Антибиотики и иммуноглобулины. Возможности генной инженерии

Размещено на http://www.allbest.ru/

Антибиотики (от др.-греч. нфЯ -- anti -- против, вЯпт -- bios -- жизнь) -- вещества природного или полусинтетического происхождения, подавляющие рост живых клеток, чаще всего прокариотических или простейших.

Способы получения.

В настоящее время различают три способа получения антибиотиков: биологический, метод получения полусиитетических препаратов и синтез химических соединений -- аналогов природных антибиотиков.

1. Биологический синтез. Одним из главных условий получения антибиотика в большом количестве является продуктивность штамма, поэтому используются наиболее продуктивные мутанты «диких штаммов», полученные методом химического мутагенеза. Продуцент выращивают в жидкой оптимальной среде, в которую и поступают продукты метаболизма, обладающие антибиотическими свойствами. Антибиотики, находящиеся в жидкости, выделяют, используя ионообменные процессы, экстракцию или растворители. Определение активности антибиотика в основном производится микробиологическими методами с использованием чувствительных тест-микробов. За Международную единицу активности антибиотика (ЕД) принимают специфическую активность, содержащуюся в 1 мкг чистого препарата пенициллина Международная единица активности равна 0,6 мкг.

2. Полусинтетические антибиотики. Их готовят комбинированным способом: методом биологического синтеза получают основное ядро молекулы нативного антибиотика, а методом химического синтеза, путем частичного изменения химической структуры -- полусинтетические препараты.

Большим достижением является разработка метода получения полусинтетических пенициллинов. Методом биологического синтеза было извлечено ядро молекулы пенициллина -- 6-амшгапенициллановая кислота (6-АПК), которая обладала слабой антимикробной активностью. Путем присоединения к молекуле 6-АПК беизильной группы создан бензилпеиициллин, который теперь получают и методом биологического синтеза. Широко применяемый в медицине под названием пенициллин, бензилпеиициллин обладает сильной химиотерапевтической активностью, но активен лишь в отношении грамположительиых микробов и не действует на, устойчивые микроорганизмы, особенно стафилококки, образующие фермент -- р-лактамазу. Бензилпеиициллин быстро теряет свою активность в кислой и щелочной средах, поэтому его нельзя применять через рот (он] разрушается в желудочно-кишечном тракте).

Другие полусиитетические пенициллины: метициллин -- применяется для лечения инфекций, вызванных устойчивыми к бензилиенициллииу стафилококками, так как не разрушается под действием фермента -- (3-лактамазы; оксациллин -- устойчив к кислой среде, поэтому его можно применять внутрь; ампициллин -- задерживает размножение не только грамположительиых, но и грамотрицательных бактерий (возбудителей брюшного тифа, дизентерии и др.).

Полусинтетические препараты получают также на основе 7-аминоцефалоспориновой кислоты (7-АЦК). Производные 7-АЦК: цефалотин, цефалоридин (цепории) не дают аллергических реакций у лиц, чувствительных к пенициллину. Получены и другие полусинтетические антибиотики, например рифампицип -- эффективный противотуберкулезный препарат.

3. Синтетические антибиотики. Изучение химической структуры антибиотиков дало возможность получать их методом химического синтеза. Одним из первых антибиотиков, полученных таким методом, был полевомицетин. Большие успехи в развитии, химии привели к созданию антибиотиков с направленно измененными свойствами, обладающих пролонгированным действием, активных в отношении устойчивых к пенициллину стафилококков. К пролонгированным препаратам относятся экмоновоциллин, бициллин 1,3,5.

Иммунобиологические препараты - это препараты, которые оказывают влияние на иммунную систему, действуют через иммунную систему или принцип действия которых основан на иммунологических реакциях. Благодаря этим свойствам иммунобиологические препараты применяют для профилактики, лечения и диагностики инфекционных и неинфекционных болезней, в генезе которых играет роль иммунная система.

В группу иммунологических препаратов входят различные по природе, происхождению, способу получения и применения препараты, которые можно разделить на группы:

· Вакцины и другие профилактические и лечебные препараты приготовленные из живых микроорганизмов или микробных продуктов (анатоксины, фаги, эубиотики);

· Иммунные сывороточные препараты;

· Иммуномодуляторы;

· Диагностические препараты в том числе аллергены.

Производство медицинских биологических препаратов

Качество медицинских биологических препаратов и порядок их контроля во многом определяются технологией производства, от которой в значительной степени зависит отнесение медицинских биологических препаратов к тому или иному виду. В данном Приложении рассматриваются следующие медицинские биологические препараты:

1) микробные культуры, за исключением полученных по технологии рекомбинантной ДНК;

2) микробные и клеточные культуры, полученные по рекомбинантной ДНК технологии или методом гибридизации;

3) экстракты из биологических тканей;

4) живые агенты, выращенные в эмбрионах или животных.

