Ферменты и ферментодиагностика

Размещено на http://www.allbest.ru/

Размещено на http://www.allbest.ru/

Ферменты и ферментодиагностика

фермент активность энзимодиагностика катализатор

Ферменты или энзимы - биологические катализаторы белковой природы. Слово фермент происходит от латинского fermentum «закваска», а энзим от древнегреческого «эн зюме» - «в дрожжах».

На современном этапе учение о ферментах выделено в самостоятельную науку - энзимологию. Она стремительно развивается в тесной связи с целым рядом других наук - неорганической, органической, физической химией, физиологией, микробиологией, генетикой, фармакологией и др. Ферменты и ферментные препараты широко используются в практической ветеринарии и медицине, пищевой промышленности и других отраслях.

Ферменты являются белками, как простыми, так и сложными. Они могут иметь до 4-х уровней организации. Большинство ферментов относится к сложным белкам, имеющим помимо полипептидных цепей и небелковый компонент. Полипептидную часть фермента называют обычно апоферментом, а небелковую - кофактором. Если белковая часть молекулы феремента прочно связана со своим кофактором и эта связь не разрушается при выделении и очистке, то такой кофактор называют простетической группой. Если же эта связь непрочная и легко разрушается, то небелковую часть молекулы обозначают, обычно, как кофермент.

Необходимо отметить, что в случае сложных ферментов ферментативной активностью обладает только комплекс апофермент-кофактор, в отдельности ни тот, ни другой катализировать реакцию не могут.

Каталитическое действие связано с определенным участком белковой молекулы фермента, т.е. активным центром. Под активным центром понимают высокоспецифическую комбинацию аминокислотных остатков определенной части фермента, обеспечивающую взаимодействие его с молекулой субстрата и каталитическое действие. Обычно с активным центром связывается субстрат, т.е. вещество, которое превращается под действием фермента, хотя субстрат - связывающий участок и активный центр не обязательно совпадают. Активные центры составляют очень небольшую часть молекулы фермента. В состав активного центра входят также коферементы.

Помимо активного центра у ферментов имеется регуляторный или аллостерический центр (от греч. alios - иной, чужой). Он называется так потому, что молекулы, связывающиеся с этим центром по строению (стерически) отличаются от субстрата, но влияют на превращение субстрата, меняя конформацию активного центра и оказывая тем самым влияние на каталитический эффект.

Обычно активный центр фермента состоит из 12-20 аминокислотных остатков полипептидной цепи. Нужно иметь в виду, что аминокислоты образующие активный центр, как правило, находятся не рядом, а в разных местах полипептидной цепи, которая так располагается в пространстве, что они сближаются и формируют активный центр.

Встает естественный вопрос, почему молекула фермента столь велика (молекулярные массы ферментов варьируют от 10000 до нескольких миллионов), если в образовании активного центра принимает участие всего лишь десяток-другой аминокислот. Дело в том, что для проявления ферментативного действия необходима определенная конформация белка, которая обеспечивает соответствующее пространственное расположение реакционноспособных групп молекулы фермента. Большинство аминокислот молекулы фермента играют чисто структурную роль, поддерживая необходимую трехмерную форму молекулы.

Считается, что аминокислоты, из которых состоят ферменты, в соответствии с той ролью, которую они играют можно разделить на 3 группы.

Некоторые аминокислоты содержат реакционные группы, действующие на субстрат в процессе осуществления ферментативной реакции (аминокислоты каталитического участка).

Другие обеспечивают присоединение субстрата к ферменту таким образом, чтобы связь была определенным образом ориентирована по отношению к активному центру (аминокислоты контактного участка).

Аминокислоты третьей группы играют чисто структурную роль и создают необходимую пространственную структуру (структурные аминокислоты). У простых ферментов, роль функциональных групп контактного и каталитического участка выполняют только боковые радикалы аминокислот. У сложных ферментов главную роль в этих процессах выполняют кофакторы. Аминокислоты в этом случае играют вспомогательную роль, обеспечивая необходимую конформацию активного центра.

Механизм действия и регуляция активности ферментов

Основным положением ферментативной кинетики является представление о фермент-субстратных комплексах (ES). Как в случае неорганических катализаторов, фермент обеспечивает протекание реакции по более эффективному пути, с более низкой энергией активации. Более высокая каталитическая активность ферментативной реакции обусловлена тем, что процесс идет через стадию образования ES. Скорость ферментативных реакций в 10³ - 10¹³ раз выше скорости не каталитической реакции. Такое резкое увеличение скорости обусловлено двумя причинами - эффектом сближения, который наблюдается и в неферментных реакциях и эффектом ориентации, который исключительно результативно осуществляется именно в ферментативных реакциях.

