активатора КАТФ - каналів відновлює нормальну фізіологічну функцію міоцитів, викликає їх релаксуючий ефект. Зменшення тонусу ізольованих смужок сечоводу через активацію КАТФ - каналів залежить від вираженості патологічно змодельованої контрактури та наступної конценрації ПФ - 5 в тестуючому розчині.

Для подальшого аналізу мембранотропної дії ПФ - 5, що зумовлено його впливом на амплітуду, тривалість ПД і пригнічення кальцієвих осциляцій на їх плато була проведена серія дослідів із активатором Ca2+- каналів Вay - К 8644. При цьому, виходили із того, (Imaizumi, 1989), що активація відповідних каналів призводить до генерації піків на плато ПД, як і навпаки, їх блокування - до пригнічення.

Як видно із рис. 5, додавання до розчину Кребса 0,1 - 1,0 мкмоль Bay К 8644 призводило до розвитку деполяризації ГМК, яка на 8-10 хв. дії складала 3,4 ± 0,9 мВ (n=6, p < 0,05). За таких умов наступала генерація спонтанних ПД з наступним вірогідним збільшенням тривалості плато ПД .

Як видно із отриманого експериментального матеріалу, (рис. 6 Б, В) найбільш чутливим до дії ПФ - 5 виявилося надходження Са2+ в ГМК через потенціалозалежні калієві канали L-типу.

Повне пригнічення викликаних Вау К 8644 спонтанних ПД наступало під впливом більш високих концентрацій (1 -10 мкмоль) ПФ - 5 активатора КАТФ - каналів мембрани ГМК (рис. 6 Б, В). Зауважимо, що у всіх без винятку дослідах спостерігався конкуруючий ефект за тривалість реполяризаційної фази плато ПД між ПФ - 5 і Вay К 8644. Крім того, активатор КАТФ - чутливих каналів викликав гіперполяризацію плазматичної мембрани гладеньких м'язів сечоводу, її величина складала 2,7 ± 0,8 мВ (n=7, p < 0,05).

Отже, ініціація спонтанної електричної і скоротливої активностей і модуляція кінетичних характеристик ПД гладеньких м'язів сечоводу під впливом Вау К 8644 в експериментальних умовах в певній мірі аналогічна тій, що спостерігається за дії збуджуючих нейромеідаторів. На тлі дії активатора кальцієвих каналів внесення ПФ - 5 (0,1 - 10 мкмоль) в розчин Кребса викликало дозо-залежну гіперполяризацію 2,8 ± 0,6 мВ (n=7, p < 0,05), пригнічення спонтанної активності, зменшення тривалості ПД і частоти піків на плато ПД.

Слід зауважити, що у всіх без винятку дослідах спостерігався конкуруючий ефект за тривалість реполяризаційної фази плато ПД між ПФ - 5 і Вay К 8644. Крім того, активатор КАТФ - чутливих каналів викликав гіперполяризацію плазматичної мембрани гладеньких м'язів сечоводу, її величина складала 2,7 ± 0,8 мВ (n=7, p < 0,05).

Результати порівняльного пригнічуючого впливу ПФ - 5 на ПД, викликаного електричним подразненням ізольованих сегментів сечоводу і ПД зініційовані таким же подразненням, але в присутності Вay К 8644, засвідчують, що пригнічуюча дія активатора АТФ - залежних калієвих каналів на гладенькі м'язи сечоводу залежить від шляхів поступання іонів кальцію в клітину.

Якщо виходити із того, що осциляції на плато ПД за умов гіперкалієвої деполяризації інтактних препаратів сечоводу також обумовлені поступанням іонів кальцію через потенціалозалежні кальцієві канали мембрани ГМК, то пригнічення цих осциляцій свідчить на користь функціонування механізму їх генерації і селективності пригнічуючого впливу ПФ - 5 на даний механізм. Отже, потенціалозалежне надходження іонів Са в міоцити ГМК істотно залежить від викликаної ПФ - 5 активації КАТФ - каналів гладеньких м'язів сечоводу ссавців.

