Фенотипические особенности циркулирующих штаммов шигелл

Рисунок 1- Электрофорез в 0,8% агарозном геле плазмид, выделенных из циркулирующих штаммов шигелл

Таблица 4 - Плазмидовары бактерий рода шигелла

Наиболее крупная плазмида размером 210 т.п.н. встречается гораздо чаще в изолятах шигелл Флекснера (24,1%), чем Зоне (9,1%). Штаммы этого вида шигелл содержат также значительно больше разнообразных плазмид, определяющих полирезистентность возбудителей (лишь один из анализированных штаммов нес единственную плазмиду размером 16 т.п.н. Количество копий плазмид в клетках бактерий также значительно варьировало. По ориентировочным оценкам самой высокотиражной является плазмида размером 16 т.п.н. (50-100 копий на клетку). 10-20 копиями представлены плазмиды размером 7,5 т.п.н. и 58 т.п.н. Количество экземпляров плазмид размером 3,0 т.п.н. и 210 т.п.н. не превышает 10.

Обсуждение результатов

Основной проблемой терапии острых бактериальных диарей является высокий уровень резистентности шигелл к антибактериальным препаратам, причем ведущие позиции в формировании антибиотикорезистентности занимает S.flexneri. В наших исследованиях этот вид шигелл оказался устойчивым к 8 из 14 использованных препаратов (Am, Te, Ri, St, Fu, Er, Cb, Do). Менее 20% всех изолятов S.flexneri были чувствительны к хлорамфениколу и гентамицину. S.sonnei были устойчивы к 7 из 14 препаратов (Am, Te, Ri, Fu, Er, Cb, Do). Полирезистентность шигелл обусловлена широким применением этих антимикробных препаратов в терапии острых кишечных инфекций в 70-80-е годы. В связи с этим следует считать неоправданным применение указанных препаратов для эмпирической терапии шигеллезов, хотя подобные рекомендации еще встречаются в литературе [8,9]. Аналогичные рекомендации относятся и к канамицину. Хотя почти все штаммы были чувствительными к этому препарату, подавляющие рост концентрации оказались неприемлемо высокими.

Аминогликозид 2-го поколения - гентамицин - широко использовался для этиотропной терапии шигеллезов в период эпидемического подъема заболеваемости дизентерией Флекснера в середине 90-х годов. Это привело к появлению штаммов, устойчивых к этому препарату. В наших исследованиях доля чувствительных штаммов шигелл обоих видов к гентамицину была одинаково низкой. Хотя ингибирующие in vitro рост этих штаммов концентрации антибиотика достаточно низкие, вряд ли следует считать целесообразным применение гентамицина для лечения шигеллезов.

Чувствительность к хлорамфениколу у половины штаммов S.sonnei и 18% штаммов S.flexneri сохранена. Однако диапазон МПК для разных штаммов составляет почти два порядка, причем большинство чувствительных штаммов отвечает на концентрации Са 100 мг/л и выше, что также делает бесперспективным использование этого препарата для терапии шигеллезов. Отмечена умеренная чувствительность (около 30% всех штаммов) шигелл к цефазолину. Известно, что этот антибиотик ингибирует транспептидазу бактериальной клетки, приводя к деградации бактериальной стенки и гибели бактерий.

Проведенный нами анализ выявил фенотипическую неоднородность природных популяций шигелл. Всего отмечено 17 фенотипов резистентности. Очевидно, основу фенотипического разнообразия шигелл составляет геномный (включая внехромосомные гены) полиморфизм данных бактерий, позволяющий отбирать из гетерогенных бактериальных популяций клоны с определенными гено- и фенотипами, адекватными специфическим условиям среды обитания микроорганизмов. Это подтверждается тем обстоятельством, что штаммы, выделенные из одного экотопа, имели однотипный фенотип резистентности. С этих позиций фенотип шигелл следует рассматривать как итог не только генетической, но и экологической детерминации.

