Размещено на http://www.allbest.ru/

Міністерство охорони здоров'я України

Донецький Національний Медичний Університет

ім. М. Горького

Грінченко Євген Миколайович

УДК 612.453:612.621.31

Аналіз механізмів внутрішньоклітинного переносу сигналу естрадіолу в корі надниркових залоз за умов патології та норми

14.03.04 - патологічна фізіологія

АВТОРЕФЕРАТ

дисертації на здобуття наукового ступеня

кандидата медичних наук

Донецьк - 2009

Дисертацією є рукопис

Робота виконана у ДУ "Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України"

Науковий керівник: доктор біологічних наук, с.н.с. Ковзун Олена Ігорівна, керівник лабораторії гормональної регуляції обміну речовин ДУ "Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України".

кора наднирковий залоза людина

Офіційні опоненти: доктор медичних наук, професор, член-кореспондент АМН України Єльський Віктор Миколайович, завідувач кафедри патологічної фізіології Донецького національного медичного університету ім. М. Горького МОЗ України;

доктор медичних наук, професор Ткачук Світлана Сергіївна, завідуюча кафедри фізіології Буковинського державного медичного університету МОЗ України, м. Чернівці

Захист відбудеться “22” січня 2010 року о 10⁰⁰ годині на засіданні спеціалізованої вченої ради Д 11.600.02 при Донецькому національному медичному університеті ім. М. Горького (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16).

З дисертацією можна ознайомитися у бібліотеці Донецького національного медичного університету ім. М. Горького (83003, м. Донецьк, пр. Ілліча, 16).

Автореферат розісланий “10” листопада 2009 року.

Вчений секретар спеціалізованої вченої ради, доктор медичних наук,

Доцент М.В. Єрмолаєва

Загальна характеристика роботи

Актуальність проблеми. До недавнього часу кору надниркових залоз не відносили до органів-мішеней естрогенів, але це уявлення почало змінюватись після того, як у приматів були знайдені рецептори естрогенів в тканині кори надниркових залоз (Montanaro D. et al., 2005, de Cremoux P. et al., 2008). Досліджувалась роль естрогенів та рецепторів естрогенів в регуляції росту клітин лінії H295R (адренокортикальна пухлина людини) (Montanaro D. et al., 2005), існують дані про безпосередній вплив естрогенів in vitro та in vivo на утворення кортикостероїдів (Микоша А.С. и др., 2003). Відомо, що під впливом АКТГ в тканині залози відбувається накопичення cAMP та активація протеїнкінази А (Микоша А.С., Тронько Н.Д., 2004), що обумовлює підвищення швидкості лімітуючої реакції утворення стероїдних гормонів - відщеплення бокового ланцюга холестерину. В останні роки при аналізі механізму впливу 17-естрадіолу на тканини (окрім надниркових залоз) крім вивчення геномних ефектів розглядається також можливість використовування даним естрогеном cAMP-залежної сигнальної системи переносу сигналів (Rosner W. et al., 1999; Moriarty K. et al., 2006). Велику увагу у вивченні механізмів впливу естрогенів привернула протеїнкіназа С, як один з важливіших ферментів, що бере участь в регуляції проліферації та онкогенезу, а також є інтегральною частиною в механізмах передачі клітинного сигналу, що опосередковує дію агоністів, кожен з яких має на тканину свій специфічний вплив. Зміни в її активності, можливо, лежать в основі патогенезу пухлин надниркових залоз (Sil P. et al., 1998; Slawik M. et al., 2004; Ye P. et al., 2007).

Протеїнкіназа C, протеїнкіназа A, фосфоліпідні месенджери визначають функціональну активність клітин, їх здатність до поділу і диференціації. Ці ж сполуки визначають виникнення апоптичних змін в клітинах. Завершальним етапом переносу сигналів в клітинах ендокринних залоз є запуск секреторного процесу, ділення клітин або апоптозу (Winczyk K., 2008). Апоптоз є генетично запрограмованим процесом загибелі клітин, фізіологічним шляхом їх знищення, за допомогою якого видаляється небажана популяція клітин у відповідь на певний сигнал або систему сигналів. При цьому слід відрізняти апоптичні явища від звичайного некрозу. Якщо некроз характеризується тотальним лізисом клітинних структур (мембран в першу чергу) та органел, при апоптозі активуються специфічні ендонуклеази, які діють у чітко запрограмованій послідовності. Крім того, некроз має незворотний характер, в той час як апоптичні процеси до деяких етапів можна заблокувати (Blankenberg F., 2008).

Незважаючи на те, що сам факт впливу естрогенів на функцію надниркових залоз було виявлено давно, механізм реалізації цього впливу майже не досліджений. Крім того, дані про механізм впливу естрогенів в органах репродуктивної системи не можна механічно переносити на інші тканини та клітини. Механізм впливу естрадіолу безперечно може мати специфічні особливості у різних тканинах або повністю відрізнятися. Аналіз механізмів реалізації ефектів естрадіолу у надниркових залозах за умов патології та норми становить мету наших досліджень.

Зв'язок роботи з науковими програмами, планами, темами. Робота проводилась в рамках наукової тематики лабораторії гормональної регуляції обміну речовин відділу патофізіології ДУ "Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України" (№ держреєстрації 0101U000618, тема 415 "Аналіз біохімічних механізмів перенесення регуляторних сигналів у клітинах кори надниркових залоз тварин та пухлин надниркових залоз людини" 2001-2004 рр.; № держреєстрації 0105U000732, тема 440 "Пострецепторна регуляція функції надниркових залоз різними модуляторами в умовах норми та патології" 2005-2007 рр.). Здобувач є співвиконавцем цих тем.

Мета дослідження. Дослідити участь естрогенів в регуляції метаболічних процесів та стероїдогенезу в адренокортикоцитах та охарактеризувати месенджерні механізми, що опосередковують стероїдогенні ефекти естрадіолу в тканині кори надниркових залоз людини та корі надниркових залоз тварин за умов патології та норми.

Для реалізації поставленої мети необхідно було вирішити такі завдання:

1. Дослідити вплив естрадіолу на синтез кортикостероїдних гормонів корою надниркових залоз людини in vitro та тварин in vitro та in vivo.

2. Дослідити зміни фосфоліпідного складу мембран адренокортикоцитів внаслідок дії естрогенів.

3. Визначити зміни вмісту циклічних нуклеотидів в корі надниркових залоз людини під впливом 17-естрадіолу.

4. Вивчити роль cAMP-залежної протеїнкінази А та протеїнкінази С у реалізації ефектів естрогенів в корі надниркових залоз.

5. Дослідити зміни експресії мРНК білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу (StAR) та десмолази в корі надниркових залоз людини під впливом 17в-естрадіолу.

6. Вивчити вплив естрадіолу in vivo на вміст РНК та ДНК в корі надниркових залоз, аденогіпофізі і гіпоталамусі щурів.

7. Вивчити вплив 17-естрадіолу на експресію мРНК проапоптичного білка Вах і рівень фрагментації ДНК в корі надниркових залоз.