Молекулы ферментов в отличие от других катализаторов имеют очень сложное строение. Это дает возможность реализовать такие механизмы повышения скорости реакций, которые невозможны с небиологическими катализаторами. Здесь возможны взаимодействия особого рода, отсутствующие в обычном катализе. Если допустить, что связывание субстрата на молекуле фермента происходит не в одной, а трех точках, то одно это уже резко увеличивает вероятность необходимых ориентаций и на несколько порядков повышает скорость реакции.

В образовании фермент-субстратных комплексов могут принимать участие ковалентные, ионные, водородные связи, гидрофобные взаимодействия. Каталитическая активность фермента связана с его пространственной структурой, в которой жесткие участки спиралей чередуются с гибкими эластичными линейными отрезками.

При объяснении механизма действия ферментов широкое признание получила гипотеза «индуцированного» или «вынужденного» соответствия Кошленда. В соответствии с этой гипотезой необходимое расположение функциональных групп активного центра фермента происходит под воздействием субстрата. Реакционно-способная конформация всей молекулы фермента и его активного центра возникает в результате деформирующего воздействия субстрата. При этом следует иметь в виду, что индуцированное соответствие создается не только изменением конформации фермента, но и перестройкой молекулы субстрата.

Гипотеза «вынужденного соответствия» была экспериментально подтверждена, когда было доказано изменение расположения функциональных групп активного центра в процессе присоединения субстрата. Специфичность фермента обусловлена, вероятно, возможностью конформационных перестроек активного центра. Если возможности перестройки велики, то фермент может взаимодействовать с несколькими близкими по структуре субстратами и проявляет групповую специфичность, если возможность резко ограничена, то фермент высоко специфичен.

Гипотеза индуцированного соответствия предполагает наличие между ферментом и субстратом не только пространственной комплементарности, но и электростатического взаимодействия, обусловленного противоположно заряженными группами субстрата и фермента.

В организме реализуется одновременно огромное количество биохимических реакций важных для процессов жизнедеятельности, которые должны строго регулироваться в соответствии с потребностями организма. Эта регуляция должна обеспечивать поставку необходимых компонентов в заданный отрезок времени с наименьшими затратами энергии. Так как практически любая биологически важная реакция - это ферментативная реакция, то ясно, что такая регуляция осуществляется главным образом путем контроля ферментов, катализирующих ключевые метаболические реакции.

Скорость образования конечного продукта метаболического пути может регулироваться или путем изменения активности соответствующих ферментов или путем увеличения или уменьшения числа молекул фермента (индукция или репрессия).

Регулирование активностей ферментов в клетке происходит различными путями. Для большинства ферментов, которые подчиняются уравнению Михаэлиса-Ментен, важным регуляторным фактором является концентрация субстрата. Была введена величина К_м представляющая концентрацию субстрата, при которой скорость реакции составляет 50% максимальной. Так как в клетке концентрация субстратов близка к К_м или несколько ниже ее, то незначительные изменения концентрации субстратов приводят к относительно большим изменениям скоростей реакций.

Регуляция активности фермента может осуществляться за счет прямого воздействия на центры связывания субстрата, например, ингибирование фермента аналогами субстрата.

Прочно связываются с активным центром фермента ингибиторы белковой природы. Например, ингибитор трипсина - белок с молекулярной массой 6000. Он обладает сильным ингибирующим эффектом, так как строго комплементарен структуре активного центра фермента.

Однако гораздо чаще встречается аллостерический (нековалентный) тип регуляции активности ферментов.

Аллостерическая регуляция характерна для ферментов, состоящих из 2 и более субъединиц и имеющих более одного субстратсвязывающего центра. Эти ферменты содержат аллостерические центры (отличные от субстратсвязывающих), которые способны связывать определенные вещества, носящие название аллостерических эффекторов. Если связывание эффектора снижает скорость ферментативной реакции, то его называют аллостерическим ингибитором, если увеличивает - аллостерическим активатором. В качестве аллостерических эффекторов ферментов выступают различные метаболиты, гормоны, коферменты. Одним из путей регуляции аллостерических ферментов является угнетение посредством «отрицательной обратной связи» или «ретроингибирование», т.е. угнетение конечным продуктом реакции. Некоторые молекулы ферментов имеют несколько аллостерических центров, одни из которых специфичны к положительным, другие к отрицательным эффекторам. Аллостеричекие центры ферментов так же, как и активные центры, могут проявлять резко выраженную специфичность, когда они могут связывать только один определенный эффектор или относительную, когда может происходить связывание сходных по структуре эффекторов.