На відміну від отриманих результатів , які представлені в попередніх серіях, що демонтрують конкурентну боротьбу за місця причетні до формування скоротливої активності між ПФ - 5 і глібенкламідом (блокатором КАТФ - каналів), зовсім протилежний ефект проявлявся з використанням специфічного блокатора потенціалозалежних калієвих каналів - тетраетиламонію (ТЕА). Амплітуда електрично викликаних скорочень при перфузії ТЕА (5 ммоль) збільшувалась на 140 ± 10,9% , а їх тривалість на 142,3 ± 9,3%, а тривалість ПД на 283,2 ± 34,3% (n=7, p < 0,01). На тлі дії ТЕА перфузія смужок сечоводу тестуючим розчином, що вміщував (1 - 10мкмоль) ПФ - 5 не викликав вирогідних змін механічної активності міоцитів сечоводу (129,9 ± 10,3%, проти 140,5 ± 10,9% n=7, p < 0,1). Тривалість ПД при дії ТЕА зростала на 283,2 ± 34,3% n=7, p < 0,01). За таких умов додавання до тестуючого розчину ПФ - 5 (1 мкмоль) не призводило до вирогідних змін в тривалості низхідної фази плато ПД (217,6 ± 29,3% проти 283,2±34,3% n=7, p < 0,5), що свідчить про відсутність між ними конкурентної дії в реалізації викликаних реакцій ГМК сечоводу ссавців.

Підсумовуючи викладене, слід зауважити, що активатор КАТФ - каналів ПФ - 5 володіє вираженою релаксуючою активністю і потенційно пригнічує скоротливу і електричну активність ізольованих смужок сечоводу людини і морської свинки як за нормальних умов, так і при експериментальному моделюванні KCl - індукованої гіперскоротливості гладеньких м'язів. Уретероселективний спазмолітичний вплив речовини ПФ - 5 обумовлений залученням його до активації калієвих каналів, детермінованих АТФ - азною активністю.

Таким чином, згідно з отриманими результатами ПФ - 5 володіє достатнім бінарним модулюючим впливом на ПД гладеньких м'язів сечоводу людини і морської свинки, пригнічуючи надходження екстрацелюлярного кальцію в ГМК через потенціалозалежні кальцієві канали L - типу (викликаючи їх пряме блокування) і викликаючи активацію АТФ -залежних калієвих каналів, регламентуючи таким чином тривалість низхідної фази плато ПД. Активатор калієвих АТФ - залежних каналів, речовина ПФ - 5 має конкурентну здатність за одні і тіж субодиниці каналу, що і його блокатор - глібенкламід, тоді як блокатор потенціалзалежних К+- каналів ТЕА в такій конкурентній «боротьбі» не був ефективний. Отримані результати дають підставу для ідентифікації речовини ПФ - 5 як потужного активатора АТФ - залежних калієвих каналів, що може знайти своє використання в патології сечовивідної системи. Його ефективність при уропатії з аутоімунною компонентою представлена в подальшому викладі.

Антитілоіндуковані зміни потенціалів дії, фазно - тонічного скороченя гладеньких м'язів сечоводу. Для аналізу імунних характеристик сироваток було отримано 20 серій крові від хворих (14 - жіночої статі і 6 - чоловічої, віком від 40 до 60 років), що страждали хронічним обструктивним пієлонефритом на стадії загострення. Для контрольних дослідів використані сироватки здорових донорів (4 віком 18 років та 3 - 40 - 60 років).

Встановлено, що в реакції пасивної гемаглютинації за Бойденом сироватки отримані від хворих (8 серій) реагували з гомологічним антигеном (тканина сечоводу людини) при розведенні 1: 20 - 1: 100, а сироватки донорів не більше 1 : 10. Результати імуноферментного аналізу методом ELISA серологічних характеристик сироваток (12 серій) представлені в таблиці 1.

Таблиця 1. Рівні аутоантитіл проти антигенів, виділених з органів людини і морської свинки у сироватках пацієнтів і здорових донорів (розведення 1:100) (М ± м);

Примітка *- результат вирогідний.

Найбільші рівні аутоантитіл в досліджуваних сироватках хворих спостерігалися до ниркової тканини 0,433 ± 0,031, а найменші - до гомогенату скелетних м'язів 0,128 ± 0,027 у.о. Досить висока концентрація аутоантитіл була виявлена до антигенів гладеньком'язової тканини сечоводу людини і морської свинки, яка становила відповідно 0,361 ± 0,021 і 0,286 ± 0,035 у.о.