Об'єкт дослідження: регуляція синтезу кортикостероїдів в корі надниркових залоз естрогенами. Внутрішньоклітинні сигнальні системи, залучені до перенесення сигналів естрадіолу в корі надниркових залоз.

Предмет дослідження: месенджерні системи перенесення сигналів в клітинах кори надниркових залоз: мембранні фосфоліпіди, циклічні нуклеотиди, протеїнкінази А та С.

Методи дослідження: для досягнення мети та виконання завдань, поставлених у роботі, було використано такі методи: радіоізотопні методи, тонкошарову хроматографію, екстракцію нуклеїнових кислот, полімеразну ланцюгову реакцію, електрофорез ДНК та білків в агарозному гелі, визначеня активності ферментів із використанням специфічних субстратів, статистичні методи аналізу.

Наукова новизна одержаних результатів. В роботі вперше визначено вплив 17-естрадіолу на стероїдогенез в адренокортикоцитах людини in vitro. Встановлено кількісні зміни фосфоліпідного складу кори надниркових залоз людини під впливом естрадіолу. Доведено участь cAMP-залежної сигнальної системи вторинних месенджерів в реалізації ефектів естрадіолу у корі надниркових залоз людини та тварин.

Вивчено зміни активності протеїнкінази С в адренокортикоцитах під впливом естрадіолу. Проаналізовано зміну експресії мРНК білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу (StAR) та десмолази в корі надниркових залоз людини під впливом 17в-естрадіолу. Вивчено вплив естрадіолу in vivo на вміст РНК та ДНК в корі надниркових залоз, аденогіпофізі і гіпоталамусі щурів.

Встановлено антиапоптичну дію 17-естрадіолу в адренокортикоцитах.

Практичне значення одержаних результатів. В роботі доповнені та розширені сучасні уявлення про біологічну роль естрогенів. Окрім давно відомого впливу на органи жіночої статевої системи, встановлено їх активуючий вплив на кортикостероїдогенез та показані механізми цієї активації. Ці ефекти можуть розглядатись як одна з можливостей посилення адаптаційних характеристик жіночого організму до несприятливих факторів зовнішнього середовища.

Окрім того, даний час відзначається інтенсивними спробами залучити в коло терапевтичних протипухлинних засобів препарати, що діють ні рівні месенджерних систем, причетних, як тепер стало відомо, до трансформації клітин (наприклад, сурамін, вортманін, бріостатин). Робота дозволяє певною мірою з'ясувати роль різних систем внутришньоклітинних вторинних месенджерів в перенесенні сигналу естрадіолу в корі надниркових залоз та розширити розуміння сукупності негеномних механізмів, за якими естрогени можуть чинити контроль метаболічних процесів в адренокортикальній тканині. Оскільки естрогени широко використовуються зараз для лікування раку простати у чоловіків, дослідження ефектів естрадіолу на інтактних і орхіектомованих самцях щурів важливе для можливої екстраполяції на зміни функції гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальної системи у людини.

Матеріали дисертаційної роботи впроваджено у науково-дослідний та навчальний процеси кафедри ендокринології Національної медичної академії післядипломної освіти імені П.Л. Шупика, м. Київ, кафедри патологічної фізіології Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, кафедри біологічної хімії Донецького національного медичного університету ім. М. Горького, кафедри патологічної фізіології Запорізького державного медичного університету.

Особистий внесок здобувача. Всі результати отримано здобувачем особисто або за безпосередньої участі. Робота виконана автором відповідно до програми наукових досліджень, спланованих, проведених і узагальнених протягом 2001 - 2008 рр. в лабораторії гормональної регуляції обміну речовин Державної установи "Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України". Дисертантом особисто обґрунтовано концепцію роботи, здійснено пошук та аналіз літературних джерел, розроблено методичні підходи. Текст дисертаційної роботи написано здобувачем особисто. Головні завдання роботи, а також наукові положення дисертації і висновки сформульовано разом з науковим керівником д.б.н. О.І. Ковзун. Співучасть співробітників відділу патофізіології у виконанні роботи відображено у спільних публікаціях.

Апробація результатів дисертації. Дисертаційну роботу було апробовано на засіданні апробаційної комісії з попереднього захисту кандидатських і докторських дисертацій ДУ "Інститут ендокринології та обміну речовин ім. В.П. Комісаренка АМН України" (липень, 2009). Головні положення дисертаційної роботи було представлено на IX Українському біохімічному з'їзді (Харків, 2006), VII з'їзді ендокринологів України (Київ 2007), V, VI конференціях імені Я. Парнаса (Київ, 2005; Краків, Республіка Польща, 2007), IV, V Національних конгресах патофізіологів України (Чернівці, 2004; Запоріжжя, 2008).

Публікації. За матеріалами дисертації опубліковано 11 робіт, з яких 5 статей у фахових наукових журналах, 6 тез доповідей у матеріалах наукових з'їздів та конференцій.

Структура та обсяг дисертації. Дисертацію викладено на 126 сторінках друкованого тексту. Робота складається із вступу, аналітичного огляду літератури, опису матеріалів та методів досліджень, 5 розділів результатів власних досліджень, аналізу та узагальнення результатів досліджень, висновків, списку використаних джерел, який налічує 241 посилання (25 кирилицею та 216 латиницею). Текст дисертації проілюстровано 2 таблицями та 19 рисунками.

Основний зміст роботи

Матеріали і методи досліджень. Об'єкти дослідження. В дослідах in vitro була використана післяопераційна адренокортикальна тканина, одержана в ході операцій у клініці Інституту ендокринології з приводу різноманітних новоутворень надниркових залоз. Для досліджень відбиралися ділянки візуально незміненої тканини кори надниркових залоз, що межує з пухлинною - "умовно нормальна тканина". У низці досліджень використовували первинну культуру надниркових залоз новонароджених поросят. В дослідах in vivo використовували щурів самців лінії Wistar масою 200 - 250 г (інтактні та орхіектомовані). Орхіектомію здійснювали під ефірним наркозом. В експериментах тварин використовували через 4 тижні після кастрації. Використовували такі експериментальні групи: інтактні тварини, яким вводили сливову олію, інтактні тварини, що отримували естрадіол (естрадіол бензоат "Кoch-Light", Великобританія, розчинений у сливовій олії, у дозі 50 або 100 мкг/тварину протягом трьох діб), орхіектомовані тварини та орхіектомовані, що отримували естрадіол. Тварин декапітували під етаміналовим наркозом (4 мг/100 г маси тіла) через добу після останньої ін'єкції.

