Следовательно, острая динамическая интоксикация летучими компонентами ЭС ЭД-20 реализуется их способностью ингибировать ферментную монооксигеназную систему как в первой фазе биотрансформации - этапе N-деметилирования тест-препарата амидопирина, так и во второй фазе - при его конъюгации с уксусной кислотой и образовании ацетильного конъюгата.

С целью подтверждения ингибирования монооксигеназной гидроксилирующей системы печени летучими компонентами ЭС ЭД-20 нами в отдельной серии опытов изучено их влияние на продолжительность гексеналового сна животных, результаты которых представлены в табл. 2. Показано, что продолжительность гексеналового сна у интактных животных колеблется в интервале 23,621,83 - 28,571,54 минуты.

В изучаемых условиях эксперимента уже в первые 6 и 12 часов от момента извлечения животных из камеры происходило достоверное увеличение длительности гексеналового сна на 27-30%. В дальнейшем (72 ч) отмечается пик увеличения продолжительности гексеналового сна (в 3,9 раза) в сравнении с интактными животными, что в полной мере коррелирует с данными по определению уровня метаболитов амидопирина и свидетельствует о максимальном угнетении НАДФН-зависимой монооксигеназной системы печени и, возможно, цитохрома Р-450 [17].

Через 120 часов отмечается некоторое восстановление детоксицирующей функции печени, что находит свое подтверждение в снижении продолжительности гексеналового сна в 1,2 раза по сравнению с таковой, регистрируемой на 72-часовой отметке, однако при этом продолжая оставаться в 2,8 раза выше, чем в группе интактных животных.

Таким образом, изучение продолжительности гексеналового сна животных еще раз подтверждает тот факт, что острая динамическая интоксикация летучими компонентами ЭС ЭД-20 в значительной мере снижает активность детоксицирующих систем печени.

Анализируя результаты исследования содержания метаболита амидопирина - 4-ААП в моче, видно, что применение кверцетина достоверно усиливает экскрецию с мочой данного продукта превращения амидопирина по сравнению с группой контрольных крыс как через 6, так и через 24 часа после посадки животных в обменные клетки на 104 и 94% соответственно. В этих же условиях эксперимента действие препарата приводило и к усилению реакций II фазы биотрансформации - ацетилирования, то есть присоединения к молекуле 4-ААП ацетата при участии ацетил-КоА. Уровень N-ац-4-ААП возрастал под влиянием биофлавоноида в первый срок исследования на 133%, а во второй срок - на 66%. Однако, несмотря на столь высокую эффективность кверцетина при интоксикации ЭС, изучаемые показатели состояния монооксигеназной системы все же остаются на 23-42% достоверно ниже таковых, регистрируемых у интактных животных (табл. 1).

Действие флавината, примененного по лечебно-профилактической схеме, сопровождалось заметно более выраженным влиянием на реакции N-деметилирования, чем ацетилирования. Так, если через 6 и 24 часа экскреция 4-ААП с мочой возрастала соответственно в 2,2 и 2,4 раза по сравнению с контролем и была статистически не достоверной по отношению к интактным животным, то выведение N-ац-4-ААП увеличивалось только в 1,8 и 1,4 раза (табл. 1). Возможно это связано с участием флавината в виде ФАД и ФМН в составе НАДФН-цитохром Р-450-редуктазы. Известно, что НАДФН-цитохром Р-450-редуктаза служит переносчиком электронов с восстановленного НАДФ на цитохром Р-450 и таким образом участвует в первом этапе метаболизма жирорастворимых ксенобиотиков - микросомальном гидроксилировании [7].

Что касается липина, то этот препарат в условиях острой интоксикации летучими компонентами ЭС, судя по динамике и выраженности воздействия на НАДФН-зависимую монооксигеназную гидроксилирующую ферментную систему печени, был сравним с флавинатом и также увеличивал в большей степени реакции первой фазы биотрансформации до уровня, регистрируемого у интактных животных (р1>0,1-0,5) (табл. 1).

Столь выраженный эффект липина свидетельствует о важной роли фосфатидилхолиновых липосом в функционировании микросомальных монооксигеназ. По-видимому, липин способен стабилизировать фосфолипидный слой микросом. Последний обеспечивает поддержание каталитической активности монооксигеназной системы и участвует в прикреплении ее компонентов к мембранам гладкой эндоплазматической сети [13].