При з'ясуванні вірогідних місць зв'язування аутоантитіл, виділених із сироватки крові хворих на хронічний пієлонефрит із скоротливими білками міоцитів сечоводу в імуноблотингу до лізату тканини сечоводу було встановлено, що основними класами антигенів є білки з молекулярною масою від 30 до 205 кД. У пацієнтів виявлено аутоантитіла до білків 205 кД (30%), 100-115 кД (15%), 40 кД (80%), 30-35 кД (50%). Як вважають (Neumann, 1990), основна молекулярна маса білків, що формують скоротливий апарат м'язів, знаходиться в межах 40 - 49 кД і включають актин, а 190 - 205 кД - важкі ланцюги міозину.

Отже, досліджувані сироватки пацієнтів хворих на обструктивний пієлонефрит на стадії загострення вміщували в своєму складі антитіла, які реагували із білками, що є складовою актинових і міозинових ланцюгів скоротливих білків.

Встановлено, що перфузія гладеньком'язових смужок сечоводу ссавців розчином Кребса з добавкою аутоантитіл (гама-глобуліновою фракцією) 0,1 - 1 мг білку/мл. виділеною із сироватки крові хворих на обструктивний пієлонефрит, вже на 5 хвилині дії викликала посилення амплітуди ізометричних скорочень на 15-35% від вихідної величини.

На тлі зростаючої частоти і амплітуди ізометричних спонтанних скорочень за дії антитіл посилювалась тонічна напруга (рис.7). Її величина за одних і тих самих часових параметрів (10-15 хв) коливалася в межах від 10 до 35% (30,1 ± 4,5% n=12, p < 0,01). Максимальні зміни тонічного напруження, супроводжувалися зростанням частоти спонтанних скорочень при дії антитіл на ГМК сечоводу та розвитком пролонгованої деполяризації мембрани міоцитів, що складала 3,1 ± 0,6 мВ (n = 10, p < 0,05).

Додавання до тестуючого розчину, що вміщував антитіла, модулятора КАТФ - каналів - ПФ - 5 (0,1 - 1,0 мкмоль) вже на 3 - 5 хв. дії викликало зниження амплітуди і частоти фазних скорочень, а його тонічна компонента на 5 - 6 хв. дії досягала вихідних величин з подальшим розвитком релаксуючого ефекту активатора КАТФ - каналів.

Викликані ефекти дії антитіл на скоротливу спонтанну активність вирогідно різнилися від контрольних величин із гама - глобуліновою фракцією, виділеною із сироватки донорів (0,1 - 1,0 мг білку /мл). Хроноінотропний ефект був короткочасним (3 - 5 хв.) і реєстровані зміни електричної і скоротливої активності ГМК сечоводу не перевищували 3 - 10% від вихідних величин.

Антитілоіндуковані зміни електричної і скоротливої активності міоцитів сечоводу людини і морської свинки спостерігалися і при викликаній ритмічній стимуляції. Результати дослідження подані на рис. 8

Вірогідні зміни амплітуди фазних скорочень і тривалості ПД при ритмічній стимуляції наступали на 3 - 5 хв. дії антитіл. Так, на 10 хв. дії антитіл тривалість ПД складала 2,12 ± 0,38 с., проти 1,33 ± 0,1 с. (n = 8, p < 0,01). Амплітуда ПД збільшувалась на 2 - 3 мВ, а фазних скорочень - в 1,5 - 2,5 рази. Слід відзначити, що при формуванні потенціалів дії ГМК при перфузії антитілами зростала не лише їх амплітуда, але і кількість генерованих на них осциляцій, що свідчить про посилений антитілоіндукований вхід Са2+ в міоцити при збудженні.

Однак, отримані антитілоіндуковані зміни електричної і скоротливої активності не висвітлюють їх істинного впливу, оскільки при формуванні реакції антиген (міоцити сечоводу) - антитіло вивільняються біологічно-активні речовини, зокрема гістамін (Гущин, 2001). Останній є активатором Na+ - Са2+ іонних каналів плазматичної мембрани міоцитів ( Гущин, 1999). Але, як показали результати дослідження на ізольованих смужках сечоводу людини, антитіла викликали посилення реєструючих параметрів (амплітуди скорочень і тривалості ПД) як за умов блокування вивільнення гістаміну клемастином, так і при його штучному вивільненні речовиною 4880. Остання, як відомо (Гущин, 1978), вивільняє більше 90 % гістаміну, що міститься в клітинах протягом кількох секунд.

