30

МУЗ «Первая городская клиническая больница скорой медицинской помощи»

СЕВЕРНЫЙ ГОСУДАРСТВЕННЫЙ МЕДИЦИНСКИЙ УНИВЕРСИТЕТ

КУРС КЛИНИЧЕСКОЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ДИАГНОСТИКИ

Руководитель курса

Проф. Воробьёва Н. А.

Лабораторная диагностика дифтерии

Выполнила

врач-интерн КДЛ

Петрова Л. В.

г. Архангельск

2009 г.



Введение

Дифтерия - инфекционное заболевание, вызываемое токсино продуцирующими штаммами Corynebacteriura diphtheriae, передающееся преимущественно воздушно-капельным путем, протекающее с поражением верхних отделов дыхательных путей, реже кожных покровов. Действие токсина приводит к дегенерации периферических нервов, сердечной мышцы и других тканей.

Клиническая диагностика манифестных форм дифтерии не представляет существенных сложностей. Однако у привитых лиц дифтерия может протекать в легкой форме или скрыто в виде бактерионосительства, что существенно затрудняет ее дифференциальную диагностику с другими инфекционно-воспалительными процессами респираторного тракта.

Решающее значение для подтверждения клинического диагноза дифтерии имеет лабораторная диагностика.



Характеристика возбудителя дифтерийной инфекции

Возбудителем дифтерийной инфекции являются токсигенные Corynebacterium diphtheriae. Нетоксигенные коринебактерии дифтерии не вызывают дифтерийную инфекцию. "Этиологическая" значимость этих микроорганизмов при неинфекционной патологии (фарингит, артрит, эндокардит и др.) требует специальных доказательств. При выделении нетоксигенных штаммов C.diphtheriae от больных с подозрением на дифтерийную инфекцию следует обратить внимание на правильность проведения бактериологического исследования и оценку токсигенных свойств.

В основе способности C. diphtheriae вырабатывать экзотоксин лежит феномен фаговой (или лизогенной) конверсии. Конверсия нетоксигенных штаммов C. diphtheriae в токсигенные и наоборот воспроизводится только в экспериментальных условиях. В тех случаях, когда при первичном посеве исследуемого материала от больных дифтерией выделяют токсигенные, а при повторных обследованиях после лечения антибиотиками - нетоксигенные коринебактерии дифтерии, можно предположить, что при использовании антибиотиков в первую очередь исчезают токсигенные штаммы, как более чувствительные к их действию, а нетоксигенные штаммы продолжают выделяться. Такое же положение может создаваться и при санации антибиотиками бактерионосителей, одновременно выделяющих токсигенные и нетоксигенные коринебактерии дифтерии. Обнаружение у таких носителей при повторных обследованиях только нетоксигенных штаммов нельзя трактовать как утрату способности штаммов продуцировать экзотоксин.

Все микроорганизмы рода Corynebacterium являются грамположительными палочками, не образующими спор, обладающими различной степенью полиморфизма. Большинство видов лучше растет в аэробных условиях.

Обычно колонии микроорганизмов из рода коринебактерий на плотных питательных средах ( на кровяном агаре) имеют серовато - белую или желтоватую окраску, непрозрачные или полупрозрачные, округлой формы, диаметром 1-3 мм. Чаще всего они бывают мягкой, маслянистой консистенции, некоторые виды рода коринебактерии могут образовывать шероховатые R-колонии. Представители этого рода не отличаются высокой ферментативной активностью. C.diphtheriae растут при 37 град. C, устойчивы к низкой температуре, чувствительны к высокой. Все дезинфицирующие вещества в обычных концентрациях (3-5%) уничтожают коринебактерии дифтерии в течение 20-30 минут. Токсигенные C.diphtheriae более чувствительны к антибиотикам, чем нетоксигенные. Возможно появление устойчивых к антибиотикам штаммов.

Для C.diphtheriae характерен полиморфизм - разнообразие размеров и формы клеток. Клетки имеют форму булавы, ракетки, овода и т.д. Взаиморасположение клеток напоминает римские цифры X, V. При окраске часто обнаруживается выраженная внутриклеточная исчерченность, что объясняется наличием зерен волютина. Описано сродство волютина к метиленовому синему и, при обработке этим красителем, гранулы или полоски (скопления гранул) прокрашиваются в синий цвет, а протоплазма в отдельных случаях может приобрести розовый оттенок. Использование в бактериологической практике окраски по Граму является нецелесообразным, поскольку клетки C.diphtheriae легко обесцвечиваются спиртом и могут выглядеть в мазке грамвариабельными или даже грамотрицательными.

Для C.ulcerans и C.pseudodiphtheriticum характерна склонность к параллельному расположению клеток. 24-48-часовые культуры этих видов имеют чаще всего овоидную форму клеток.

По форме колоний и некоторым биохимическим свойствам C.diphtheriae подразделяют на культурально - биохимические варианты - gravis, mitis, intermedius.