Механизм действия аллостерического эффектора связан с изменением конформации субъединиц из которых построен фермент, что сказывается на каталитической активности фермента.

Аллостерическая регуляция является одним из самых тонких и высоко специфичных механизмов «быстрого реагирования» на те или иные процессы в окружающей среде и используется для точной настройки метаболических систем. Эффектор может действовать только в одной или нескольких тканях организма и быть связанным со строго определенным звеном метаболизма.

Для аллостерических ферментов характерно явление кооперативности. Оно проявляется в том, что каталитические центры субъединиц взаимодействуют не автономно, а взаимосвязано. Взаимодействие с субстратом или эффектором одного из таких центров усиливает способность к взаимодействию остальных активных центров (положительная кооперативность). В некоторых случаях связывание одним активным центром субстрата понижает способность к связыванию остальных центров (отрицательная кооперативность).

Наиболее хорошо положительная кооперативность изучена на примере молекулы гемоглобина, которая имеет четыре связывающих 0₂ участка (группы гема). Связывание молекулы кислорода одним центром, приводит к усиленному взаимодействию с кислородом остальных участков. Сродство гемоглобина к 0₂ к последней (четвертой) группе более чем в 100 раз больше, чем к первой. Так как связывающие кислород участки разделены в молекуле большими расстояниями, то они не могут взаимодействовать непосредственно. Очевидно, при оксигенировании меняется конформация молекулы в целом, что приводит к изменению сродства связывающих участков.

Кооперативность также является одним из путей регуляции активности ферментов.

Активность фермента может изменяться и в результате, так называемой ковалентной (посттрансляционной) модификации, при которой происходит или отщепление части молекулы или присоединение к ферменту небольших групп. В обоих случаях эти модификации молекулы фермента связаны с разрывом или образованием ковалентных связей.

Известно, что протеолитические ферменты желудочно-кишечного тракта (пепсин, трипсин, химотрипсин) синтезируются в виде неактивных предшественников - проферментов. Регуляция активности фермента в этом случае заключается в том, что под действием специфических веществ (ферментов) неактивная форма превращается в активную. Так, например, трипсин синтезируется в поджелудочной железе в виде трипсиногена, который, попадая в тонкий кишечник, под действием фермента энтерокиназы превращается в трипсин. При этом от трипсиногена отщепляется гексапептид. Трипсин в свою очередь разрывает одну пептидную связь в химотрипсиногене, что приводит к структурным изменениям в активном центре и превращает его в активный химотрипсин.

Превращение пепсиногена в активную форму пепсин также связано с отщеплением пептида от молекулы неактивного пепсиногена. Синтез протеолитических ферментов в виде проферментов имеет важное значение в процессе регулирования процесса пищеварения в желудочно-кишечном тракте.

Регулирование активности протеолитических ферментов в желудочно-кишечном тракте происходит не только превращением профермента в активный фермент, но и путем связывания ферментов с естественными ингибиторами. В слизистой оболочке желудка и кишечника были найдены низкомолекулярные белки, ингибирующие действие пепсина и трипсина. Весьма активный ингибитор пепсина был выделен из желудка свиньи, а ингибитор трипсина из поджелудочной железы.

Ковалентная модификация фермента с изменением его активности может происходить не только в результате разрыва пептидных связей, а путем присоединения к молекуле фермента специфической группы. Например, регуляция активности фермента гликогенсинтетазы, играющего основную роль в тонкой регуляции синтеза гликогена осуществляется путем фосфорилирования и дефосфорилирования его.

Фосфорилирование с участием протеинкиназ является распространенной формой регуляции активности ферментов путем ковалентной модификации. Активность большого числа ферментов и интенсивность соответствующих процессов обмена веществ определяется соотношением фосфорилированных и дефосфо - рилированных форм этих ферментов.

Регуляция ферментативной активности может осуществляться за счет усиления синтеза уже имеющихся ферментов или даже новых ферментов в ответ на изменившиеся условия существования (появление новых пищевых факторов, химических веществ).

При воздействии специфических веществ «индукторов» или «репрессоров» происходит соответственно инициация или подавление процесса транскрипции. Эта регуляция, осуществляемая в процессе биосинтеза фермента, может приводить к изменению концентрации фермента, изменению типов имеющихся в клетке ферментов и изоферментного состава.