Таким чином, аналіз отриманого матеріалу переконує в тому, що головною ланкою в складній реакції антиген - антитіло є все ж таки безпосередня дія антитіл на мембрану гладеньком'язових клітин сечоводу людини і морської свинки, яка призводить до конфігураційної зміни їх антигенних детермінант, зачіпаючи при цьому системи іонних каналів, відповідальних за активацію вхідного струму під час генерації ПД.

При дослідженні дії анитіл на ГМК за умов інактивації Na+ - Са2+ іонних каналів шляхом тривалої калієвої деполяризації міоцитів сечоводу, останні теж викликали стимулюючий ефект на скоротливу активність. Результати подано на рис. 9

Як видно із представленого ілюстративного матеріалу одного із даної серії дослідів, заміна нормального розчину на гіперкалієвий призводила до виникнення скоротливої реакції м'язів сечоводу, яка складалася із фазного та тонічного компоненту. На тлі розвитку тонічного скорочення, викликаного КСl антитіла викликали повільне наростання скорочення ГМК в гіперкалієвому розчині (30 ммоль КСl). Однак амплітуда тонічного напруження була значно меншою, ніж в нормальному розчині і складала відповідно 23,2 ± 2,6% проти 41,5 ± 6,1% (n=9, p < 0,05). Наявність скоротливої реакції гладеньких м'язів за дії антитіл в гіперкалієвому розчині свідчить про те, що антитілоіндукована тонічна компонента не обумовлена деполяризацією плазматичної мембрани гладеньких м'язів сечоводу. Додавання до тестуючого розчину активатора КАТФ - каналів, що вміщував антитіла, вже через 2 - 3 хв. викликало зменшення амплітуди тонічної компоненти скорочення гладеньких м'язів сечоводу з подальшою релаксацією. Попередня перфузія м'зових смужок сечоводу речовиною ПФ - 5 вірогідно запобігала формуванню антитілоіндукованого тонічного напруження гладеньких м'язів, хоча тенденція до його розвитку зберігалася. Якщо тонічне напруження гладеньких м'язів за дії антитіл складало 41,5 ± 6,1% від фазного скорочення, то за умов їх поєднаної перфузії з активатором калієвих каналів її величина складала лише 10,6 ± 4,6% (n=8, p < 0,05) від амплітуди фазних скорочень, тобто спостерігався виражений антагоністичний ефект в діях ПФ - 5 і антитіл на скоротливу активність міоцитів сечоводу. Збільшення концентрації ПФ - 5 до 10 ммоль усувало пролонговану антитілоіндуковану тонічну компоненту скорочення гладеньких м'язів.

Збільшення концентрації ПФ - 5 в омиваючому розчині до 20 мкмоль посилювало його міорелаксуючу дію в гіперкалієвому розчині не лише при 15, 25 ммоль, але і при 60 ммоль КСl в тестуючому розчині. Слід відзначити, що формування тривалого тонічного скорочення, зініційованого антитілами і його пригнічення ПФ - 5, засвідчує про спільну для них мембранну антигенну детермінанту, якою може виступати рецепторна частина КАТФ - активованих каналів. Невиключено, що антитіла викликають блокування КАТФ - каналів, тим самим збільшують тривалість збудливої реакції детермінованої потенціалом дії. Окрім того, антитіла додатково до посилення потенціалозалежного надходження Са2+в клітину сприяли його вивільненню із внутрішньоклітинних депо. Це підтверджується тим, що антитіла не викликали визваної скоротливої реакції смужок сечоводу після кофеїніндукованого вивільнення кальцію із структур саркоплазматичного ретикулуму. Окрім того, антитіла ініціювали скорочення і за умов відсутності іонів кальцію в омиваючому розчині, що вміщував додатково і 0,5 ммоль ЕГТА. Слід наголосити, що кофеїніндуковане скорочення було вираженішим за амплітудою, тривалістю та стартовим часом розвитку ніж за умов дії антитіл.

Таким чином, представлені результати і їх аналіз свідчать про те, що досліджуваний новий фторвмісний активатор АТФ - залежних калієвих каналів - ПФ - 5 має виражену міорелаксуючу дію на гладенькі м'язи сечоводу людини і морської свинки. Він пригнічує фазно - тонічне скорочення, зменшує амплітуду і тривалість потенціалів дії, активуючи КАТФ - канали та пригнічуючи кальцієві канали L - типу, запобігає антитілоіндукованому формуванню фазно - тонічного скороченя ізольованих смужок сечоводу людини і морської свинки. Отриманий антитілозахисний ефект активатора КАТФ - каналів виявляється при певних дозах ПФ - 5. Такими дозами препарату слід вважати 1 - 10 мкмоль, при яких дозо - залежно формується його релаксуюча дія на ГМК сечоводу.