Культивування клітин кори надниркових залоз. Надниркові залози новонароджених поросят в асептичних умовах очищали від жирової та сполучної тканин, після чого промивали декілька разів холодним середовищем 199 ("Sigma", США), що містило антибіотики (100 Од бензилпеніциліну натрієвої солі і 100 мкг стрептоміцину сульфату на 1 мл середовища культивування). Тканину надниркових залоз подрібнювали, промивали декілька разів холодним середовищем 199 з антибіотиками і послідовно обробляли по 30 хв на водяній бані при 37 С з постійним перемішуванням: спочатку 0,125 %-ним розчином трипсину (НВО "Віріон", Росія), а відтак 0,1 %-ним розчином колагенази ("Merck", Німеччина). Надосадову суспензію адренокортикоцитів зливали у флакон з холодним середовищем 199, яке містило 10 % сироватки крові великої рогатої худоби (Київський завод медпрепаратів, Україна) та антибіотики, а залишок знову обробляли розчином колагенази. Цю процедуру повторювали 2-3 рази, після чого одержану суспензію промивали декілька разів (центрифугуванням при 600 g на протязі 10 хв) холодним середовищем 199, що містило антибіотики. Після фільтрування одержували суспензію адренокортикоцитів, в якій проводили підрахунок кількості клітин за допомогою камери Горяєва. Суспензію, що містила 1х10⁶ клітин в 1 мл середовища культивування (середовище 199, яке містило 10 % інактивованої нагріванням при 57 С протягом 30 хв сироватки крові великої рогатої худоби і антибіотики) висівали в пробірки. Культивування проводили в термостаті при 37 С зі зміною середовища через 48 годин після розсіву клітин.

Виділення субклітинних фракцій адренокортикоцитів. Адренокортикальну тканину на льоду очищували від жиру, сполучної тканини, залишків мозкового шару, подрібнювали та гомогенізували у гомогенізаторі з тефлоновим товкачиком у 2-3 об'ємах охолодженого буфера, який містив: 0,25 М сахарози, 25 мМ трис-HCl (рН 7,4), 3 мМ MgCl₂, 2 мМ ЕГТА, 0,1 мМ спермідину, 0,1 % тритону Х-100, 0,1 мМ фенілметилсульфонілфториду (ФМСФ). Гомогенат центрифугували при 10 000 g 10 хв для осадження ядер, дебрісу та мітохондрій. Супернатант центрифугували при 100000 g 60 хв для отримання цитозольної фракції та осаду мікросом. Осад мікросом суспендували у невеликій кількості середовища, що містило 100 мМ трис-HCl та 0,25 M сахарози (рН 7,4), та розтирали у скляному гомогенізаторі. Фракції зберігали до використання при 60 С.

Визначення активності протеїнкіназ А та С. Метод оцінки активності ПКС базується на визначенні кількості фосфорильованого нейрограніну - високоспецифічного лужного пептидного субстрату ПКС, який внаслідок фосфорилювання ПКС змінює заряд та рухається в агарозному гелі до аноду (Uchida N., Okamura S., 2000). Нефосфорильований нейрогранін, який використовується як негативний контроль, мігрує до катоду. Активність ПКА визначали за методикою, що базується на зміні напрямку руху в агарозному гелі субстрату кемптиду внаслідок фосфорилювання ПКА (Kemp B. et al., 1977).

Радіоімунологічний метод визначення cAMP та cGMP в тканині кори надниркових залоз. Експерименти проведено на тканинах пухлин надниркових залоз хворих, прооперованих в клініці інституту. Зрізи очищеної кори надниркових залоз вагою 100 мг інкубували в 1 мл середовища 199 (державний завод медичних препаратів, Україна), що містило 20 мМ HEPES (pH 7,4) ("Calbiochem", США) та 2 мг/мл бичачого сироваткового альбуміну ("Serva", Німеччина) при 37 °С та постійному струшуванні. До середовища інкубації додавали спиртовий розчин 17-естрадіолу ("Кoch-Ligth", Велика Британія) в кінцевій концентрації 3,7 х 10^-7 3,7 х 10^-4 М. В контрольні проби додавали відповідну кількість спирту. Час інкубації тривав від 30 хв до 4 год. Після закінчення інкубації зрізи гомогенізували у буфері, який містив 250 мМ сахарози, 25 мМ трис-HCl (рН 7,4) та 4 мМ ЕДТА для запобігання ензиматичної деградації cAMP фосфодиестеразами. Гомогенат кип'ятили протягом 3 хв для коагуляції білків, після чого центрифугували при 7 000 g 5 хв. і визначали рівень cAMP і cGMP в супернатанті, використовуючи радіоімунологічні набори TRK-432 та TRK-500 відповідно ("Amersham", Велика Британія).

Кількісне визначення РНК та ДНК в гомогенатах. Надниркові залози щурів видаляли, очищували на льоду від жиру, сполучної тканини та мозкової речовини. На льоду видаляли аденогіпофізи та гіпоталамуси індивідуальних тварин. Екстракцію нуклеїнових кислот проводили з реагентом TRIZOL (“Sigma”, США) згідно з рекомендаціями виробника. Концентрацію РНК та ДНК визначали на спектрофотометрі “Nanodrop” при довжині хвилі 260 і 280 нм.

Оцінка нативності препаратів РНК на біоаналізаторі Aligent 2100. Виділену РНК аналізували методом електрофорезу на біочіпах NanoChip в біоаналізаторі Aligent 2100 за методикою, що запропонована фірмою виробником.

Кількісне визначення сумарних 11-гідроксикортикостероїдів (11-ОКС) спектрофлуориметричним методом. Кількісне визначення сумарних 11-ОКС проводили флуориметричним мікрометодом (Балашов Ю.Г., 1990).

Екстракція ліпідів та тонкошарова хроматографія фосфоліпідів.

Фрагменти післяопераційної тканини кори надниркових залоз людини, які характеризувалися як "умовно нормальна тканина", інкубували в культуральному середовищі 199 з додаванням спиртового розчину 17-естрадіолу в концентраціях 3,7 х 10^-7 - 3,7 х 10^-4 М протягом 4 годин. В якості контролю використовувалися відповідні об'єми етанолу. Після інкубації з тканини екстрагували ліпіди за методом Bligh (Bligh E., Dyer W., 1959) а потім методом тонкошарової хроматографії за Васьковським (Svetashev V., Vaskovsky V., 1972) фракціонували фосфоліпіди в системі розчинників: хлороформ: метанол: аміак (65:35:5) (1-й напрямок) та хлороформ : ацетон : метанол : оцтова кислота : вода (30: 40:10:10:5) (2-й напрямок). Кількість фосфоліпідів визначали, використовуючи мікрометод з реактивом Васьковського (Vaskovsky V., 1975).

Екстракція ДНК та РНК, визначення експресії мРНК Вах, StAR і десмолази та характеристика фрагментації ДНК в агарозному гелі. З ділянок післяопераційної, візуально незміненої тканини кори надниркових залоз людини (умовно нормальна тканина) готували зрізи (50-100 мг), інкубували протягом 3 годин при 37 С в 1 мл буфера (мМ): 10 Na₂HPO₄, 1 NaН₂PO₄, 130 NaCl, 1,27 MgSO₄, 2 CaCl₂, 20 HEPES (рН 7,4). Використовували солі кваліфікації о.с.ч. ("Merck", Німеччина). До середовища інкубації додавали розчин 17-естрадіолу (Е₂) ("Кoch-Ligth", Велика Британія) в етанолі в кінцевій концентрації 10^-5 та 10^-4 М. В контрольні проби додавали відповідну кількість етанолу.