Через 48-72 часа роста вариант mitis образует колонии S-типа - гладкие, диаметром 1-2 мм; S-R-колонии варианта gravis обычно выпуклые, с приподнятым центром, диаметром 2-3 мм; колонии варианта intermedius - S-типа, мелкие, плоские, гладкие, с ровным краем, диаметром 0,5-1 мм. Биовар intermedius встречается редко и по биохимическим свойствам не отличается от биовара mitis.

На кровяных теллуритовых средах через 48 часов роста колонии C.diphtheriae варианта gravis, как и колонии C.ulcerans, черные, матовые имеют радиальную исчерченность. Колонии C.pseudodiphtheriticum имеют характерный светлый ободок.

Определение токсигенных свойств проводится бактериологами в первые сутки роста подозрительных колоний на чашках первичного посева материала. Во избежание ошибок при определении токсигенных свойств коринебактерий, необходимо изучать данный признак у максимального числа выросших колоний с чашек первичного посева.

Ферментативная активность микроорганизмов изучается путем определения ферментов цистиназы, уреазы, способности расщеплять до кислоты глюкозу, сахарозу, крахмал. В редких случаях, когда необходимо идентифицировать C.ulcerans, добавляется тест на восстановление нитратов в нитриты.

Учитывая, что при идентификации возбудителя дифтерийной инфекции ведущим элементом является определение наличия токсина, оценки других свойств имеет вспомогательное значение. В лабораториях, где проводится диагностика заболеваний, вызываемых "недифтерийными" коринебактериями, недостаточно использования даже "длинного" углеводного ряда. Для точной идентификации данных микроорганизмов необходимо использовать хемотаксономические методы исследования, например, такие, как определение наличия миколовых кислот в составе клеточной стенки бактерий и некоторые другие.

Таким образом, выделенный микроорганизм является возбудителем дифтерии, если он обладает токсигенными свойствами, определенным спектром ферментативной активности (расщепление глюкозы, крахмала, отсутствие разложения сахарозы, наличие фермента цистиназы, отсутствие фермента уреазы) и характерными морфолого - культуральными признаками (образование колоний черного или серого цвета на кровяно - теллуритовых средах, с учетом, при необходимости, морфологии клеток - полиморфные, не образующие спор палочки).

Бактериологическое исследование

Бактериологическое исследование проводят с целью лабораторной диагностики дифтерийной инфекции, выявления источников инфекции и наблюдения за распространенностью токсигенных коринебактерии дифтерии.

Взятие и доставка материала

Взятие материала должны производить специально обученные медицинские работники лечебно - профилактических учреждений.

При исследовании на дифтерию обследуют ротоглотку и нос. При дифтерии редких локализаций (глаз, ухо, рана, кожа, влагалище) помимо пораженных участков, следует брать материал также с миндалин и из носа.

Взятие материала осуществляют с помощью стерильных ватных сухих тампонов.

Материал из ротоглотки и носа берут отдельными тампонами, натощак или не ранее, чем через два часа после еды, при хорошем освещении, с использованием шпателя, не касаясь тампоном языка и внутренних поверхностей щек и зубов. Одним тампоном собирают материал с пораженных участков ротоглотки - миндалин, а при необходимости - с дужек мягкого неба, небного язычка или задней стенки глотки. При наличии налетов, материал следует брать с границы пораженных и здоровых тканей, слегка нажимая на них тампоном. Для взятия материала из носа используют другой тампон, который вводят сначала в один, а потом в другой носовой ход, не касаясь крыльев носа снаружи.

При ларингоскопии материал (слизь, пленка) собирают непосредственно из гортани. Материал с пораженных участков кожи следует собирать сухим тампоном после удаления корочек или струпа.

Тампоны должны быть доставлены в лабораторию не позднее 3-х часов с момента взятия материала. При проведении обследования контингентов в отдаленных от бактериологических лабораторий районах, рекомендуется засевать материал на чашки с питательной средой или использовать транспортную среду.

В случае использования транспортной среды материал собирают сухим тампоном, опускают в пробирку со средой и следят за тем, чтобы пробка тампона не намокла. Следует учитывать, что применение транспортной среды увеличивает срок выдачи окончательного ответа на одни сутки.

Чашки (или пробирки с транспортной средой) с посевом исследуемого материала можно поместить для подращивания в термостат при 37 град. C на 15-18 часов, после чего доставить в лабораторию.

При транспортировке на дальние расстояния также можно использовать тампоны, предварительно пропитанные раствором глицерина. Тампон пропитывают 5-процентным раствором глицерина в дистиллированной воде, отжимают о стенки сосуда с раствором, укрепляют в пробирке так же, как сухой тампон и автоклавируют при 0,5 атм. в течение 30 мин.

Холодное время года исследуемый материал доставляют в баклабораторию в сумках - термосах, во избежание его замерзания.

В случае необходимости проведения постмортальных исследований на коринебактерии дифтерии, материал целесообразно брать с миндалин, гортани и полости носа, поскольку во внутренних органах возбудитель обнаруживается редко.