Експериментально засвідчена ефективність нового фторвмісного активатора АТФ -залежних калієвих каналів може в перспективі мати практичне значення для корегуючого впливу на ГМК при порушеннях уродинаміки через зміну скоротливої активності гладенько'язових клітин сечоводу. Окрім того, наявність антитільної компоненти при уропатіях може викликати додаткову міотропну дію на гладеньком'язові клітини сечоводу, що слід було б враховувати в лікарській практиці. Новий фторвмісний аналог пінацидилу - речовина ПФ - 5 є модулятором скоротливої активності ГМК сечоводу ссавців в дію якого залучений бінарний ефект: активація АТФ - залежних калієвих каналів і пригнічення потенціалокерованих кальцієвих L - типу каналів плазматичної мембрани міоцитів.

Висновки

У дисертаційній роботі, з використанням методики одинарного і подвійного сахарозного ізолятора для відведення електричної і реєстрації скоротливої активності ізольованих смужок гладеньких м'язів сечоводу у людини і морської свинки проведені дослідження релаксуючого впливу нового активатора КАТФ - каналів - фторвмісної речовини ПФ - 5, похідної гуанідину, що експериментально обґрунтовує можливість її застосування для корекції уродинаміки за наявності аутоімунної компоненти.

1. Експериментально ідентифіковано функціональну активність КАТФ - каналів в гладеньких м'язах сечоводу людини і морської свинки і їх детермінуючий вплив на амплітуду і тривалість потенціалів дії, фазну і тонічну компоненту ізометричних скорочень.

2. Фторвмісний аналог пінацидилу, речовина ПФ - 5, концентраційно-залежним чином зменшує амплітуду фазних скорочень і індукованої гіперкалієвим розчином (15, 25, 60 ммоль/л КСl) тонічної напруги гладеньком'язових смужок сечоводу людини і тварин.

3. Активатор КАТФ - каналів ПФ - 5 викликає блокуючий вплив на функціонування Са2+- каналів L - типу плазматичної мембрани міоцитів гладеньких м'язів сечоводу, спричиняє гіперполяризацію, яка супроводжується розвитком м'язового розслаблення. За таких умов наступає зменшення проникності плазматичної мембрани (збільшення вхідного опору), що призводить до збільшення амплітуди електротонічних потенціалів на 31 ± 3,5%.

4. В сироватці крові хворих на обструктивний пієлонефрит методом імуноферментного аналізу виявлено високу концентрацію аутоантитіл, що реагують з гомологічним (тканина сечоводу людини) і гетерологічним (тканина сечоводу морської свинки) антитілами (відповідно 0,361 ± 0,021 і 0,286 ± 0,035 - здорові донори- 0,153 ± 0,027 і 0,098 ± 0,006).

5. Перфузія ізольованих смужок сечоводу сироваткою крові в концентрації 0,1- 1,0 мг білку на 1 мл викликала деполяризацію плазматичної мембрани, збільшення тривалості генерованих потенціалів дії, вивільнення іонів кальцію із внутрішньоклітинних депо, що призводило до розвитку позитивного хроно - інотропного ефекту, збільшення амплітуди фазних скорочень (на 35,6 ± 7,2%) і наростання їх тонічної компоненти (на 12,9 ± 3,6%).

6. Блокування вивільнення гістаміну, а також його попередня ініціація не запобігали розвитку активуючого впливу аутоантитіл на формування тонічної компоненти і фазних скорочень та осциляцій на потенціалах дії і їх тривалості, що свідчить про їх безпосередню мембранотропну дію на гладенькі м'язи сечоводу.

7. Активація речовиною ПФ - 5 калієвих АТФ - залежних каналів зменшувала стимулюючий ефект аутоантитіл на розвиток фазних скорочень і запобігала формуванню тонічного напруження ізольованих смужок гладеньких м'язів сечоводу, що може мати практичне значення для фармакологічного розслаблення при порушенні прохідності сечоводу.