Этот путь регуляции более медленный, так как связан с изменением биосинтеза белка. Поэтому между сигналом о необходимости изменения концентрации фермента и установлением его нового содержания пройдет определенное время - от нескольких часов, до нескольких дней. Следовательно, путем изменения концентрации фермента, быстрого регулирования скоростей реакций добиться нельзя. Однако, в тех случаях, когда необходимо не быстрое изменение метаболизма, а продолжительная регуляция метаболического процесса этот путь приобретает важное значение.

Например, в случаях необходимости стимуляции глюконеогенеза происходит повышение концентрации таких ферментов как глюкозо - 6 - фосфатаза, фруктозо -1,6 - бисфосфатаза и фосфоенолпируваткарбоксилаза. Потребность в повышенных количествах этих ферментов обусловлена тем, что они катализируют реакции в обход физиологически необратимых этапов прямого цикла.

Показано, что при метаболическом ацидозе у животных усиливается синтез глутаминазы. Это связано с необходимостью нейтрализации аммиаком накапливающихся в организме кислых продуктов.

Имеющиеся в литературе данные говорят о том, что индукция или репрессия ферментов могут вызываться диэтическими факторами.

Введение глюкозы крысам, предварительно голодавшим в течение 5 дней, вызвало резкое повышение активности глюкокиназы. Так как инъекция пуромицина или актимицина Д подавляли эту активацию, был сделан вывод о том, что причина повышения активности фермента объясняется увеличением его синтеза (пуромицин тормозит синтез белка, а актиномицин - синтез мРНК).

Хорошо известна зависимость между активностью ферментов цикла мочевинообразования и количеством белка в рационе. Повышение содержания белка в рационе сопровождается повышением активности этих ферментов, причем это повышение пропорционально интенсивности синтеза мочевины. Не было обнаружено изменения кинетических свойств ферментативных молекул, наличие каких-либо ингибиторов или активаторов, что позволило сделать заключение, что увеличение активности связано с повышеным синтезом соответствующих ферментов.

Велико значение индукции ферментов при патологии. Индукция ферментов часто сопряжена с развитием защитных процессов при возникновении патологических состояний организма. В то же время следует иметь в виду, что в некоторых случаях усиленный синтез ферментов в ответ на изменение внешних условий среды может привести к развитию патологического процесса.

В ряде случаев при поступлении в организм лекарственных или других чуждых ему веществ также происходит индукция ферментов. Однако это не всегда способствует адаптации организма к новому для него веществу и не всегда обеспечивает более благоприятные условия для жизнедеятельности организма, так как продукт ферментативного превращения может быть более токсичен, чем исходное вещество. В этом случае эффект будет отрицательный.

Способностью индуцировать образование ферментов, как установлено, обладают многие лекарственные вещества - барбитураты, летучие анастетики, гипогликемические вещества, анальгетики, инсектициды и др. Этим явлением можно объяснить наблюдающиеся часто привыкание к некоторым лекарственным веществам при их длительном применении.

Например, при экспериментальном введении собакам фенилбутазона у животных повышалось его содержание в крови и наблюдалось явление интоксикации. Повторное введение этого препарата уже не вызывало столь резко выраженного повышения его в крови и токсического эффекта.

Индукция ферментов фармакологическими веществами часто не является узкоспецифической. Часто образуются ферменты, способствующие превращению не только данного вещества - индуктора, но некоторых других лекарственных веществ. Например, введение в организм пентабарбитурата приводит к усилению метаболизма не только этого вещества, но вызывает усиленное окисление и гексабарбитурата и даже веществ, не относящихся к группе барбитуратов.

Говоря о метаболизме лекарственных веществ в организме нужно иметь в виду, что он может осуществляться не только за счет индукции ферментов, но также путем аллостерической и ковалентной модификации ферментов.

Принципы клинической энзимодиагностики

Компартментализация ферментов. Изоферменты

Диагностическая энзимология основывается на 3 основных принципах в трактовке результатов.

Первый из них касается тех ферментов, которые выполняют свойственные им функции, находясь внутри клеток, а в жидкости организма попадают вследствие нарушения проницаемости клеточных мембран или даже их разрушения в результате патологического процесса. Характер и тяжесть патологического процесса определяют, какие ферменты и в каком количестве будут выходить в межтканевую жидкость, а оттуда с током лимфы в кровь и мочу. Если повреждена только наружная клеточная мембрана - выходят в основном ферменты цитоплазмы, при более глубоких поражениях клетки и повреждении мембран клеточных органелл (митохондрий, лизосом, ядер и др.) в крови появляются соответствующие ферменты. При остром процессе с гибелью большого числа клеток количественные изменения будут выражены более резко, чем при вяло текущем хроническом процессе. Эти изменения позволяют судить о глубине поражения и динамике повреждения.