Фосфолипиды также влияют на конформационные изменения молекулы цитохрома Р-450 и ее стабилизацию [14].

Следует отметить, что по степени влияния на динамику экскреции метаболита амидопирина 4-ААП у отравленных животных флавинат и липин превосходили кверцетин. Кверцетин, в свою очередь, проявлял гораздо большую активность при биологическом ацетилировании 4-ААП как чужеродного амина до N-ац-4-ААП.

Токсическое действие ЭС связывают, как правило, с их окисляющей способностью, легкостью отщепления ими свободных радикалов, а также с окислением ряда ферментов, содержащих тиоловую группу, в том числе цитохрома Р-450 [5].

Для реактивации сульфгидрильных групп цитохрома Р-450 и других ферментов при отравлении летучими компонентами ЭС ЭД-20 мы применили широко известный антидот тиоловых ядов - ацетилцистеин. Как видно из табл. 1, под влиянием этого препарата содержание 4-ААП в моче возрастало через 6 часов на 93%, а через 24 часа - на 82%, что было ниже, чем при использовании по лечебно-профилактической схеме кверцетина, флавината и липина.

В то же время концентрация N-ац-4-ААП в моче в результате действия ацетилцистеина была наиболее высокой. По сравнению с контролем она возрастала в первый срок исследования на 246%, а во второй - на 97% и практически не отличалась от таковой у интактных крыс (р1>0,1-0,25). Этот факт свидетельствует о том, что под влиянием ацетилцистеина в условиях острого ингаляционного воздействия на организм летучих компонентов ЭС в большей степени тормозится нарушение реакций II фазы биотрансформации.

Наиболее слабый эффект в условиях изучаемой патологии наблюдался при использовании в качестве антидотно-лечебного средства никотинамида. Применение никотинамида за 5 часов до начала интоксикации и через 5 минут после ее окончания сдерживало уменьшение экскреции 4-ААП на 54 и 26%, а N-ац-4-ААП - на 40 и 15% соответственно через 6 и 24 часа после посадки животных в обменные клетки (табл. 1).

Таким образом, в опытах на целостном организме установлено, что кверцетин, флавинат, липин, ацетилцистеин и никотинамид обладают способностью в разной степени усиливать и ускорять процессы обезвреживания ксенобиотиков за счет реакций I и II фаз биотрансформации, что реализуется активацией экскреции с мочой метаболитов амидопирина в условиях острой динамической интоксикации летучими компонентами ЭС. Флавинат и липин при отравлении ЭС усиливают в большей мере реакции I фазы метаболизма ксенобиотиков, а ацетилцистеин - II фазы. По степени влияния исследуемых лекарственных препаратов на экскрецию с мочой 4-ААП их можно расположить в порядке уменьшения активности в следующем порядке: липин = флавинат > кверцетин > ацетилцистеин > никотинамид, а на экскрецию N-ац-4-ААП - ацетилцистеин > кверцетин > флавинат > липин > никотинамид.

Для более корректного и полного представления о функционировании монооксигеназной системы организма животных в условиях острого отравления летучими компонентами ЭС и лечебно-профилактического применения изучаемых лекарственных средств представлялось целесообразным исследовать влияние препаратов на продолжительность гексеналового сна.

Из таблицы 2 следует, что применение кверцетина за 3 часа до помещения животных в камеру и спустя 5 минут после их извлечения уменьшает продолжительность гексеналового сна через 6, 12, 72 и 120 часов от момента последнего введения препарата на 12, 14, 35 и 20% соответственно. Однако если в первых два срока эксперимента имеющиеся отличия в величинах изучаемого показателя в сравнении с группой интактных крыс не носят достоверного характера, то в последующие сроки (72 и 120 ч) сохраняется достаточно высокий уровень достоверности (р1<0,001). Продолжительность гексеналового сна, несмотря на лечение, еще остается выше, чем у интактных животных, на 156% (72 ч) и 123% (120 ч).

Применение в этих условиях флавината сопровождалось похожей с кверцетином динамикой изменений, но характеризовалось более выраженным и достоверным во все сроки исследования действием (р2<0,02-0,001). Под воздействием флавината длительность гексеналового сна у отравленных животных на 6 часовой отметке была почти на 29% меньше, чем в контроле, и на 10%, - чем у интактных животных, а на 12 часовой отметке - на 21% ниже, чем в контрольной группе животных.