Реакцію зворотної транскрипції проводили (ампліфікатор - GeneTech фірми "Stuart scientific") в реакційній суміші, що містила: стандартний буфер для полімеразної ланцюгової реакції (ПЛР), 5 мМ хлористого магнію, по 1 мМ всіх дНТФ, інгібітор РНКази (1 од/мкл), зворотну транскриптазу (2,5 од/мкл) ("Sigma", США), суміш випадкових гексамерів (2,5 мкМ) та 1 мкг екстрагованої РНК. Інкубація проводилась за таких умов: 22 °С - 10 хв, 42 °С - 15 хв, 99 °С - 5 хв, 4 °С - 5 хв.

Реакцію полімеразної ланцюгової реакції проводили (ампліфікатор Techgene фірми "Techne") в суміші, що містила: стандартний буфер для ПЛР, 2 мМ хлористого магнію, по 1 мМ всіх дНТФ, 5 од/мкл Taq ДНК полімерази ("Sigma", США), прямий та зворотний праймери до Вах ("Sigma", США), прямий та зворотний праймери до StAR та десмолази ("Sigma", США), по 0,2 мкМ, 5 мкл кДНК, одержаної в результаті реакції зворотної транскрипції. Умови інкубації: (Вах) 94 °С - 45 сек, 53 °С - 45 сек, 72 °С - 1,5 хв, а потім температуру знижували до 4 °С. Кількість циклів становила 30; (StAR) 94 °С - 30 сек, 55 °С - 75 сек, 72 °С - 15 сек, 4 °С. Кількість циклів становила 27; (Десмолаза) 94 °С - 45 сек, 53 °С - 45 сек, 72 °С - 1,5 хв, 4 °С. Кількість циклів становила 30.

Продукти ПЛР аналізували в агарозному гелі (1,7 %), який готували на буфері, що містив: 40 мM трис-ацетат (рН 8,5), 2 мМ ЕДТА (ТАЕ-буфер). У гель додавали бромистий етидій до концентрації 1 мкг/мл. Проби готували, змішуючи розчин проби з розчином бромфенолового синього та сахарози (відповідно 0,025 % та 45 %) на ТАЕ-буфері. Загальний об'єм проби не перевищував 20 мкл. В роботі використовували маркери ДНК - 100-1000 пар основ (п.о.). Тривалість електрофорезу становила 1 год при напрузі 100 мВ. Гелі фотографували в трансілюмінаторі, сканували за допомогою програми "Scion Image" і порівнювали інтенсивність смуг ДНК, одержаної шляхом ампліфікації комплементарної ДНК з контрольної та дослідної тканин.

Статистична обробка результатів. Статистичну обробку результатів проводили, застосовуючи однофакторний дисперсійний аналіз (ANOVA) з використанням F-критерію Фішера, t-крітерій Стьюдента, а також непараметричний U-тест Вілкоксона-Манна-Уїтні.

Результати власних досліджень. Вплив 17-естрадіолу на рівень синтезу кортикостероїдів та на зміни фосфоліпідного складу мембран адренокортикоцитів. Вплив естрадіолу на рівень 11-ОКС визначався в інкубаційному середовищі зразків тканин надниркових залоз хворих, прооперованих в клініці Інституту ендокринології, в середовищі культивування адренокортикоцитів новонароджених поросят та в плазмі крові інтактних та орхіектомованих щурів.

В результаті інкубації культивованих адренокортикоцитів з різними концентраціями 17-естрадіолу (3,7 х 10^-10 М - 3,7 х 10^-6 М) на протязі 48 годин культивування вміст 11-ОКС в середовищі культивування вірогідно зростав (р < 0,05; F-критерій Фішера) (рис. 1). При інкубації культивованих адренокортикоцитів в присутності 3,7 х 10^-6 М 17-естрадіолу вміст 11-ОКС (433,2 ± 97,5 мкг/л) перевищував більш ніж в 3 рази контрольну величину (139,0 ± 43,3 мкг/л).

Інкубація зрізів фрагментів кори надниркових залоз людини з 17-естрадіолом протягом 4 годин призводила до вірогідного підвищення рівня 11-ОКС в інкубаційному середовищі як при концентрації 3,7 х 10^-5 М Е₂ (3132,73 ± 384,34 нмоль/л 11-ОКС) так і при концентрації 3,7 х 10^-4 М Е₂ (6211,09 ± 840,84 нмоль/л 11-ОКС), порівняно з контролем (2363,40 ± 271,10 нмоль/л 11-ОКС) (рис. 2). При визначенні 11-ОКС в якості стандарту використовувався гідрокортизон.

В дослідах in vivo використовували дорослих щурів-самців лінії Вістар масою 200 - 250 г. Модель експерименту описана вище. Після 3 днів введення естрадіолу бензоату спостерігалось істотне зростання рівня сумарних 11-гідроксикортикостероїдів у плазмі крові як інтактних, так і орхіектомованих щурів. Показано, що введення 50 мкг естрадіолу інтактним тваринам призводить до збільшення рівня кортикостероїдів у 1,5 рази порівняно з інтактними тваринами, що отримували ін'єкції олії (1756 ± 171 нмоль/л проти 1132 ± 140 нмоль/л 11-ОКС). При введенні 100 мкг естрадіолу цей показник зростає більш ніж у 2 рази. Подібний ефект естрадіолу спостерігався і у кастрованих тварин (рис. 3).

Отримані дані показують, що культивування клітин надниркових залоз в середовищі, що містить 17-естрадіол, призводить до підвищення утворення 11-гідроксикортикостероїдів. Найбільш простим поясненням цього явища міг би бути проліферативний вплив Е₂, як це зазначено для інших клітин (Chalbos D. et al., 1994; Castagnetta L., Carruba G., 1995).

У контрольних орхіектомованих щурів рівень 11-ОКС був дещо нижчим, ніж у інтактних, яким вводили сливову олію. Збільшення концентрації кортикостероїдних гормонів під впливом естрадіолу було подібним в обох експериментальних групах. Виходячи з цих даних, можна стверджувати, що рівень тестостерону в організмі не має помітного впливу на зміни функції адренокортикальних клітин під впливом естрадіолу. Ні орхіектомія, ні замісне введення тестостерону щурам не призводили до змін концентрації вільного холестерину або його ефірів, які є попередниками синтезу кортикостероїдів (Duda T. et al., 1985).

Зростання маси органу в процесі гіпертрофії, а також поділ клітин в процесі мітозу вимагає прискорення біосинтезу не тільки ДНК, РНК та білка, а й утворення додаткових мембран, що є компонентами усіх клітинних структур. Зважаючи на це, можна припустити, що вплив на фосфоліпідний склад мембран є досить ймовірним шляхом модулюючого ефекту Е₂ на рецептори АКТГ, що локалізовані на мембранах, а також мембранозв'язані стероїдогенні процеси. Тому вивчення впливу 17-естрадіолу на склад мембран є вельми доцільним.