Второй принцип в энзимодиагностике основывается на определении тех ферментов, которые реализуют свою биохимическую функцию, будучи секретированными из клеток в плазму крови. Понижение их активности служит признаком повреждения секретирующего органа.

Третий принцип - обнаружение ферментопатий, т.е. таких состояний, когда в результате генетических нарушений организм полностью или частично неспособен синтезировать какой-либо фермент.

Вследствие трудности непосредственного определения количества фермента, об их концентрации судят по величине активности, что позволяет обнаруживать очень небольшие количества ферментов. Хотя активность ферментов - это способность исследуемого материала ускорять течение соответствующей биохимической реакции, а концентрация - это количество специфического белка в единице объема, согласно международной договоренности между этими понятиями, ставят знак равенства. В клинической биохимии пользуются практически всегда значениями активностей.

С целью унификации результатов лабораторных исследований была принята международная (интернациональная) единица ферментативной активности, которая выражается количеством микромолей превращенного субстрата или продукта реакции за 1 минуту. В этом случае активность фермента выражается количеством международных единиц в одном литре (МЕ/л или ИЕ/л). В системе СИ единицей активности фермента является катал, характеризующийся количеством молей превращенного субстрата или продукта реакции в секунду. Так как это очень большая величина (катал = 60000000 ИЕ), то практические расчеты проводятся с его миллиардной частью - нанокаталом (1 ИЕ=16,67 нкат). В тоже время нужно иметь в виду, что введение международной единицы и катала не решает полностью проблему унификации единиц ферментативной активности, так как различие в условиях проведения эксперимента (рН, температура, природа и концентрация субстрата, концентрация кофермента и др.) сказываются на конечном результате.

В организме животных дифференциация на органы и ткани сопровождалась определенными биохимическими изменениями в клетках этих органов и тканей. Эти различия носили как количественный характер, выражающийся в различной интенсивности протекающих в клетках процессов, так и качественный, обусловленный наличием в тканях реакций присущих главным образом клеткам определенных типов. Так, например, практически во всех тканях животных происходит окисление глюкозы в присутствии кислорода, но скорости этого процесса в различных тканях различны. В тоже время биосинтез стероидных гормонов происходит только в коре надпочечников, гонадах и плаценте.

Дифференциация органов и тканей в процессе роста и развития приводит к тому, что клетки специализируются в каком-то одном направлении, теряют универсальность и в них осуществляется синтез ограниченного числа ферментов необходимых для осуществления той функции, для которой предназначен данный орган или ткань.

Определяя активность ферментов в гомогенатах органов и тканей получают картину их распространения в организме животного. Некоторые ферменты обладают низкой органной специфичностью и широко распространены в тканях, отличаясь только концентрацией, другие более специфичны и обнаруживают активность только в одном или в ограниченном числе источников.

Наибольший диагностический интерес представляют те ферменты, которые специфичны для определенных органов и тканей. Фермент может иметь диагностическое значение и в том случае, когда он широко распространен, но изоферментный спектр клеток различных органов и тканей будет неодинаков, как например, в случае фермента лактатдегидрогеназы.

С развитием метода дифференциального ультрацентрифугирования, была изучена клеточная локализация ферментов. Этот метод дает возможность разделить клеточный гомогенат на четыре фракции: ядерную, митохондриальную, микросомальную и над осадочную (растворимую). Анализ отдельных фракций показывает, что ферменты, как правило, связаны с отдельным типом частиц, хотя в некоторых случаях однотипные ферменты могут обнаруживаться в различных фракциях.

В митохондриях содержатся все ферменты цикла Кребса, а также ферменты окисления жирных кислот и окислительного фосфорилирования. Эта структурная специфичность может быть относительна. Если окисление жирных кислот и окислительное фосфорилирование исключительно митохондириальные процессы, то окисление пировиноградной кислоты может происходить и в других частях клетки. Однако исключительно высокая активность этого процесса в митохондриях указывает, что именно эти частицы являются ответственными за осуществление цикла Кребса. Необходимо также иметь в виду, что ферменты катализирующие одну и туже реакцию и находящиеся в различных фракциях могут отличаться по своим характеристикам. Например, аспартатаминотрансфераза обнаруживается как в митохондриальной, так и растворимой фракциях, но эти ферменты различаются по сродству к субстрату, электрофоретической подвижностью и детерминируются различными генами. Это существование функционально однотипных ферментов является, очевидно, приспособлением к особенностям метаболизма существующим в отдельных частях клетки.