К таким медицинским биологическим препаратам относятся: вакцины, иммунные сыворотки, антигены, гормоны, цитокины, ферменты и другие продукты ферментации (в т.ч. моноклональные антитела и продукты, получаемые из рекомбинантной ДНК).

Производство медицинских биологических препаратов имеет свою специфику, определяемую характером продукции и технологией производства. При производстве и контроле медицинской биологической продукции необходимо принимать специальные меры предосторожности. В отличие от обычных лекарственных средств, которые производятся с использованием химических и физических методов, обеспечивающих высокую степень стабильности, производство медицинских биологических препаратов связано с биологическими процессами и материалами, такими как культивирование клеток или экстракция материала из живых организмов. Эти биологические процессы характеризуются вариабельностью, что приводит к непостоянству спектра и природы сопутствующих продуктов. Более того, материалы, используемые в процессах культивирования, сами по себе являются субстратами для роста микроорганизмов.

Контроль медицинских биологических препаратов включает в себя биологические аналитические методы, которые характеризуются более высокой степенью вариабельности, чем физико-химические аналитические методы. Поэтому при производстве медицинских биологических препаратов особое значение имеют методы внутрипроизводственного контроля.

Исходные материалы

1. Следует четко определять источник, происхождение и пригодность исходных материалов для использования. Если проведение необходимых испытаний занимает много времени, допускается начинать обработку исходных материалов до получения результатов этих испытаний. В таких случаях разрешение на выпуск серии готовой продукции зависит от положительных результатов испытаний исходных материалов.

2. При необходимости стерилизации исходных материалов предпочтительным является тепловой метод. Для инактивации биологических материалов могут использоваться другие допустимые методы (например, обработка ионизирующим излучением).

Система посевных материалов и банков клеток

3. Для предотвращения нежелательного изменения свойств, которое может произойти вследствие многократных пересевов или большого числа генераций (пассажей), производство медицинских биологических препаратов, получаемых из культур микроорганизмов, культур клеток или размножением в эмбрионах и животных, должно быть основано на системе главного и рабочего банков посевных культур и/или клеток.

4. Количество генераций (удвоений, пассажей) между посевным материалом или банком клеток и готовой продукцией должно соответствовать требованиям нормативной документации и регистрационного досье. Масштабирование процесса не должно изменять это фундаментальное соотношение.

5.Посевные материалы и банки клеток необходимо соответствующим образом характеризовать и проверять на отсутствие контаминации. В дальнейшем их пригодность должна быть подтверждена стабильностью характеристик и качеством последовательных серий продукции. Посевные материалы и банки клеток следует создавать, хранить и использовать таким образом, чтобы риск их загрязнения или изменения был минимальным.

6. Посевные материалы и банки клеток необходимо создавать в контролируемой среде, обеспечивающей защиту посевных материалов и банков клеток и работающего с ними персонала. При создании посевного материала и банка клеток не допускается одновременная работа в одной зоне или одним и тем же персоналом с другими живыми или инфицирующими материалами (например, вирусами, линиями или штаммами клеток).

7. Данные, подтверждающие стабильность и воспроизводимость посевных материалов и банков клеток, необходимо оформлять в виде документов. Емкости, предназначенные для их хранения, должны быть герметичными, четко маркированными и храниться при необходимой температуре. Необходимо тщательно вести документальный учет хранящихся емкостей. В холодильных установках температуру хранения следует непрерывно регистрировать, а в установках с жидким азотом - контролировать соответствующим образом. Все отклонения параметров хранения за установленные границы и вытекающие из этого корректирующие действия должны быть оформлены протоколом.

8. Работа с посевными материалами и банками клеток выполняется только специально назначенным персоналом под контролем ответственного лица. Доступ к хранящимся посевным материалам и банкам клеток следует контролировать. Различные посевные материалы и банки клеток следует хранить таким образом, чтобы исключалась возможность их подмены или перекрестного загрязнения. Рекомендуется разделять посевные материалы и банки клеток и разные части хранить отдельно во избежание их потери.

9. Операции со всеми емкостями, содержащими главный и рабочий банки клеток и посевных материалов, следует проводить в одном порядке. Емкость, однажды взятая из хранилища, не может быть туда возвращена.

Принципы работы

- Следует проверять ростовые свойства среды культивирования.

- Добавление материалов или культур в ферментаторы и другие сосуды, а также отбор проб из них необходимо проводить в тщательно контролируемых условиях, обеспечивающих невозможность внесения загрязнений. При внесении добавок или отборе проб необходимо контролировать правильность подсоединения сосудов.