Зважаючи на це, а також на здатність Е₂ втручатися в контроль синтезу фосфоліпідів в органах-мішенях, нами було досліджено здатність 17-естрадіолу in vitro впливати на зміни фосфоліпідного складу мембран адренокортикоцитів людини.

Був досліджений кількісний склад 7 основних фосфоліпідів (ФЛ) мембран: лізофосфатидилхоліну (ЛФХ), сфінгомієліну (СМ), фосфатидилсерину (ФС), фосфатидилінозитолу (ФІ), фосфатидилхоліну (ФХ), фосфатидилетаноламіну (ФЕ) та дифосфатидилгліцерину (ДФГ). Результати спостережень показали що рівень концентрації ФС, ФІ та ДФГ вірогідно знижується, P < 0,05 по відношенню до контролю, F-критерій Фішера (табл. 1.). Вміст ЛФХ та СМ в присутності усіх концентрацій 17в-естрадіолу, що досліджувались, не зазнавав змін. У свою чергу спостерігалось вірогідне підвищення рівня ФХ та ФЕ, P < 0,05 по відношенню до контролю, F-критерій Фішера (табл. 1.).

Таблиця 1

Вплив 17-естрадіолу на вміст фосфатидилсерину (ФС), фосфатидилінозитолу (ФІ), дифосфатидилгліцерину (ДФГ), фосфатидилхоліну (ФХ) та фосфатидилетаноламіну (ФЕ) в мембранах адренокортикоцитів людини (мкг/100 мг тканини; М ± m, n = 4)

	ФС	ФІ	ДФГ	ФХ	ФЕ
Контроль (етанол)	10,78 ± 0,34	11,12 ± 0,76	7,76 ± 0,7	44,12 ± 3,12	25,12 ± 1,74
3,7 х 10-7 М Е2	9,4 ± 0,74	9,08 ± 0,92	5,48 ± 0,94	37,32 ± 3,58	20,42 ± 2,14
3,7 х 10-6 М Е2	6,22 ± 1,48	8,66 ± 1,28	4,40 ± 0,56	53,86 ± 5,78	22,64 ± 1,20
3,7 х 10-5 М Е2	6,36 ± 0,42	7,66 ± 1,16	4,60 ± 0,14	54,96 ± 2,24	34,34 ± 4,12
3,7 х 10-4 М Е2	7,36 ± 0,70	5,92 ± 0,48	4,16 ± 1,02	52,32 ± 5,12	34,32 ± 3,62

Цікаво, що при дії естрадіолу в концентрації 3,7 х 10^-7 М спостерігається вірогідне зниження вмісту як фосфатидилхоліну, так і фосфатидилетаноламіну, але в присутності більш високої концентрації Е₂ - 3,7 - 10^-6 М рівень цих фосфоліпідів починає зростати, набуваючи максимальної величини під впливом концентрації естрадіолу 3,7 х 10^-5 М.

Такі зміни фосфоліпідного складу мембран адренокортикоцитів здатні свідчити, що 17-естрадіол активує синтез фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноаміну, домінуючих компонентів мембран адренокортикоцитів. Ефект може здійснюватись за рахунок прискорення біосинтезу фосфатидилхоліну через цитидин-5'-дифосфатхолін (CDP-холін).

Таким чином, Е₂ бере участь у зміні фосфоліпідного складу мембран адренокортикальних клітин, впливаючи на оточення мембранозв'язаних структур.

Вплив 17-естрадіолу на вміст циклічних нуклеотидів в корі наднирників людини та вивчення ролі cАМР-залежної протеїнкінази А та протеїнкінази С у реалізації ефектів естрогенів в корі надниркових залоз людини та щурів.

Інкубація зрізів кори надниркових залоз "умовно нормальної тканини" (УНТ) протягом 4-х годин в середовищі, що містило 3,7 х 10^-5 М та 3,7 х 10^-4 М 17-естрадіолу призводила до підвищення вмісту cAMP від 100 до 800 % (р < 0,05) в присутності більшої концентрації естрадіолу (рис. 4). Вміст cGMP у зрізах під впливом 17-естрадіолу не змінювався за умов різних термінів інкубації (рис. 4).

Подальше вивчення можливої участі сАМР/ПКА - месенджерної системи в переносі внутрішньоклітинного сигналу естрадіолу вимагало визначення активності ПКА у субклітинних фракціях під впливом досліджуваного естрогену.

Інкубація зрізів УНТ надниркових залоз людини з естрадіолом протягом 4 годин призводить до активації протеїнкінази А у мікросомальній фракції як при концентрації 3,7 х 10^-4 М, так і при 3,7 х 10^-5 М естрогену (рис. 5А).

Виявлено вірогідне підвищення активності протеїнкінази С у мікросомальній фракції зрізів фрагментів кори надниркових залоз людини під впливом 3,7 х 10^-4 М 17-естрадіолу (рис. 5Б). У цитозольній фракції суттєвих змін активності досліджуваних протеїнкіназ не було зазначено (рис. 5 А та Б).

Результати досліджень in vivo представлені на рисунках 6 та 7. Визначення активності ПКА в субклітинних фракціях показало, що естрадіол бензоат активує цю кіназу (рис. 6). Триденне введення естрадіолу призводить до істотного зростання активності ПКА як у цитозольній, так і у мікросомальній фракціях кори надниркових залоз інтактних і орхіектомованих щурів. Вірогідність змін була вищою у мікросомальній фракції.

Статистично значуща активація протеїнкінази С спостерігається при введенні максимальної кількості естрадіолу - 100 мкг/тварину (рис. 7). Активність ПКС вірогідно збільшується як в цитозольній фракції адренокортикоцитів, так і, ще в більшій мірі, в мікросомальній фракції надниркових залоз інтактних і орхіектомованих щурів, що отримували естрадіол. Відомо, що накопичення ПКС саме в мембранній фракції (її транслокація) свідчить про активацію ферменту. Збільшення активності протеїнкіназ у цитозольній фракції можна пояснити тим, що активація ферменту починається у цитозольній фракції та досягає максимального ступеню після фіксації його на мікросомальній мембрані - транслокації.

Зміни експресії мРНК білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу (StAR) та десмолази в корі надниркових залоз людини під впливом 17в-естрадіолу in vitro. З регуляцією стероїдогенезу через сАМР-залежні шляхи тісно пов'язана активація особливого білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу, StAR (Steroidogenic acute regulatory protein). Прямих доказів впливу естрогенів на експресію мРНК StAR або десмолізи (ферменту, що відщеплює боковий ланцюг холестерину) в корі надниркових залоз не було знайдено. Тому метою цього фрагменту роботи було дослідити зміну рівня мРНК білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу (StAR) та десмолази в тканині кори надниркових залоз людини під впливом 17в-естрадіолу.