Лизосомы содержат группу гидролитических ферментов имеющих оптимум рН около 5: катепсины, кол - лагеназу, глюкозидазы, эстеразы, рибонуклеазу, дезоксирибонуклеазу. Эти ферменты изолированы лизосо - мальной мембраной, что предотвращает в обычных условиях аутолиз (это происходит когда клетки погибают). При патологических процессах, под действием лекарственных веществ, токсинов бактерий и др. лизосомы могут разрушаться, что ведет к характерному повреждению клеток и тканей. Лизосомальные ферменты играют роль в воспалительных процессах. Считается, что такой антивоспалительный агент как кортизон, оказывает свое действие, стабилизируя лизосомальную мембрану.

Микросомальная фракция представляет собой смесь продуктов разрушения эндоплазматического ре - тикулума. В микросомальной фракции находятся ферменты участвующие в биосинтезе холестерина, фосфолипидов, глицеридов. Особенно интересна группа ферментов осуществляющих биотрансформацию ксенобиотиков и эндогенных соединений. Эти реакции важны и в клиническом отношении, так как этим путем выводятся как естественно образующиеся продукты метаболизма (билирубин, гормоны и др.) так и многие чужеродные вещества (например, лекарственные препараты).

В ядре обнаружено около 40 ферментов, многие из которых участвуют в реализации генетической информации.

На скорость выхода ферментов из клеток действует несколько факторов. Во-первых концентрационный градиент (разность концентраций ферментов в клетках и внеклеточной жидкости). Величина концентрационного градиента колеблется для различных ферментов и типов клеток в широких пределах. Соотношение внеклеточной и внутриклеточных активностей в клетках печени для аспартат и аланинаминотрансферазы составляет 1:10000, для сорбитолдегидрогеназы 1:50000. Концентрация лактатдегидрогена - зы в клетках печени примерно в 3000 раз выше, чем вне клеток, а в эритроцитах - только в 200 раз.

Вторым фактором, влияющим на скорость выхода ферментов из клеток, является размер и масса молекул ферментов. Диффузия ферментов происходит тем быстрее, чем меньше размеры и масса молекул. Третий фактор - внутриклеточная локализация ферментов. Наиболее легко при незначительном повреждении клеток в кровь будут выходить ферменты цитоплазмы, тогда как при некрозе клеток будут обнаруживаться ферменты и митохондриальной и ядерной фракций.

Нарастание содержания ферментов в крови зависит от числа и степени повреждения клеток, а также скорости повреждения клеток. Повреждение большого числа клеток в короткие сроки приводит к резкому повышению уровня ферментов в крови. Например, при отравлении четыреххлористым углеродом экспериментальных животных можно получить увеличение активности ферментов «печеночного» пула в десятки и сотни раз вследствие разрушения сразу большого числа клеток. В то же время при циррозе, даже при значительном поражении печени, увеличение активности ферментов в сыворотке крови будет незначительным, так как скорости активного повреждения клеток будут небольшие.

На содержание ферментов крови влияет также скорость удаления их из кровотока. Ферменты небольшой молекулярной массы, типа амилазы могут быть удалены через почки. Однако механизм удаления большинства высокомолекулярных ферментов неизвестен. Очевидно их распад катализируют специфические протеазы, обуславливающие определенную скорость разрушения фермента.

В клинико-биохимических исследованиях чаще всего реализуется первый принцип, т.е. исследуются клеточные ферменты, поступившие в кровь из органов и тканей при патологии. Для исследования активности ферментов используется чаще всего сыворотка или плазма крови. Интерпретация полученных данных основывается обычно на том, что для сыворотки крови характерны низкие значения содержания ферментов, по сравнению с их концентрацией внутри клеток.

Уровень содержания ферментов в клетках отражает процессы биосинтеза и выхода ферментов в кровь при обычном обновлении клеток. Клеточная пролиферация и повышенный ферментативный синтез, повреждения или повышение проницаемости клеточных мембран приводит к усилению выхода ферментов во внеклеточные жидкости, а затем и в кровь. Развивается гиперферментемия.