- Процессы центрифугирования или смешивания продуктов могут привести к образованию аэрозолей, поэтому во избежание переноса живых микроорганизмов эти процессы следует проводить в изолированных зонах.

- По возможности среда культивирования должна быть стерилизована на месте (in situ). При подаче в ферментаторы газов, сред, кислот или щелочей, пеногасителей и т.п., по возможности, следует использовать стерилизующие фильтры, встроенные в линии подачи.

- Особое внимание необходимо уделять аттестации (валидации) методов удаления или инактивации вирусов (см. соответствующую нормативную документацию).

- При инактивации или удалении вирусов в ходе производства необходимо принять меры против повторного загрязнения обработанной продукции со стороны необработанной продукции.

- В хроматографических методах используются разные виды оборудования, которое должно быть специально предназначено для проведения очистки одного типа продукции. Между сериями продукции это оборудование должно проходить стерилизацию или дезинфекцию. Не рекомендуется использовать одно и то же оборудование на разных технологических стадиях. Следует установить критерии приемлемости, срок службы и методы стерилизации или дезинфекции колонок.

Контроль качества

1. В обеспечении стабильности качества медицинских биологических препаратов особое значение имеет внутрипроизводственный контроль. Контрольные операции, имеющие решающее значение для качества продукции (например, отсутствие вирусов), но которые не могут быть проведены на готовой продукции, следует проводить на соответствующих промежуточных стадиях производства.

2. Образцы промежуточных продуктов необходимо хранить в соответствующих условиях, и их количество должно быть достаточным для повторения или подтверждения испытаний по контролю качества серии продукции.

3. Некоторые технологические процессы, например ферментация, требуют непрерывного контроля параметров. Эти данные должны входить составной частью в протокол на серию продукции.

4. При использовании в производстве перевиваемых культур их специфику следует учитывать в требованиях к контролю качества.

Иммуноглобулины

Антитела (иммуноглобулины,Ig) -- это растворимые гликопротеины, присутствующие в сыворотке крови, тканевой жидкости или на клеточной мембране, которые распознают и связывают антигены. Иммуноглобулины синтезируются В-лимфоцитами (плазматическими клетками) в ответ на чужеродные вещества определенной структуры -- антигены. Антитела используются иммунной системой для идентификации и нейтрализации чужеродных объектов -- например, бактерий и вирусов. Антитела выполняют две функции: антиген-связывающую функцию и эффекторную (например запуск классической схемы активации комплемента и связывание с клетками), являются важнейшим фактором специфического гуморального иммунитета, состоят из двух лёгких цепей и двух тяжелых цепей. У млекопитающих выделяют пять классов иммуноглобулинов -- IgG, IgA, IgM, IgD, IgE, различающиеся между собой по строению и аминокислотному составу тяжелых цепей. Антитела являются относительно крупными (~150 кДа -- IgG) гликопротеинами, имеющими сложное строение. Состоят из двух идентичных тяжелых цепей (H-цепи, в свою очередь состоящие из VH, CH1, шарнира, CH2 and CH3 доменов) и из двух идентичных лёгких цепей (L-цепей, состоящих из VL и CL доменов). К тяжелым цепям ковалентно присоединены олигосахариды. При помощи протеазы папаина антитела можно расщепить на два Fab (англ. fragment antigen binding -- антиген-связывающий фрагмент) и один Fc (англ. fragment crystallizable -- фрагмент, способный к кристаллизации). В зависимости от класса и исполняемых функций антитела могут существовать как в мономерной форме (IgG, IgD, IgE, сывороточный IgA) так и в олигомерной форме (димер-секреторный IgA, пентамер -- IgM). Всего различают пять типов тяжелых цепей (б-, г-, д-, е-и м- цепи) и два типа легких цепей (к-цепь и л-цепь).

Различают пять классов (ещё называемых изотипами) антител, различающихся: величиной, зарядом, последовательностью аминокислот, содержанием углеводов

Класс IgG подразделяется на четыре подкласса (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), класс IgA -- на два подкласса (IgA1, IgA2). Все классы и подклассы составляют девять изотипов, которые присутствуют в норме у всех индивидов. Каждый изотип определяется последовательностью аминокислот константной области тяжелой цепи.