8. Отримані результати свідчать про високу вибіркову (модулюючу) ефективність нового активатора АТФ - залежних К+- каналів з метою його використання як протекторного засобу для корегуючого впливу на уродинаміку при захворюваннях сечовивідної системи детермінованих аутоімунними процесами.

сечовід активатор калієвий аутоімунний

Перелік робіт, опублікованих за темою дисертації

1. Янчій Р.І., Джуран Б.В., Пелюх П.Ф., Бідзіля Ю.П. Особливості електричної і скоротливої активності гладеньких м'язів сечоводу людини при гострому обструктивному пієлонефриті // Клінічна та експериментальна патологія Чернівці. - 2004. - Т.ІІІ, №:2 - С.418 - 419., (Здобувачем особисто виконано основну частину експериментальних досліджень, самостійно провів статистичку обробку отриманих результатів, приймав участь у написанні статті).

2. R.I.Yanchiy, B.V.Dzhuran, P.F. Pelukh. Elektromechanical coupling in smooth muscles of human ureter at pyelonephritis in conditions of Ca 2+ and K+ATP channel modulators // Annales Universitatis Mariae Curie - Sklodowska. Lublin. - 2004. - VOL. XVII, 33. - Р. 297 - 299. (Здобувач самостійно провів експериментальні дослідження та здійснив статистичну обробку отриманих даних, приймав участь у обговоренні та написанні статті).

3. Янчий Р.И., Джуран Б.В., Филлипов И.Б., Владимирова И.А. Угнетающее влияние активатора АТФ - зависимых калиевых каналов флокалина на электрическую и сократительную активность гладких мышц мочеточника морской свинки // Нейрофизиология. -2005. - Т.37, № 5/6. С. 403 - 409. (Здобувач самостійно зробив експериментальну частину дослідження, провів аналіз літературних даних, взяв участь у написання статті).

4. Джуран Б.В. Антитілотропні фактори впливу на електричну і скоротливу здатність гладеньких м'язів сечоводу людини // Збірник наукових статей,- Запоріжжя. - 2007. - Вип. XIX, Т.2 - С.273 - 278.

5. Джуран Б.В. Міотропна дія нових фтормісних активаторів КАТФ - каналів на гладенькі м'язи сечоводу деяких ссавців // Фундаментальна медицина - практиці охорони здоров'я. Київ. - 2008. - Т.17, №5. - С.134 -Джуран Б.В. Дослідження дії нового активатора калієвих АТФ-залежних каналів на електричну і скоротливу активність сечоводу людини при гострому обструктивному пієлонефриті // Актуальні питання біології та медицини. Луганськ. - 2004. - С. - 29.

1. Джуран Б.В., Пелюх П.Ф., Янчий Р.И. Влияние нового активатора КАТФ-каналов и убретида на электрофизиологические свойства мочеточника человека // Мембранные и молекулярные механизмы регуляции функций гладких мышц. Томск. - 2004. - С. 73 - 75. (Дисертант самостійно провів експериментальні дослідження та самостійно провів статистичну обробку отриманих результатів).

2. Джуран Б.В. Пригнічуюча дія нового активатора аденотрифосфатчутливих калієвих каналів на антитілоіндуковане скорочення гліденьких м'язів сечоводу. // Фізіол. журн. - 2006 - Т.52, №3. - С.135.

3. Dzhuran B.V., Yanchiy R.I., Bidzilya Y.P. Activation of ATP-dependent K+ channels of mammalion ureteric smooth muscles by flokalin.// The 5 th International Congress of Pathophysiology, June 28 - Jule 1, 2006.- Bejging, China. // Chinese Jornal of Pathophysiology //- 2006. - Vol. 22 (13). - P. 505. (Дисертант самостійно виконав всі експериментальні дослідження та здійснив статистичну обробку отриманих даних).

5. Джуран Б.В., Янчій Р.І., Бідзіля Ю.П., Сердюк О.М. Вплив активаторів КАТФ - каналів на електрофізіологічні властивості сечоводу людини і ссавців при аутоімунномі ураженні.// XIV Міжнародна конференція «Інформотерапія: практичні аспекти та практичне застосування» Київ. - 2008. - С. - 19. (Здобувач самостійно виконав експериментальну частину дослідження, провів аналіз літературних даних, приймав участь у написанні та підготуванні до друку).

Размещено на Allbest.ru