Значительно реже при патологии происходит уменьшение ферментативной активности в сыворотке крови (гипоферментемия). Это касается тех ферментов, которые будучи синтезированы в каком-либо органе реализуют свою функцию в крови. Например, фермент лецетинхолестеринацилтрансфераза (ЛХАТ) находясь в плазме этерифицирует молекулы холестерина, перенося на них жирные кислоты, находящиеся в р - положении молекулы лецитина. При поражении паренхимы печени активность фермента резко снижается. К числу плазмоспецифических относится также холинэстераза, разрушающая ацетилхолин и родственные ему вещества. При поражении клеток печени, и нарушении их синтетической функции происходит снижение активности этого фермента в сыворотке крови. К этой группе относятся также ферменты свертывающей системы крови синтезируемые в печени и проявляющие свое действие, будучи секретированными в кровь.

Исследования активности органоспецифических ферментов в плазме или в сыворотке используют для решения вопроса о том, какой орган в какой степени затронут патологическим процессом. Некоторые ферменты высокоспецифичны, поэтому увеличение их активности в сыворотке крови позволяет по одному этому признаку сделать правильное заключение о характере заболевания. Например, резкое повышение активности фермента орнитинкарбамоилтрансферазы, который синтезируется только в печени, свидетельствует о поражении гепатоцитов. Трипсин вырабатывается только в поджелудочной железе, поэтому увеличение активности его в крови, свидетельствует о поражении этого органа. Другие ферменты менее специфичны, так как они могут происходить из различных органов и тканей. Органоспецифичность некоторых клинически значимых ферментов представлена в таблице 26.

В клинико-биологических исследованиях широко используют, как те, так и другие ферменты. Определение высокоспецифических ферментов имеет наибольший смысл при дифференциальной диагностике, когда четко сформулирована альтернатива. Однако обратной стороной специфичности является узость. Определяя специфические ферменты, можно подтвердить или опровергнуть только данную гипотезу. Во многих случаях оправданы и менее специфические тесты. Исследуя менее специфические показатели можно сразу вычленить целую группу заболеваний.

Каждая ткань имеет свой ферментный профиль, т.е. набор ферментов наиболее характерных для данного органа или ткани и определенным образом изменяющаяся при патологии. При разрушении клеток и перехода ферментов в кровь может происходить перестройки ферментного профиля ткани связанная с неравномерной отдачей ферментов цитоплазмы и клеточных структур, адсорбцией ряда ферментов на разрушенных тканях, инактивацией и разрушением некоторых ферментов. Потому ферментный спектр сыворотки крови характеризующий ту или иную патологию может отличаться от ферментного профиля ткани.

В клинической ветеринарии использование ферментативных методов диагностики необходимо осуществлять комплексно, путем одновременного определения нескольких ферментов. Диагностическая ценность исследования ферментов при этом значительно повышается. Одновременное использование нескольких ферментов позволяет более полно проводить дифференциальную диагностику.

Каталитическая активность фермента обусловлена его структурой, которая, как и всех белков, определяется последовательностью оснований определенного участка ДНК, которая кодирует данный белок. Поэтому ферментативная активность в клетках следующих поколений зависит от точной транскрипции и трансляции закодированной информации. Однако в результате мутации свойства фермента могут так измениться, что он уже не сможет выполнять свою функцию.

Большинство ферментов в организме синтезируется в избытке, поэтому клиническое проявление фер - ментопатий наблюдается только у гомозигот (т.е. когда и отцовская и материнская хромосомы имеют генетические дефекты).

У гетерозигот, где хотя бы одна из хромосом обеспечивает выработку определенного количества фермента, клинические проявления ферментопатии могут отсутствовать. Это объясняется тем, что большинство мутантных ферментов, вызывающие врожденные пороки метаболизма, наследуются как рецессивные признаки и, следовательно, выражены только у тех особей, которые гомозиготны по мутантному гену.

Для обнаружения ферментопатий чаще всего используют ферменты форменных элементов крови.

Диагностическое значение исследования активности эритроцитарных ферментов значительно уже, чем плазматических. В клинико-диагностических целях ферменты эритроцитов исследуют для выявления тех ферментопатий, с которыми связаны заболевания красной крови. Обычно это гемолитические анемии. Известны гемолитические анемии, вызванные дефектами многих ферментов гликолиза и пентозофосфатного пути. Наиболее хорошо изучены ферментопатии связанные с дефектами ферментов пируваткиназы, гексокиназы, глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы, 6-фосфоглюконатдегидрогеназы.

В некоторых случаях эритроцитарные ферменты используются для диагностики ферментопатий не связанных с патологией красной крови. В этом случае ферменты эритроцитов, служат лишь удобными генетическими маркерами. Например, дефект такого фермента эритроцитов как АТФаза, позволяет диагностировать мышечную дистрофию, фермента галактозо-1-фосфатуридин-трансферазы - галактоземию.