Функции антител

Иммуноглобулины всех изотипов бифункциональны. Это означает, что иммуноглобулин любого типа распознает и связывает антиген, а затем усиливает киллинг и/или удаление иммунных комплексов, сформированных в результате активации эффекторных механизмов.Одна область молекулы антител (Fab) определяет ее антигенную специфичность, а другая (Fc) осуществляет эффекторные функции: связывание с рецепторами, которые экспрессированы на клетках организма (например, фагоцитах); связывание с первым компонентом (C1q) системы комплемента для инициации классического пути каскада комплемента.

v IgG является основным иммуноглобулином сыворотки здорового человека (составляет 70-75 % всей фракции иммуноглобулинов), наиболее активен во вторичном иммунном ответе и антитоксическом иммунитете. Благодаря малым размерам (коэффициент седиментации 7S, молекулярная масса 146 кДа) является единственной фракцией иммуноглобулинов, способной к транспорту через плацентарный барьер и тем самым обеспечивая иммунитет плода и новорожденного. В составе IgG 2-3% углеводов; два антигенсвязывающих Fab-фрагментов и один FC. Fab-фрагмент (50-52 кДа) состоит из целой L-цепи и N-концевой половины H-цепи, соединённых между собой дисульфидной связью, тогда как в FC-фрагмент (48 кДа) входит только половина H-цепей. Всего в молекуле IgG 12 доменов (участки, сформированные из в-структуры и б-спиралей полипептидных цепей Ig в виде неупорядоченных образований, связанных между собой дисульфидными мостиками аминокислотных остатков внутри каждой цепи): по 4 на тяжёлых и по 2 на лёгких цепях.

v IgM представляют собой пентамер основной четырехцепочечной единицы, содержащей две м- цепи. При этом каждый пентамер содержит одну копию полипептида с J-цепью (20 кДа), который синтезируется антителообразующей клеткой и ковалентно связывается между двумя соседними FC-фрагментами иммуноглобулина. Появляются при первичном иммунном ответе B-лимфоцитами на неизвестный антиген, составляют до 10 % фракции иммуноглобулинов. Являются наиболее крупными иммуноглобулинами (970 кДа). Содержат 10-12% углеводов. Образование IgM происходит ещё в пре-B-лимфоцитах, в которых первично синтезируются из м-цепи; синтез лёгких цепей в пре-B-клетках обеспечивает их связывание с м-цепями, в результате образуются функционально активные IgM, которые встраиваются в поверхностные структуры плазматической мембраны, выполняя роль антиген распознающего рецептора; с этого момента клетки пре-B-лимфоцитов становятся зрелыми и способны участвовать в иммунном ответе.

v IgA сывороточный IgA составляет 15-20 % всей фракции иммуноглобулинов, при этом 80 % молекул IgA представлено в мономерной форме у человека. Секреторный IgA представлен в димерной форме в комплексе секреторным компонентом, содержится в серозно-слизистых секретах (например в слюне, слезах, молозиве, молоке, отделяемом слизистой оболочки мочеполовой и респираторной системы). Содержит 10-12% углеводов, молекулярная масса 500 кДа.

v IgD составляет менее одного процента фракции иммуноглобулинов плазмы, содержится в основном на мембране некоторых В-лимфоцитов. Функции до конца не выяснены, предположительно является антигенным рецептором с высоким содержанием связанных с белком углеводов для В-лимфоцитов, еще не представлявшихся антигену. Молекулярная масса 175 кДа.

v IgE в свободном виде в плазме почти отсутствует. Способен осуществлять защитную функцию в организме от действия паразитарных инфекций, обуславливает многие аллергические реакции. Механизм действия IgE проявляется через связывание с высоким сродством (10-10М) с поверхностными структурами базофилов и тучных клеток, с последующим присоединением к ним антигена, вызывая дегрануляцию и выброс в кровь высоко активных аминов (гистамина и серотонина - медиаторов воспаления). 200 кДа.

Классификация по антигенам

v антиинфекционные или антипаразитарные антитела, вызывающие непосредственную гибель или нарушение жизнедеятельности возбудителя инфекции либо паразита

v антитоксические антитела, не вызывающие гибели самого возбудителя или паразита, но обезвреживающие вырабатываемые им токсины.

v так называемые «антитела-свидетели заболевания», наличие которых в организме сигнализирует о знакомстве иммунной системы с данным возбудителем в прошлом или о текущем инфицировании этим возбудителем, но которые не играют существенной роли в борьбе организма с возбудителем (не обезвреживают ни самого возбудителя, ни его токсины, а связываются со второстепенными белками возбудителя).

v аутоагрессивные антитела, или аутологичные антитела, аутоантитела -- антитела, вызывающие разрушение или повреждение нормальных, здоровых тканей самого организма хозяина и запускающие механизм развития аутоиммунных заболеваний.

v аллореактивные антитела, или гомологичные антитела, аллоантитела -- антитела против антигенов тканей или клеток других организмов того же биологического вида. Аллоантитела играют важную роль в процессах отторжения аллотрансплантантов, например, при пересадке почки, печени, костного мозга, и в реакциях на переливание несовместимой крови.