В дальнейшем, по истечении 72 и 120 часов с момента окончания затравки уменьшение изучаемого показателя составило 46 и 32%, но было выше, чем у интактных животных, на 113 и 89%, что тем не менее значительно меньше, чем в аналогичные сроки у кверцетина (табл. 2).

Действие липина через 6 и 12 часов после завершающего введения отравленным животным препарата практически не отличалось от такового у флавината, но заметно снижалось через 72 и 120 часов. Так, если под влиянием липина продолжительность гексеналового сна по сравнению с контролем спустя 6 и 12 часов уменьшалась на 24 и 27% и не отличалась от таковой у интактных крыс (р1>0,5), то через 72 и 120 часов регистрируемое уменьшение длительности сна было не больше 15 и 7% соответственно, а отличия с интактными животными составляли 236 и 161% (табл. 2).

Эти результаты могут служить, в определенной степени, экспериментальным обоснованием более длительного применения липина в условиях острой интоксикации ЭС.

Таблица 2 - Влияние исследуемых лекарственных средств на длительность гексеналового сна (в минутах) в белых крыс при острой динамической ингаляционной интоксикации летучими компонентами ЭС ЭД-20 (М±m, n=8-10)

Применение по лечебно-профилактической схеме ацетилцистеина практически полностью сдерживало возникновение нарушений продолжительности гексеналового сна у отравленных животных в первые 12 ч после интоксикации (р1>0,5).

Характерно, что в отличие от липина действие этого SH-содержащего препарата было более продолжительным во времени. Длительность гексеналового сна под влиянием ацетилцистеина уменьшалась по сравнению с контролем через 72 часа на 45%, а через 120 часов - на 28% и была сопоставимой с аналогичным эффектом в эти же сроки у флавината (табл. 2). Эти факты указывают на целесообразность комбинированного использования липина с ацетилцистеином либо флавинатом, что может значительно усилить и продлить их влияние на монооксигеназную систему организма при отравлении летучими компонентами ЭС.

Следовательно, анализируя результаты влияния применяемых лекарственных средств на состояние монооксигеназной системы печени в условиях острого отравления ЭС с помощью гексеналовой пробы, можно заключить, что флавинат, липин, ацетилцистеин, в несколько меньшей степени кверцетин в первые 12 часов после отравления сдерживают развитие нарушений в НАДФН-зависимой гидроксилазной системе печени. Через 72 и 120 часов после интоксикации эффективность фармакотерапии в условиях заметного увеличения продолжительности гексеналового сна была недостаточной, особенно при использовании в качестве антидотно-лечебного средства липина.

Ранее нами доказана высокая эффективность при остром смертельном отравлении ЭХГ индукторов микросомальной и цитозольной ЭГ клофибрата и омепразола [2, 4].

Учитывая это, представляло интерес изучить влияние указанных препаратов на активность НАДФН-зависимой монооксигеназной гидроксилирующей ферментной системы печени у здоровых крыс и при остром воздействии на организм животных летучих компонентов ЭС.

Как показывают результаты, представленные в таблице 1, введение интактным животным клофибрата и омепразола в дозах, вызывающих индукцию ЭГ, оказывало противоположное влияние на степень экскреции метаболитов амидопирина с мочой. Так, если под влиянием клофибрата через 6 и 24 часа после посадки животных в обменные клетки экскреция 4-ААП увеличивалась на 33 и 27%, N-ац-4-ААП - на 18 и 21%, то под влиянием омепразола эти показатели напротив уменьшались соответственно на 53%, 48% и 59%, 43%. Аналогичная картина наблюдалась при исследовании влияния изучаемых препаратов на продолжительность гексеналового сна у интактных крыс (табл. 2). Применение клофибрата достоверно снижало время гексеналового сна у здоровых животных через 6 часов после последнего введения препаратов на 39%, 12 часов - на 53%, 72 часа - на 38%. Изменение этого показателя на 18% (р1>0,1) через 120 часов следует расценивать как тенденцию к уменьшению. Действие омепразола характеризовалось увеличением продолжительности сна на 44% (р1<0,001), 35% (р1<0,02), 40% (р1<0,01) и 13% (р1>0,1) соответственно через 6, 12, 72 и 120 часов.