Высокая чувствительность бактерий обнаружена к тем антимикробным препаратам (фторхинолонам, макролидам 2-го поколения), которые в предшествующие годы мало использовались для лечения шигеллезов или не использовались вовсе. Подтверждена высокая чувствительность шигелл к фторированным хинолонам (МПК50 примерно 0,03 мг/л), что совпадает с имеющимися в литературе данными [10]. Однако если 5-6 лет назад все 100% изолятов шигелл были чувствительны к препаратам этого ряда, то в данном исследовании чувствительными к ципрофлоксацину и офлоксацину оказались 84% и 71% штаммов. В настоящее время фторхинолоны по частоте использования в инфекционной патологии стоят на втором месте после -лактамовых антибиотиков. В отличие от других антибактериальных препаратов факторы резистентности к ФХ не переносятся при помощи плазмид. Резистентность к ним формируется вследствие хромосомных мутаций двух типов: мутации ДНК-гиразы (мишени фторхинолонов) и мутации клеточных мембран, препятствующей проникновению препарата в бактериальную клетку. Тем не менее наши исследования свидетельствуют о появлении устойчивых к ФХ штаммов шигелл. Тревожным обстоятельством является факт появления изолятов, резистентных к офлоксацину, во всем диапазоне использованных в опыте концентраций препарата. Данный факт еще не нашел отражения в литературе.

Установлено, что наиболее высокой ингибирующей активностью обладает макропен -- препарат из группы макролидов 2-го поколения. Его эффективность обусловлена тем, что препарат связывается с большой (50S) субъединицей бактериальных рибосом и блокирует тем самым синтез белка. МПК50 макропена составляет 0,015 мг/л, а диапазон МПК - 0,015-0,03 мг/л, что позволяет рекомендовать макропен как препарат выбора для лечения шигеллезов.

Анализ терморезистентности шигелл показал, что в бактериальной популяции быстро растет доля штаммов, обладающих высокой устойчивостью к температурному фактору. Если в 1996-2000 гг. среди S.flexneri преобладали (81,7%) среднечувствительные изоляты [3], то в данном исследовании лишь 10% шигелл этого вида были оценены как среднечувствительные. 89% всех изолятов сохраняли жизнеспособность после прогревания в течение 45 мин. Даже 20-секундная экспозиция при 90оС вызывала гибель лишь 30% штаммов Shigella spp.

Изменения биологических свойств шигелл продолжаются последние два десятилетия. При этом модулируются свойства, способствующие выживаемости шигелл в среде in vivo (повышается резистентность бактерий к действию температурного фактора, дезинфицирующим средствам, противомикробным препаратам и т.д.). Такое повышение резистентности шигелл к различным факторам среды следует рассматривать как свидетельство перехода микробной популяции от фазы эпидемического распространения к фазе резервации, в том числе в форме резидентного бактерионосительства, что сопровождается также снижением патогенности и вирулентности шигелл. Это приводит к резкому падению числа тяжелых случаев инфекции, росту среднетяжелых и особенно легких случаев заболевания. В результате значительное количество заболевших не госпитализируется и не регистрируется, что искажает истинную картину протекающего эпидемического процесса. Лишь часть его остается доступной для наблюдения и анализа. Некоторые из наблюдаемых изменений биологических свойств шигелл детерминируются плазмидами, распространенность которых в бактериальной популяции обусловлена селективным давлением антибиотикотерапии. Другие, такие, как терморезистентность, кодируются генами теплового шока и другими хромосомными генами. Сегодня отсутствует логическое объяснение причин такого резкого изменения фенотипа шигелл. Можно думать об изменениях уровня экспрессии ряда генов микроорганизмов, способствующих выживанию вида в изменившихся условиях среды обитания. Однако эти изменения биологических свойств шигелл необходимо учитывать при разработке противоэпидемических мероприятий и технических условий обработки пищевых продуктов.