Як видно з наведених даних, внесення до середовища інкубації Е₂ викликає вірогідні зміни експресії мРНК StAR в адренокортикоцитах людини (рис. 8).

Під впливом Е₂ у концентрації 10^-4 М спостерігається збільшення рівня експресії мРНК StAR на 38 % (рис. 8). Подібна ситуація спостерігається при дослідженні експресії мРНК десмолази. Е₂ у концентрації 10^-4 М збільшує експресію мРНК десмолази як в абсолютних величинах (в 1,8 рази), так і у відсотках по відношенню до контролю (на 80 %) (рис. 8). Отже, внесення 17в-естрадіолу до середовища інкубації викликає зростання рівня мРНК StAR та десмолази в адренокортикоцитах людини, що може пояснювати встановлене нами у попередніх дослідженнях посилення стероїдогенезу в корі надниркових залоз внаслідок дії естрогенів (Тронько М.Д. та ін., 2006; Гринченко Е.Н. и др., 2006).

Отримані дані дозволяють вважати, що збільшення продукції кортикостероїдів за дії 17в-естрадіолу забезпечується посиленням як транспорту холестерину через мітохондріальну мембрану за участю StAR, так і його конверсії у прегненолон десмолазою.

Вплив естрадіолу in vivo на вміст РНК та ДНК в корі надниркових залоз, аденогіпофізі і гіпоталамусі щурів. Естрадіол має здатність як до безпосереднього впливу на кору надниркових залоз (Микоша А.С. и др., 2003), так і до опосередкованого через модуляцію ефектів агоністів, зокрема гормонів аденогіпофіза і гіпоталамуса (Gomez O., Balsa J.A., 2003). Таким чином, існує можливість опосередкування дії естрогенів на кору надниркових залоз через гіпоталамо-гіпофізарну систему (Putham K. et al., 2005).

В даному розділі представлені результати дослідження впливу естрадіолу бензоату in vivo на вміст РНК та ДНК в корі надниркових залоз, аденогіпофізі і гіпоталамусі.

В результаті введення естрадіолу бензоату рівень РНК в корі надниркових залоз, гіпофізі і гіпоталамусі істотно збільшувався (р 0,01, F-критерій Фішера), рис. 9.

Результати досліджень показали, що вміст ДНК збільшувався в корі надниркових залоз і аденогіпофізі при введенні 50 і 100 мкг естрадіолу, в гіпоталамусі рівень ДНК вірогідно не змінювався (рис. 9). За попередніми даними, включення міченого ³Н-тимідину в ДНК адренокортикоцитів знижувалось у оваріектомованих щурів, цей показник істотно збільшувався під впливом естрадіолу (Ковзун О.І., 1996).

Отже, формуються нові уявлення щодо регуляторного впливу естрогенів на кору надниркових залоз, до якого залучається гіпоталамо-гіпофізарно-адренокортикальна система, цей процес є значно складнішим, ніж вважалося раніше. Отримані дані свідчать, що до процесу стимуляції адренокортикальної функції кори надниркових залоз при дії надлишку естрогенів можуть бути залучені центральні ланки ГГАС, зокрема аденогіпофіз.

Вплив 17-естрадіолу на експресію мРНК проапоптичного білка Вах і рівень фрагментації ДНК в корі надниркових залоз людини. Порушення процесу апоптозу часто лежать в основі різних патологічних станів, включаючи злоякісні новоутворення, але апоптоз також відіграє вкрай важливу роль у нормальній життєдіяльності організму, визначаючи динамічну рівновагу між проліферацією та елімінацією клітин, регулюючи тим самим клітинну масу органів. Важливим шляхом розвитку антиапоптичного сигналу естрадіолу in vivo та in vitro є пригнічення активації проапоптичного білка Вах (Tsukahara S. et al., 2008; Zeng Q. et al., 2007), який, в свою чергу, може впливати на експресію білків-інгібіторів апоптозу ІАР.

Як видно з наведених даних, внесення до середовища інкубації Е₂ викликає вірогідні зміни експресії мРНК Вах в адренокортикоцитах (рис. 10). Рівень експресії мРНК Вах в присутності Е₂ 10^-4 М знижується майже в 1,3 рази до контролю. У концентрацї 10^-5 М Е₂ не впливає на експресію мРНК Вах, цей показник по відношенню до контролю становить 97,5 %. Подібна ситуація спостерігається при дослідженні фрагментації ДНК. Під впливом 17в-естрадіолу у концентрації 10^-4 М спостерігається зниження рівня фрагментації ДНК майже на 50 % (рис. 11). Інтенсивність фрагментації ДНК при додаванні до середовища інкубації естрадіолу у концентрації 10^-5 М становить 98,5 % від контролю (рис. 11). Отже, внесення Е₂ до середовища інкубації викликає зниження експресії мРНК проапоптичного фактора Вах та зменшення інтенсивності фрагментації ДНК в адренокортикоцитах людини.

Відомо, що ключовим процесом, що визначає вступ клітини на апоптичний шлях є гетеродимерізація білків Bcl-2. Серед механізмів, через які ці білки отримують сигнал до регуляції апоптозу, на цей час досліджені декілька. Серед них зміна структури Bax та Bad за ступенем їх фосфорилювання/дефосфорилювання.

Відбувається це за участю рецептора інтерлейкіну-3. Зв'язок рецептора з лігандом активує специфічні кінази, зокрема серин/треонін-специфічну протеїнкіназу Raf-1, переміщенню якої до мітохондріальної мембрани сприяє Bcl-2. За умов фосфорилювання Bax та Bad утворення гетеродимерів із Bcl-2 не відбувається і апоптоз не розвивається.

У разі відсутності інтерлейкіна-3 активуються фосфатази, що призводить до дефосфорилювання білків, утворення димерів і запуску апоптозу за рахунок вивільнення апоптозних мітохондріальних чинників.

Отже, естрадіол діє на кору надниркових залоз як шляхом зміни функції залози, так і впливаючи на її структуру. Експериментальні дані щодо впливу Е₂ на експресію проапоптичного білка Вах та інтенсивність фрагментації ДНК свідчать про можливість регуляторного впливу естрогенів також на процеси апоптозу в адренокортикальних клітинах.

Висновки

У дисертаційній роботі доведена роль естрогенів у регуляції глюкокортикоїдної секреції наднирковими залозами, встановлені складові месенджерного механізму активації стероїдогенезу естрогенами (фосфоліпіди, циклічний аденозинмонофосфат, протеїнкіназа А, протеїнкіназа С, десмолаза, білок-регулятор острої фази стероїдогенезу StAR) за умов патології та норми, встановлені та досліджені антиапоптичні ефекти естрадіолу в надниркових залозах.

Естрадіол впливає на підвищення синтезу кортикостероїдних гормонів корою надниркових залоз людини in vitro та тварин in vitro та in vivo.