Фармакотерапевтическая активность клофибрата при острой интоксикации летучими компонентами ЭС характеризовалась достоверным увеличением экскреции 4-ААП с мочой в 2,1-2,5 раза, а N-ац-4-ААП - в 1,3-2,2 раза. Тем не менее несмотря на столь выраженное действие, параметры изучаемых показателей I и II фаз биотрансформации, за исключением 4-ААП на 6 часовой отметке, оставались достоверно ниже таковых, регистрируемых у интактных животных. Омепразол, примененный в дозах, вызывающих индукцию ЭГ, практически не оказывал влияния на экскрецию с мочой метаболитов амидопирина при остром отравлении ЭС (p2>0,1-0,5) (табл. 1).

Изучение гексеналового сна в условиях изучаемой патологии под влиянием клофибрата характеризовалось уменьшением его продолжительности в среднем на 11-34%.

Использование же омепразола не влияло на длительность гексеналового сна через 6 и 24 часа от момента завершения ингаляционной затравки животных, но уменьшало величину этого показателя через 72 и 120 часов на 52 и 36% соответственно, что значительно больше, чем при действии клофибрата (табл. 2).

Таким образом, судя по уровню экскреции с мочой метаболитов амидопирина и продолжительности гексеналового сна, можно сделать заключение, что клофибрат обладает способностью индуцировать, а омепразол - угнетать активность микросомальных оксигеназ со смешанными функциями в печени животных.

Индуцирующее действие клофибрата при токсическом поражении печени летучими компонентами ЭС ЭД-20 проявляется усилением реакций I и II фаз биотрансформации и уменьшением времени гексеналового сна.

Действие омепразола в условиях патологии не влияет на уровень экскреции с мочой метаболитов амидопирина, но значительно сокращает продолжительность гексеналового сна в поздние сроки после интоксикации, что, по-видимому, свидетельствует о восстановлении функции ранее ингибированных и структурно сохраненных, не поврежденных эпоксидами микросомальных ферментов.

Изучение при острой интоксикации ЭС эффективности клофибрата и омепразола, проведенное нами ранее, показало, что омепразол проявляет хорошо выраженные детоксицирующий и гепатопротекторный эффекты, а действие клофибрата проявляется слабо и статистически не достоверно [19].

Возможно, это связано со способностью клофибрата, помимо индукции ЭГ, достаточно сильно индуцировать и цитохром Р-450 [28].

Так, известно, что при осуществлении реакций I фазы биотрансформации на этом гемопротеиде происходит генерация супероксидного аниона О2- [7], синтезируются из линолевой кислоты лейкотоксин и изолейкотоксин [21, 23], происходит образование эпоксидов из липотропных эндо- и экзогенных соединений, содержащих в своей структуре двойные связи [7, 10, 30, 31], которые весьма токсичны для клетки. Лейкотоксин и эпоксиды, например, способны активировать митохондриальную проходимость, что заканчивается выходом цитохрома С и последующей смертью клетки [21, 23].

Кроме того, имеются сведения о наличии связи между усилением функционирования микросомальных монооксигеназ и стимулированием перекисного окисления липидов.

Например, индукция с помощью повторных введений фенобарбитала ферментов микросомального окисления, в том числе цитохрома Р-450, приводит к 2-5-кратному увеличению продукции малонового диальдегида [7, 12] и резкому повышению токсичности ЭХГ [2].

В то же время, в отличие от фенобарбитала, клофибрат наряду с индукцией цитохрома Р-450 [28] обладает хорошо выраженными антирадикальными и антиокислительными свойствами [6], повышает в печени активность глутатионпероксидазы, Г-S-Т, ЭГ, увеличивает содержание во фракции цитозоля не связанных с белками SH-групп [4, 24, 29], что вместе, несмотря на слабое гепатопротекторное действие, возможно, и определяет его интегральный ответ, который заключается в увеличении выживаемости животных при остром смертельном отравлении ЭХГ [2]. К этому можно добавить и то, что цитозольная ЭГ печени индуцируется клофибратом 5 раз и практически не индуцируется фенобарбиталом [22].

Хорошо выраженные детоксицирующие и гепатопротекторные эффекты у производного бензимидазола омепразола [2, 19] связаны, на наш взгляд, с одновременной индукцией этим препаратом ЭГ [4] и снижением активности монооксигеназной системы печени, включая ингибирование ее конечного акцептора - цитохрома Р-450 [26, 35].