v гетерологичные антитела, или изоантитела -- антитела против антигенов тканей или клеток организмов других биологических видов. Изоантитела являются причиной невозможности осуществления ксенотрансплантации даже между эволюционно близкими видами (например, невозможна пересадка печени шимпанзе человеку) или видами, имеющими близкие иммунологические и антигенные характеристики (невозможна пересадка органов свиньи человеку).

v антиидиотипические антитела -- антитела против антител, вырабатываемых самим же организмом. Причём это антитела не «вообще» против молекулы данного антитела, а именно против рабочего, «распознающего» участка антитела, так называемого идиотипа. Антиидиотипические антитела играют важную роль в связывании и обезвреживании избытка антител, в иммунной регуляции выработки антител. Кроме того, антиидиотипическое «антитело против антитела» зеркально повторяет пространственную конфигурацию исходного антигена, против которого было выработано исходное антитело. И тем самым антиидиотипическое антитело служит для организма фактором иммунологической памяти, аналогом исходного антигена, который остаётся в организме и после уничтожения исходных антигенов. В свою очередь, против антиидиотипических антител могут вырабатываться анти-антиидиотипические антитела и т. д.

Вследствие высокой специфичности и большой роли в защитных иммунных реакциях антитела используются для диагностики инфекционных и неинфекционных заболеваний, определения иммунного статуса организма, профилактики и терапии ряда инфекционных и неинфекционных болезней.

Генетическая инженерия - получение новых комбинаций генетического материала путем проводимых вне клетки манипуляций с молекулами нуклеиновых кислот и переноса созданных конструкций генов в живой организм, в результате которого достигается их включение и активность в этом организме и у его потомства. Речь идет о направленном, по заранее заданной программе конструировании молекулярных генетических систем вне организма с последующим введением их в живой организм. При этом рекомбинантные ДНК становятся составной частью генетического аппарата рецепиентного организма и сообщают ему новые уникальные генетические, биохимические, а затем и физиологические свойства.

Цель прикладной генетической инженерии заключается в конструировании таких рекомбинантных молекул ДНК, которые при внедрении в генетический аппарат придавали бы организму свойства, полезные для человека. Например, получение «биологических реакторов» - микроорганизмов, растений и животных, продуцирующих фармакологически значимые для человека вещества, создание сортов растений и пород животных с определёнными ценными для человека признаками. Методы генной инженерии позволяют провести генетическую паспортизацию, диагностировать генетические заболевания, создавать ДНК-вакцины, проводить генотерапию различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК использует следующие методы:

ь специфическое расщепление ДНК рестрицирующими нуклеазами, ускоряющее выделение и манипуляции с отдельными генами;

ь быстрое секвенирование всех нуклеотидов очищенном фрагменте ДНК, что позволяет определить границы гена и аминокислотную последовательность, кодируемую им;

ь конструирование рекомбинантной ДНК;

ь гибридизация нуклеиновых кислот, позволяющая выявлять специфические последовательности РНК или ДНК с большей точностью и чувствительностью, основанную на их способности связывать комплементарные последовательности нуклеиновых кислот;

ь клонирование ДНК: амплификация in vitro с помощью цепной полимеразной реакции или введение фрагмента ДНК в бактериальную клетку, которая после такой трансформации воспроизводит этот фрагмент в миллионах копий;

ь введение рекомбинантной ДНК в клетки или организмы.

Возможности генной инженерии

Важной составной частью биотехнологии является генетическая инженерия. Родившись в начале 70-х годов, она добилась сегодня больших успехов. Методы генной инженерии преобразуют клетки бактерий, дрожжей и млекопитающих в "фабрики" для масштабного производства любого белка. Это дает возможность детально анализировать структуру и функции белков и использовать их в качестве лекарственных средств.

В настоящее время кишечная палочка (E. coli) стала поставщиком таких важных гормонов как инсулин и соматотропин. Ранее инсулин получали из клеток поджелудочной железы животных, поэтому стоимость его была очень высока. Для получения 100 г кристаллического инсулина требуется 800-1000 кг поджелудочной железы, а одна железа коровы весит 200 - 250 грамм. Это делало инсулин дорогим и труднодоступным для широкого круга диабетиков. В 1978 году исследователи впервые получили инсулин в специально сконструированном штамме кишечной палочки. Инсулин состоит из двух полипептидных цепей А и В длиной 20 и 30 аминокислот. При соединении их дисульфидными связями образуется нативный двухцепочечный инсулин. Было показано, что он не содержит белков E. coli, эндотоксинов и других примесей, не дает побочных эффектов, как инсулин животных, а по биологической активности от него не отличается. Впоследствии в клетках E. coli был осуществлен синтез проинсулина, для чего на матрице РНК с помощью обратной транскриптазы синтезировали ее ДНК-копию. После очистки полученного проинсулина его расщепили и получили нативный инсулин, при этом этапы экстракции и выделения гормона были сведены к минимуму. Из 1000 литров культуральной жидкости можно получать до 200 граммов гормона, что эквивалентно количеству инсулина, выделяемого из 1600 кг поджелудочной железы свиньи или коровы.