При исследовании циркулирующих штаммов шигелл обнаружен ряд гетерогенных по размеру плазмид, содержащих от 2,7 т.п.о. до 210 т.п.о. Сходные результаты получены и другими авторами [1,2]. Полагают, что мелкие плазмиды кодируют множественную лекарственную устойчивость, а самая крупная плазмида детерминирует значительную часть свойств, определяющих вирулентность и патогенность микроорганизмов. Показано, например, что она кодирует группу белков-инвазинов наружной мембраны бактериальной клетки с молекулярной массой 38 кД, 43 кД, 62 кД и 78 кД [2]. Они обусловливают способность возбудителя прикрепляться к эпителиальным клеткам кишечника с последующим внутриклеточным инфицированием. Считается, что тяжесть течения заболевания зависит от уровня экспрессии этих белков и адекватности иммунного ответа (титра антител к белкам-инвазинам). Скорость распространения плазмид полирезистентности особенно велика у донорских штаммов, несущих конъюгативные F-плазмиды [8]. В результате в микробной популяции начинают преобладать селекционированные полирезистентные изоляты шигелл. Плазмидные профили являются достаточно индивидуальной штаммовой характеристикой, определяющей один из фенотипических признаков возбудителя. Микробиологический мониторинг с использованием данных плазмидного анализа имеет важное значение в системе эпидемиологического надзора за инфекцией в пределах региона, позволяя целенаправленно проводить профилактические мероприятия.

Summary

The purpose of the study - to determine the sensitivity of Shigella spp. to antimicrobial drugs, and high temperature and the contents of plasmids in circulating shigella strains. A total of 224 strains of S.flexneri and 106 strains of S.sonnei isolated in Sumy region of Ukraine during 1996-2003 years were tested to 19 antimicrobials: ampicillin (Am), tetracyclin (Te), rifampicine (Ri), chloramphenicol (Ca), streptomycin (St), fusidin (Fu), кanamycin (Кn), erythromycin (Er), carbenicillin (Cb), doxicyclin (Do), gentamycine (Ge), ofloxacin (Of), cefazolin (Cf), ciprofloxacin (Cp). High rate of resistance were found in both S.flexneri and S.sonnei to: Am (100%), Te (100%), Cb (90 and 50% respectively), Do (90 and 35% respectively), Fu (100%), Er (100%), Ri (100%), Ca (71,8 and 45% respectively), St (81 and 40% respectively). Some isolates were resistant to ftorchinolones. All examined strains except one had not hemolytical activity. 89% of shigella strains were resistant to 70oC at 45 min exposition. 30% isolates stay viability during 20 sec heating at 90oC. All strains have some variable in size plasmids.

Список литературы

1. Курагин Э.С. Межбольничное распространение Shigella Flexneri 2A // Журн.микробиол.-1998.-№ 3.-С.31-35.

2. Шахмарданов М.З. Инвазивные свойства возбудителя в патогенезе шигеллеза Флекснера 2А // Эпидемиол.инфек.болезни.-2000.- № 1.-С.25-28.

3. Липовская В.В.,Савинова Е.М.,Дьяченко А.Г. Селективные свойства патогенных энтеробактерий и их значимость как эпидемиологических маркеров // Доповіді НАН України.-2000.-№6.-С.176-180.

4. Лабораторные методы исследования в клинике / Под ред. В.В.Меньшикова. - М.: Медицина, 1987. - С.341.

5. National Committee for Clinical Laboratory Standards. Methods for dilutionantimicrobial susceptibility tests for bacterial that grow aerobically; approvedstandard - 5th ed. NCCLS.

6. Круглов Ю.В. Определение терморезистентности культур энтеробактерий // Труды VII

Украинского микробиол. о-ва. - Черновцы, 1983. - Т.2. - 15 с.

7. Девис Р., Ботстайн Д., Дж.Рот. Генетика бактерий.- М: Мир, 1984. - 176с.

8. Flores A., Araque M., Vizcaya L. Multiresistant Shigella species isolated frompediatric patients with acute diarrhoeail disease// Am.J.Med.Sci.-1998.-V.316.- P.379-384.

9. Kotloff K.L. Shigellosis. In: F.D.Burg, E.R.Wald, J.R.Ingelfinger, R.A.Polin,eds. Current Pediatric Therapy. Phil., Saunders, 1999. - P.49-51.

10. Document M7-A4, 2000. - Р.20(2).

11. Посохова К.А., Вікторов О.П., Мальцев В.І., Шараєва М.Л. Фторхінолони//Новости мед.и фармац.-2004.-№ 1(141).-С.22-24.