Подтверждением этого предположения служат результаты western иммуноблоттинг-анализа, которые показали, что аллилтиобензимидазол наряду с индукцией микросомальной ЭГ и Г-S-Т не только не изменял уровень цитохромов Р-450 1А2, Р-450 2В1/2 и Р-450 2Е1, но приводил к заметному уменьшению содержания цитохрома Р-450 2С11.

Такое действие аллилтиобензимидазола сопровождалось частичным гепатозащитным и противонекрозным действием при ацетаминофен-индуцированном поражении печени [27, 33].

С другой стороны, предварительное, до отравления гепатотоксичными ксенобиотиками, введение индукторов цитохромов Р-450 и Р-448 может резко потенцировать некрозогенное действие гепатотоксинов за счет повышения образования свободнорадикальных высокореакционных метаболитов [8], что, возможно, имеет место при использовании клофибрата, но частично нивелируется за счет его антиоксидантных свойств [6].

ВЫВОДЫ РАБОТЫ И ПЕРСПЕКТИВЫ ДАЛЬНЕЙШИХ ИССЛЕДОВАНИЙ

Обобщая материалы настоящих исследований, можно заключить, что при остром токсическом поражении печени летучими компонентами ЭС происходит угнетение реакций I и II фаз биотрансформации липотропных соединений.

Флавинат, липин, ацетилцистеин, в несколько меньшей степени кверцетин, применяемые по лечебно-профилактической схеме, в первые 12 часов после отравления сдерживают развитие нарушений в НАДФН-зависимой гидроксилазной системе печени.

В более поздние сроки, в условиях увеличившейся продолжительности гексеналового сна, эффективность этих препаратов, особенно липина, снижается.

Действие липина и флавината больше проявляется в уменьшении отрицательного влияния ЭС на реакции I фазы метаболизма чужеродных соединений, а ацетилцистеина и кверцетина - II фазы.

Влияние никотинамида на НАДФН-зависимую монооксигеназную гидроксилирующую ферментную систему печени в условиях развивающейся патологии выражено слабо.

Индуктор ЭГ омепразол снижает активность печеночных оксидаз со смешанной функцией, тогда как клофибрат индуцирует их активность.

Применение клофибрата до острой интоксикации ЭС частично предупреждало возникающие нарушения в функционировании монооксигеназной системы печени.

Предварительное воздействие омепразолом не оказывало влияния на экскрецию метаболитов амидопирина с мочой, но значительно уменьшало длительность гексеналового сна в поздние сроки после отравления ЭС.

Полученные нами результаты по исследованию лекарственных препаратов, модифицирующих метаболизм ксенобиотиков при остром отравлении ЭС, открывают перспективы для поиска новых средств профилактики и лечения отравлений, в том числе комбинированной фармакотерапии.

В этом плане заслуживают внимания исследования по комбинированному применению ацетилцистеина с липином или флавинатом при токсическом поражении печени ЭС.

SAMMARY

In the experiments on the white rat-males line Wistar - showed, that in acute toxic liver disease by the flying compounds of the epoxyde resine ED-20 (ER) occurs oppression of reactions for the first and second phases of biotransformation of lipotropic substances.

Flavinate, lipine, acetylcysteine and quercetine in a bit slighter degree, used according to the treat-preventing scheme in first 12 hours after poisoning restrain evolving the breach in NADPH-depend hydroxilase system of liver. In later terms, in the conditions of increasing the hecsenal sliep - the efficacy of these medicines, expecially lipine is decreasing. Action of lipine and flavinate more expressive in decreasing of negative ER influence on the reactions of the first phase metabolism of foreign substances and acetylcysteine and quercetine - of the second phase. Influence of nicotinamide on the NADPH-depend monooxihenase hydroxilative enzyme system of liver in the conditions of developed pathology slightly shown.

The inductor of epoxihydrolase - omeprasol - decrease the activity of liver oxidases with mixes function, while clofibrate inducts this activity. Using clofibrate before the acute intoxication by ER partialy prevented appearing breaches in the liver monooxihenase system functioning. The preliminary action of omeprasole hadn't an influence on the excretion of amidopirine metabolits with urine, but essentially decrease the protraction of hecsenal sliep in the later terms after the ER poisoning.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