В ряде случаев клинико-биохимических исследований проводится определение изоферментов. Изоферменты - молекулярные формы одного и того же фермента. Они катализируют одну и ту же реакцию, но различаются по физико-химическим свойствам, сродством к субстрату, антигенными и другими свойствами. Множественность форм ферментов обусловлена двумя причинами. К первой следует отнести то, что в организме имеются множественные гены (генетические причины), каждый из которых кодирует свою субъединицу фермента, ко второй - возможность посттрансляционных изменений уже синтезированных субъединиц (ферментов).

Если в клетке синтезируется две и более субъединицы одного энзима и они способны соединяться друг с другом в любых комбинациях, то образуется несколько изоферментов. Изоферменты состоящие из различных субъединиц называются гибридными. Они обладают промежуточными физическими, химическими и другими свойствами. Это хорошо наблюдается при электрофоретическом разделении изоферментов лактатдегидрогеназы, которые состоят из субъединиц двух типов НиМ.

Из них образуются пять тетрамеров - Н4, Н₃М, Н₂М₂, НМ₃, Мф Наиболее высокой электрофоретической подвижностью обладает тетрамер Н4 (ЛДГ-1) наименьшей - ЛДГ-5 (М₄), остальные обладают промежуточной подвижностью. Изоферментный профиль клеток зависит от соотношения синтезируемых в ней субъединиц. Преобладать будут те изоферменты, в которые входят субъединицы содержащиеся в клетке в наибольшем количестве.

Определение изоферментов в сыворотке крови имеет важное диагностическое значение, так как распределение в тканях отдельных изоферментов более специфично, чем общей ферментативной активности. Например, в клинической диагностике довольно широко используется определение активности такого фермента, как щелочная фосфатаза. В сыворотку кровн щелочная фосфатаза поступает в основном из костной ткани, печени, кишок. Поэтому при патологии этих органов активность щелочной фосфатазы будет возрастать и дифференциальную диагностику на основании определения общей активности провести нельзя. Однако «костный» и «печеночный» изоферменты различаются по своей электрофоретической подвижности и температурной устойчивостью, что позволяет проводить их раздельное определение. Увеличение активности, «костного» изофермента свидетельствует о поражении костной ткани, в то время как увеличение «печеночного» - говорит о патологии печени.

Большой интерес для клиники представляет определение изоферментов креатинфосфокиназы. Было доказано, что гибридная форма этого изофермента (MB) в большом количестве содержится только в сердечной мышце. Поэтому определение изофермента креатинфосфокиназы MB довольно специфичный показатель повреждения сердечной мышцы.

Существование изоферментов играет определенную роль в особенностях протекания гликолиза в мышцах и печени. Если в мышцах гликолиз призван обеспечить энергией процесс сокращения, то в печени его функции гораздо сложнее, здесь он более тесно связан с другими метаболическими путями. Из 10 ферментов гликолиза 9 представлены в виде различных изоферментов, причем изоферментные спектры печени и мышц значительно различаются. Фосфофруктокиназа, альдолаза, пируваткиназа существуют в виде «печеночного» типа, которого почти нет в мышцах, и «мышечного» типа, которого очень мало в печени животных. Фермент глюкокиназа характерный для печени, отсутствует в мышцах. Все это свидетельствует о том, что какие-то этапы гликолиза в печени и мышцах протекают по разному и это можно использовать в целях диагностики.

Широко известно изменение изоферментных спектров органов и тканей в ходе онтогенетического развития, что связано с особенностями обмена веществ на отдельных этапах эмбрионального и неонаталь - ного периодов. Изучение изоферментов при злокачественных опухолях показало, что специализированные зрелые формы ферментов заменяются на более ранние эмбриональные формы. Установлено, что при гепатоме, изоферменты альдолазы, характерные для печени взрослого животного заменяются эмбриональными формами. Фермент гексокиназа IV, характерный для зрелых гепатоцитов, в опухолях заменяется на гексо - киназу I и II, характерных для печени эмбриона.

В печени взрослых животных преобладает изофермент пируваткиназа I (печеночный тип) и в небольших количествах содержится пируваткиназа III (почечный тип). Было установлено, что в малодифференцированных быстро растущих опухолях наблюдается обратная картина: количество изофермента I снижается, вплоть до полного исчезновения, тогда как активность изофермента III резко повышается.

Размещено на Allbest.ru