17в-естрадіол змінює фосфоліпідний склад мембран адренокортикальних клітин. За дії гормону зростає вміст фосфатидилхоліну та фосфатидилетаноламіну, зменшується вміст фосфатидилінозитолу, фосфатидилсерину та дифосфатидилгліцеролу. Модуляція фосфоліпідного складу мембран може вести до зміни функції рецепторів АКТГ та ангіотензину ІІ в плазматичній мембрані і стероїдогенезу в мітохондріальних і мікросомальних мембранах. Естрадіол активує сигнальну систему, залежну від протеїкінази С.

cAMP-залежна месенджерна система регуляції стероїдогенезу активується естрадіолом в клітинах кори надниркових залоз. Рівень вмісту циклічного GMP в адренокортикоцитах, при інкубації з естрадіолом залишався без змін.

Активація ПКА і ПКС у субклітинних фракціях адренокортикоцитів людини та щурів внаслідок дії естрадіолу свідчить про причетність естрогенів до регуляції функції кори надниркових залоз і про залучення зазначених протеїнкіназ до переносу регуляторного сигналу естрадіолу в адренокортикальних клітинах. Зміни рівня кортикостероїдів і активності ПКА та ПКС in vivo під впливом естрадіолу бензоату є подібними у інтактних та орхіектомованих самців щурів, що дозволяє зробити висновок: видалення сім'яників не впливає на відповідь надниркових залоз на естрогени.

У посилення процесів стероїдогенезу в корі надниркових залоз під впливом 17в-естрадіолу залучені зміни експресії білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу (StAR) та десмолази, які реалізуються на рівні мРНК.

Під впливом естрадіолу бензоату in vivo спостерігаеться підвищення вмісту РНК у гіпоталамусі, гіпофізі та надниркових залозах, таким чином 17в-естрадіол здатний впливати на функцію кори надниркових залоз як прямо, так і опосередковано, через вплив на гіпоталамо-гіпофізарну систему.

Вплив 17в-естрадіолу на експресію Вах та інтенсивність фрагментації ДНК дозволяють віднести його до чинників, що регулюють апоптичні процеси в адренокортикоцитах.

Перелік праць, опублікованих за темою дисертації

Ковзун О. І. Пряма та непряма дія естрадіолу на глюкокортикоїдну функцію кори надниркових залоз / О. І. Ковзун, Є. М. Грінченко, О. С. Микоша // Клін. та експерим. патол. - 2004. - Т. 3, № 2, ч. 1. - С. 137-139. (Особисто здобувачем проведено огляд літературних джерел, експериментальні дослідження та аналіз отриманих даних).

Гринченко Е. Н. Влияние 17в-эстрадиола на содержание циклических нуклеотидов и активность протеинкиназ А и С в коре надпочечных желез человека / Е. Н. Гринченко, Е. И. Ковзун, А. С. Микоша // Укр. біохім. журн. - 2006. - Т. 78, № 5. - С. 88-92. (Особисто здобувачем проведено огляд літературних джерел, експериментальні дослідження та аналіз отриманих даних).

Вплив естрадіолу на синтез кортикостероїдів, активність протеїнкіназ А та С в корі надниркових залоз інтактних та орхіектомованих щурів / М. Д. Тронько, О. І. Ковзун, Є. М. Грінченко, О. С. Микоша // Фізіол. журн. - 2006. - Т. 52, № 6. - С. 30-34. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження та аналіз отриманих даних).

17в-естрадіол in vitro збільшує експресію мРНК білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу та десмолізи в корі надниркових залоз людини / О. І. Ковзун, Н. М. Костюченко, Є. М. Грінченко, О. С. Микоша // Ендокринологія. - 2009. - Т. 14, № 1. - С. 120-125. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та описання результатів роботи).

Вплив 17в-естрадіолу на експресію мРНК проапоптичного протеїну Вах і рівень фрагментації ДНК у корі надниркових залоз людини / М. Д. Тронько, О. І. Ковзун, Є. М. Грінченко, О. С. Микоша // Укр. біохім. журн. - 2009. - Т. 81, № 2. - С. 80-84. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження, статистична обробка та аналіз отриманих даних).

Kovzun O. I. Activation of protein kinase A and protein kinase C by 17-estradiol in human adrenal cortex in vitro / O. I. Kovzun, E. N. Grinchenko, A. S. Mikosha // 5^th Parnas Conference. Укр. Біохім. журн. - 2005. - Т. 77, № 2 (спец. вип.). - С. 121. (Особисто здобувачем проведено огляд літературних джерел, експериментальні дослідження та аналіз отриманих даних).

Гринченко Е. Н. Участие циклических нуклеотидов, протеинкиназ А и С в реализации эффекта 17-эстрадиола в коре надпочечных желез человека и крыс / Е. Н. Гринченко // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. 24-27 жовтня 2006 р. : матеріали з'їзду. - Харків, 2006. - Т. 2. - С. 44. (Роботу виконано самостійно).

Регуляція функції надниркових залоз естрогенами / О. І. Ковзун, Є. М. Грінченко, Л. М. Калинська, О. С. Микоша // Матеріали ІХ Українського біохімічного з'їзду. 24-27 жовтня 2006 р. : матеріали з'їзду. - Харків, 2006. - Т. 2. - С. 68-69. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження, та аналіз отриманих даних).

Kovzun O. I. The regulation of adrenocortical function by estradiol. Intracellular signal transduction pathways of estradiol in adrenocorticocytes / O. I. Kovzun, E. N. Grinchenko, A. S. Mikosha // Abstracts of the 6^th Parnas Conference Molecular Mechanisms of Cellular Signalling. Krakow Poland May 30^th - June 2^nd , 2007. Acta Biochim. Polonica. - 2007. - V. 54 Suppl. 2. - P. 23. (Особисто здобувачем проведено огляд літературних джерел, експериментальні дослідження та аналіз отриманих даних).

Зміни фосфоліпідного складу мембран адренокортикоцитів під впливом 17в-естрадіолу / Є. М. Грінченко, С. А. Шовкун, Н. М. Гула, О. С. Микоша // Матеріали V національного конгресу патофізіологів України «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів». Патологія. - 2008. - Т. 5, № 3. - С. 156. (Особисто здобувачем проведені експериментальні дослідження, аналіз отриманих даних).

Естрогени як фактор регуляції адренокортикальної функції: деякі молекулярно-генетичні механізми і системи трансдукції сигналу / М. Д. Тронько, О. І. Ковзун, Н. М. Костюченко, Є. М. Грінченко, О. С. Лукашеня, О. С. Микоша // Матеріали V національного конгресу патофізіологів України «Сучасні проблеми патофізіології: від молекулярно-генетичних до інтегративних аспектів». Патологія. - 2008. - Т. 5, № 3. - С. 159. (Особисто здобувачем проведені статистична обробка та аналіз отриманих даних).

Анотація

Грінченко Є.М. Аналіз механізмів внутрішньоклітинного переносу сигналу естрадіолу в корі надниркових залоз за умов патології та норми. - Рукопис.