Соматотропин - гормон роста человека, секретируемый гипофизом. Недостаток этого гормона приводит к гипофизарной карликовости. Если вводить соматотропин в дозах 10 мг на кг веса три раза в неделю, то за год ребенок, страдающий от его недостатка, может подрасти на 6 см. Ранее его получали из трупного материала, из одного трупа: 4 - 6 мг соматотропина в пересчете на конечный фармацевтический препарат. Таким образом, доступные количества гормона были ограничены, кроме того, гормон, получаемый этим способом, был неоднороден и мог содержать медленно развивающиеся вирусы. В 1980 году разработана технология производства соматотропина с помощью бактерий, который был лишен перечисленных недостатков. В 1982 году гормон роста человека был получен в культуре E. coli и животных клеток в институте Пастера во Франции, а с 1984 года начато промышленное производство инсулина и в СССР. При производстве интерферона используют как E. coli, S. cerevisae (дрожжи), так и культуру фибробластов или трансформированных лейкоцитов. Аналогичными методами получают также безопасные и дешевые вакцины.

На технологии рекомбинантных ДНК основано получение высокоспецифичных ДНК-зондов, с помощью которых изучают экспрессию генов в тканях, локализацию генов в хромосомах, выявляют гены, обладающие родственными функциями (например, у человека и курицы). ДНК-зонды также используются в диагностике различных заболеваний.

Технология рекомбинантных ДНК сделала возможным нетрадиционный подход "белок-ген", получивший название "обратная генетика". При таком подходе из клетки выделяют белок, клонируют ген этого белка, модифицируют его, создавая мутантный ген, кодирующий измененную форму белка. Полученный ген вводят в клетку. Если он экспрессируется, несущая его клетка и ее потомки будут синтезировать измененный белок. Таким образом можно исправлять дефектные гены и лечить наследственные заболевания.

Если гибридную ДНК ввести в оплодотворенное яйцеклетку, могут быть получены трансгенные организмы, экспрессирующие мутантный ген и передающие его потомками. Генетическая трансформация животных позволяет установить роль отдельных генов и их белковых продуктов как в регуляции активности других генов, так и при различных патологических процессах. С помощью генетической инженерии созданы линии животных, устойчивых к вирусным заболеваниям, а также породы животных с полезными для человека признаками. Например, микроинъекция рекомбинантной ДНК, содержавшей ген соматотропина быка в зиготу кролика позволила получить трансгенное животное с гиперпродукцией этого гормона антибиотик препарат микроорганизм иммуноглобулин

Медицинские препараты, разрабатываемые методами современной биотехнологии: антикоагулянты и тромболитики, иммуноцитокины (интерфероны,интерлейкины, миелопептиды), гормоны, ферменты (липазы, протеазы), вакцины (против ВИЧ-инфекции, гепатита В, малярии), диагностикумы (для выявления ВИЧ-инфекций, гепатитаВ, сифилиса), моноклонеальные антитела( для иммунотерапии опухолей, предупреждения реакций отторжения) и др. Многие фармакологические средства до сих пор получают путем переработки лекарственных трав. Для этого необходимо организовать сбор или выращивание трав на плантации. Биотехнология и генетическая инженерия позволяют получать эти же природные фармакологические вещества путем выращивания в промышленных условиях культур клеток лекарственных растений. В настоящее время налажен выпуск десятков лекарственных средств среди них женьшень, строфантин и др.

Микроорганизмы, по которым можно косвенно судить о возможном присутствии патогенных микроорганизмов во внешней среде называют санитарно-показательными (СПМ). . То есть при их определении исходят из предположения, что чем больше объект загрязнён выделениями человека и животных, тем больше будет СПМ и тем вероятнее присутствие патогенов.

Содержание СПМ определяют двумя методами.

Прямой подсчёт количества бактерий. Проводят с помощью специальных камер (например, Петрова или Гельбера) либо специальных электронных счётчиков. Метод применяют в экстренных случаях при необходимости срочного ответа о количественном содержании бактерий (например, при авариях в системе водоснабжения, при оценке эффективности работы очистных сооружений и др.). Посев на питательные среды. Менее точный метод, так как выявляет только группы микроорганизмов, растущих при заданном режиме (на определённых питательных средах и при определённой температуре).

Содержание СПМ выражают в титрах и индексах.

Титр санитарно-показательных микроорганизмов -- наименьший объем исследуемого материала (в мл) или весовое количество (в г), в котором обнаружена хотя бы одна особь санитарно-показательный микроорганизм.