Дисертація на здобуття наукового ступеня кандидата медичних наук за спеціальністю 14.03.04 - патологічна фізіологія. - Донецький національний медичний університет ім. М. Горького МОЗ України, Донецьк, 2009.

Робота присвячена вивченню молекулярних механізмів регуляції функції кори надниркових залоз естрадіолом. Визначено вплив 17-естрадіолу на стероїдогенез в корі надниркових залоз людини та тварин. Встановлено кількісні зміни фосфоліпідного складу кори надниркових залоз людини під впливом естрадіолу. Доведено участь cAMP-залежної сигнальної системи вторинних месенджерів в реалізації ефектів естрадіолу у корі надниркових залоз людини та тварин. Вивчено зміни активності протеїнкінази С в адренокортикоцитах під впливом естрадіолу. Проаналізовано зміну експресії мРНК білка-регулятора швидкої фази стероїдогенезу (StAR) та десмолази в корі надниркових залоз людини під впливом 17в-естрадіолу. Вивчено вплив естрадіолу in vivo на вміст РНК та ДНК в корі надниркових залоз, аденогіпофізі і гіпоталамусі щурів. Встановлено антиапоптичну дію 17-естрадіолу в адренокортикоцитах.

Ключові слова: кора надниркових залоз, естрадіол, апоптоз, Вах, протеїнкіназа А, протеїнкіназа С, сАМР, сGMP, кортикостероїди, фосфоліпіди, РНК, ДНК, аденогіпофіз, гіпоталамус, StAR, десмолаза.

Аннотация

Гринченко Е.Н. Анализ механизмов внутриклеточного переноса сигнала эстрадиола в коре надпочечных желез в условиях патологии и нормы. - Рукопись.

Диссертация на соискание ученой степени кандидата медицинских наук по специальности 14.03.04 - патологическая физиология. - Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького, Донецк, 2009.

Работа посвящена изучению молекулярных механизмов регуляции функции коры надпочечных желез эстрадиолом.

Воздействие 17в-эстрадиола in vitro приводит к усилению стероидогенеза в коре надпочечных желез человека и животных. Введение эстрадиола бензоата in vivo приводит к повышению уровня суммарных 11-гидроксикортикостероидов в плазме крови интактных и орхиэктомированных крыс. При изучении влияния 17в-эстрадиола на содержание фосфолипидов в мембранах адренокортикоцитов показано увеличение синтеза фосфатидилхолина и фосфатидилэтаноламина, принимающих участие в активации внутриклеточных мессенджерных путей переноса сигналов агонистов.

На постоперационной адренокортикальной ткани человека исследовано влияние 17в-эстрадиола на уровень сАМР и сGMP, активность протеинкиназ А и С. В условиях действия 17в-эстрадиола наблюдается накопление сАМР в адренокортикоцитах, уровень cGMP оставался без изменений. Обнаружено повышение активности ПКА и ПКС под влиянием эстрадиола in vitro в микросомальных фракциях адренокортикальной ткани. Сделан вывод, что активация стероидогенеза 17в-эстрадиолом обусловлена сАМР-зависимой сигнальной системой. 17в-эстрадиол вызывает увеличение активности протеинкиназы А в цитозольной и микросомальной фракциях адренокортикоцитов интактных и кастрированных крыс. Активность протеинкиназы С также повышается как в цитозольной так и в микросомальной фракциях в обеих исследованных группах.

Показано влияние 17в-эстрадиола на увеличение экспрессии мРНК белка-регулятора быстрой фазы стероидогенеза (StAR) и десмолазы в ткани коры надпочечных желез человека.

Исследовано влияние эстрадиола бензоата на содержание РНК и ДНК в структурах гипоталамо-гипофизарно-адренокортикальной системы (ГГАС) крыс. Содержание суммарной РНК под действием эстрадиола существенно возрастает как в коре надпочечников, так и в центральных звеньях ГГАС - аденогипофизе и гипоталамусе. Содержание ДНК увеличивается в надпочечниках и аденогипофизе крыс.

Изучено влияние 17в-эстрадиола на изменение уровня мРНК проапоптического белка Вах и фрагментации ДНК в ткани коры надпочечников человека. Внесение Е₂ в среду инкубации вызывает уменьшение уровня мРНК Вах в адренокортикоцитах на 21 % по сравнению с контролем. Интенсивность фрагментации ДНК снижается под влиянием Е₂ на 50 %. Представленные данные позволяют считать, что Е₂ оказывает существенное антиапоптическое действие в ткани коры надпочечников.

Ключевые слова: кора надпочечных желез, эстрадиол, апоптоз, Вах, протеинкиназа А, протеинкиназа С, сАМР, сGMP, кортикостероиды, фосфолипиды, РНК, ДНК, аденогипофиз, гипоталамус, StAR, десмолаза.

Summary

Grinchenko E.N. The analysis of mechanisms of intracellular signal transduction of estradiol in the adrenal cortex in normal and pathology conditions. - Manuscript.

Thesis for a scientific degree of candidate of medical sciences by speciality 14.03.04 - Pathophysiology. - National medical university of Donetsk, Donetsk, 2009.

The thesis describes the research of the of the molecular mechanisms of regulation of adrenocortical function of the adrenal cortex by estradiol. The influence of 17-estradiol on steroidogenesis in adrenal cortex was evaluated in humans and animals. Quantitative changes of the phospholipid composition of human adrenal cortex under the influence of estradiol were identified. It has been proved that cAMP-dependent signaling system of secondary messengers contributed to implementation of estradiol effects in humans and animals' adrenal glands. Changes in the protein kinase C activity in adrenocortycocytes under the influence of estradiol were studied. Changes in mRNA expression of the protein regulating the fast phase of steroidogenesis (StAR) and desmolase in human adrenal cortex under the influence of 17в-estradiol were analyzed. The effect of estradiol in vivo on the content of RNA and DNA in adrenal cortex, adenohypophysis and hypothalamus was studied in rats. An antiapoptosis activity of 17в-estradiol in adrenocortycocytes was shown.

Key words: adrenal cortex, estradiol, apoptosis, Bax, protein kinase A, protein kinase C, cAMP, cGMP, corticosteroids, phospholipids, RNA, DNA, pituitary, hypothalamus, StAR, desmolase.

Перелік умовних скорочень

Bad - білок, що активує апоптоз

Bax - білок, що активує апоптоз

Всl-2 - білок, що пригнічує апоптоз, регулюючи проникливість мітохондріальної мембрани

cAMP - циклічний аденозинмонофосфат

CDP-холін - цитидин-5'-дифосфохолін

cGMP - циклічний гуанозинмонофосфат

HEPES - N-(2-гідроксиетил)піперазин-N-2-етансульфонова кислота

StAR - (steroidogenic acute regulatory protein) стероїдогенний регуляторний білок гострої фази

11-ОКС 11-гідроксикортикостероїди

АКТГ - адренокортикотропний гормон