Индекс санитарно-показательных микроорганизмов -- количество СПМ, обнаруженное в определённом объеме или количестве исследуемого объекта. Для непитьевой воды -- в 1 г. Индекс -- величина, обратная титру. Зная один показатель, можно вычислить другой.

Основные характеристики санитарно-показательных микроорганизмов

* Санитарно-показательный микроорганизм должен постоянно обитать в естественных полостях человека и животных и постоянно выделяться во внешнюю среду.

* Санитарно-показательный микроорганизм не должен размножаться во внешней среде (исключая пищевые продукты), или его репродукция носит незначительный и кратковременный характер.

* Длительность выживания и устойчивость санитарно-показательных микроорганизмов во внешней среде должна быть не меньше, а даже несколько больше, чем у патогенных микроорганизмов.

* У санитарно-показательных микроорганизмов не должно быть во внешней среде «двойников» или аналогов, с которыми их можно перепутать.

* Санитарно-показательный микроорганизм не должен изменяться во внешней среде, во всяком случае в сроки выживания патогенных микроорганизмов.

* Методы идентификации и дифференциации санитарно-показательных микроорганизмов должны быть просты

Для получения продукции требуемого качества технологические операции следует выполнять согласно промышленному регламенту и соответствующим инструкциям, требованиям стандарта (gmp) нормативных документов и регистрационного досье.

1. Производственный процесс и его контроль должны выполняться квалифицированным персоналом.

2. Все операции с материалами и продукцией (например, приемка, карантин, отбор проб, хранение, маркировка, подготовка, приготовление, упаковка и отгрузка) должны выполняться согласно письменным инструкциям или методикам и, при необходимости, протоколироваться.

3. Все поступающие материалы должны быть проверены на соответствие заказу. Тару и упаковку следует очищать и маркировать.

4. Факты повреждения тары и упаковки, которые могут оказать отрицательное влияние на качество материалов, следует расследовать и протоколировать с последующим сообщением в отдел контроля качества.

5. Поступающие материалы и произведенная готовая продукция должны немедленно помещаться в карантин, действующий по принципу раздельного хранения или за счет организационных мер, и содержаться в нем до получения разрешения на использование или отгрузку.

6. Приемка промежуточной и нерасфасованной продукции выполняется по правилам, действующим для исходных материалов.

7 Все материалы и продукцию следует хранить в соответствующих условиях, определяемых производителем, в порядке, обеспечивающем разделение серий продукции и ее оборот на складе.

8. Для гарантии отсутствия отклонений за допустимые пределы следует обеспечить контроль выхода продукции и количественное сопоставление его с данными промышленного регламента.

9. Не допускается одновременное или последовательное проведение операций с различными продуктами в одном и том же помещении при отсутствии защиты от риска перепутывания или перекрестного загрязнения.

10. Продукция и материалы должны быть защищены от микробного и других видов загрязнений на всех этапах производства.

11. При работе с сухими материалами и продуктами необходимо принимать особые меры предосторожности по предотвращению образования и распространения пыли, особенно при работе с сильнодействующими и сенсибилизирующими веществами.

12. В ходе выполнения технологического процесса на всех материалах, упаковках с нерасфасованной продукцией, основном оборудовании и помещениях должны быть обозначения (маркировка) с указанием производимой продукции или материала, его дозировкой (при необходимости) и номера серии. При необходимости следует указывать стадию технологического процесса.

13. Обозначения (маркировка) на упаковке, оборудовании или помещениях должны быть четкими, однозначными, установленной формы. Кроме применения буквенных обозначений рекомендуется использовать цветовую маркировку, указывающую статус продукции (например, "Карантин", "Принято", "Отклонено", "Чистое" и т.п.).

14. Следует контролировать правильность соединения трубопроводов и другого оборудования, служащего для транспортирования продукции из одной зоны в другую.

15. Не допускается отклонение от инструкций. При необходимости письменное разрешение на отклонение от инструкций должно быть получено от компетентных лиц и отдела контроля качества.

16. В производственные помещения может входить только персонал, имеющий право доступа в них.

17. Как правило, в помещениях и на оборудовании, предназначенных для производства лекарственных средств, не допускается изготовление продукции немедицинского назначения.

Предотвращение перекрестного загрязнения при производстве

18. Следует исключить возможность загрязнения исходных материалов или продуктов другими материалами или продуктами. В процессе производства риск случайного перекрестного загрязнения возникает при неконтролируемом выделении пыли, газов, испарений, аэрозолей или микроорганизмов из материалов (продукции) и от остаточных загрязнений на оборудовании и одежде людей. Степень риска зависит от типа загрязнения и продукта, подверженного загрязнению.

К наиболее опасным загрязняющим веществам относятся сенсибилизирующие вещества, биологические препараты, содержащие живые микроорганизмы, некоторые гормоны, цитотоксины и другие сильнодействующие вещества. Особенно опасно загрязнение инъекционных препаратов, а также препаратов, предназначенных для приема в больших дозах и/или в течение продолжительного времени.

19. Для предотвращения перекрестного загрязнения следует предусмотреть следующие технические и организационные меры:

a) производство в выделенных зонах (обязательное для пенициллинов, живых вакцин, бактериальных препаратов из живых микроорганизмов и некоторых других биологических препаратов) или разделение циклов производства во времени с соответствующей уборкой помещения и оборудования между циклами;

b) организация воздушных шлюзов и вытяжных устройств;

c) снижение риска загрязнения, вызываемого рециркуляцией или повторным поступлением необработанного или недостаточно обработанного воздуха;

d) хранение защитной (специальной) одежды в пределах зон производства продукции с высоким риском перекрестного загрязнения;

e) использование высокоэффективных методов очистки и обработки с целью исключения недостаточной очистки, часто являющейся причиной перекрестного загрязнения;

f) использование "закрытых систем" производства;

g) контроль наличия остатков предыдущего продукта или моющих средств и маркировка оборудования с указанием статуса чистоты.

20. Следует периодически проверять эффективность мер по предотвращению перекрестного загрязнения в соответствии с утвержденными инструкциями.

Дезинфекция -- это комплекс мероприятий, направленных на уничтожение возбудителей инфекционных заболеваний и разрушение токсинов на объектах внешней среды. Для её проведения обычно используются химические вещества, например, формальдегид или гипохлорит натрия. Дезинфекция уменьшает количество микроорганизмов до приемлемого уровня, но полностью может их и не уничтожить. Является одним из видов обеззараживания. Различают профилактическую, текущую и заключительную дезинфекцию:

профилактическая -- проводится постоянно, независимо от эпидемической обстановки: мытьё рук, окружающих предметов с использованием моющих и чистящих средств, содержащих бактерицидные добавки.

текущая -- проводится у постели больного, в изоляторах медицинских пунктов, лечебных учреждениях с целью предупреждения распространения инфекционных заболеваний за пределы очага.

заключительная -- проводится после изоляции, госпитализации, выздоровления или смерти больного с целью освобождения эпидемического очага от возбудителей, рассеянных больным.

Методы дезинфекции

Механический -- предусматривает удаление заражённого слоя грунта или устройство настилов.

Физический -- обработка лампами, излучающими ультрафиолет, или источниками гамма-излучения, кипячение белья, посуды, уборочного материала, предметов ухода за больными и др. В основном применяется при кишечных инфекциях.

Кипячение используется для обработки белья (кипятят в мыльно-содовом растворе в течение 2 часов), посуды (в 2 % содовом растворе в течение 15 минут), питьевой воды, игрушек, остатков пищи. Паровоздушная смесь является действующим началом в пароформалиновой дезинфекционной камере; в дезинфекционных камерах обеззараживают вещи больного и постельные принадлежности. Ультрафиолетовое облучение используется для обеззараживания воздуха помещений в лечебных и других учреждениях (лампа БУВ-15 или БУВ-30).

Химический (основной способ) -- заключается в уничтожении болезнетворных микроорганизмов и разрушении токсинов дезинфицирующими веществами.

Комбинированный -- основан на сочетании нескольких из перечисленных методов(например, влажная уборка с последующим ультрафиолетовым облучением)

Биологический -- основан на антагонистическом действии между различными микроорганизмами, действии средств биологической природы. Применяется на биологических станциях, при очистке сточных вод.

Список использованной литературы

1. Шлегель Г. Общая микробиология. - М.: Мир, 1987. - 563 с.

2. НАЦИОНАЛЬНЫЙ СТАНДАРТ РОССИЙСКОЙ ФЕДЕРАЦИИ ПРАВИЛА ПРОИЗВОДСТВА И КОНТРОЛЯ КАЧЕСТВА ЛЕКАРСТВЕННЫХ СРЕДСТВ ГОСТ Р 52249-2004

3. Щелкунов С.Н. Генетическая инженерия. - Новосибирск: Изд. Новосибирского университета, 1994. - 303 с.

4. Рыбчин В.Н. Основы генетической инженерии: учебное пособие для ВУЗов. - Минск: Высшая школа, 1986. - 186 с.

5. Тимофеев Н.С., Тимофеев Н.Н. Асептика и антисептика. Л.: Медицина, 1989. - 240 с.

6. Микробиологический мониторинг производственной среды. МУК 4.2.734-99.- М.: 1999.-31 с.

Размещено на Allbest.ru