Каждой пробирке с исследуемым материалом (зев, нос или другая локализация) придается номер. В прилагаемом списке указывается номер пробирки, фамилия, имя (или инициалы), возраст, название учреждения, направляющего материал, или домашний адрес обследуемого, цель обследования (диагностическая с указанием диагноза, по эпидпоказаниям, профилактическое обследование), дата и время взятия материала.

Ход исследования

ПЕРВЫЙ ДЕНЬ

Посев материала.

Материал для исследования из ротоглотки, носа или других пораженных мест засевают раздельно на поверхность одной из рекомендуемых плотных питательных сред, разлитых в чашки Петри.

Посев от одного лица производят на одну чашку, используя при этом половину поверхности среды для посева материала из ротоглотки, а вторую - для посева материала из носа. При посеве материала с кожи или других мест добавляют еще одну чашку. Не допускается посев материала от нескольких лиц на одну чашку.

При посеве материал втирают в среду со всех сторон тампона на участке площадью 2 * 1 см² - формирование такой "площадки" является обязательным. Затем этим же тампоном засевают оставшуюся поверхность 1/2 чашки. Посев производят частыми неперекрывающимися штрихами, не отрывая тампон от поверхности питательной среды и не изменяя положения тампона. Такой метод посева позволяет засеять весь материал с тампона, получить изолированные колонии (чистую культуру) для дальнейшей идентификации непосредственно на чашке первичного посева, что сокращает длительность анализа на одни сутки. Засеянные чашки или пробирки с транспортной средой помещают в термостат при 37 град. C. Высев из транспортной среды производят на следующие сутки на плотную питательную среду тампоном, отжатым о стенки пробирки, или петлей, забирая материал из осадка.

Посев следует производить на чашки со средой, согретые при комнатной температуре или в термостате (15-20 минут).

ВТОРОЙ ДЕНЬ

Колонии, выросшие на чашках, просматривают через 24 часа после посева материала (если материал засевали во второй половине дня, то просмотр осуществляется ровно через 24 часа, т.е. тоже во второй половине дня) визуально или с помощью микроскопа бинокулярного стереоскопического (МБС).

Чашки с колониями, похожими на дифтерийные, отбирают для дальнейшей идентификации культуры по всем тестам. Микроскопии препаратов - мазков из "подозрительных" колоний можно не проводить. "Подозрительные" колонии на кровяно-теллуритовых средах через 24 часа роста светло-серого цвета, выпуклые, с ровными краями, через 48 часов - серые с металлическим оттенком, с ровными или слегка изрезанными краями, крошащиеся при прикосновении петлей или мягкой консистенции. Из "сомнительных" колоний готовят препараты - мазки.

Клетки коринебактерий дифтерии из культуры, выросшей на средах с ингибиторами роста (теллурит калия, хинозол) могут быть укорочены, утолщены, однако присущее им расположение и полиморфизм сохраняются. Оценка морфологических признаков не позволяет установить видовую принадлежность микроорганизма, но дает возможность предположительно отнести его к роду коринебактерий. Если при микроскопии обнаруживают палочки, характерные для рода коринебактерий, то эти колонии отбирают для дальнейшей идентификации по всем тестам. В случае обнаружения других форм микроорганизмов (кокков, дрожжей, споровых палочек), дальнейшее изучение этих колоний прекращается.

В случае роста "подозрительных" однотипных колоний, необходимо сразу же приступить к изучению их токсигенных свойств. Токсигенные свойства изучают не менее чем у 2 изолированных колоний путем посева одной половины каждой колонии на среду для определения токсигенности и, необожженой петлей, - на среду Пизу, а другой половины колонии - в пробирку со скошенным сывороточным агаром для сохранения и накопления культуры. При невозможности снять 1/2 колонии для посева на токсигенность и на среду Пизу используется материал целой колонии; посев на скошенный агар исключается и, в дальнейшем, используется культура из пробирки с пробой Пизу. Учитывая, что через 24 часа роста колонии имеют небольшие размеры и материала 1/2 или 1 колонии может быть недостаточно для накопления дифтерийного токсина в пробе на токсигенность, а также то, что в исследуемом материале могут находиться одновременно токсигенные и нетоксигенные разновидности коринебактерий дифтерии, крайне важно изучить токсигенные свойства, по возможности, у максимального числа выросших колоний (20 и более), смешивая по 5-7 однотипных колоний в одну бляшку.

При невозможности постановки пробы на токсигенность классическим способом из-за недостаточной величины колоний, их изучают, смешивая однотипные колонии в нескольких бляшках. Не прожигая петли, производят посев в среду Пизу. Чашки с первичным посевом исследуемого материала вновь помещают в термостат на 24 часа и просматривают их повторно (на третьи сутки).

Если вырастает только одна колония, ее можно засеять на среду для определения токсигенности и, не обжигая петли, в столбик среды Пизу для определения цистиназы. Для дальнейшей идентификации можно использовать культуру из пробирки с пробой Пизу или с бляшки через 48 часов роста, или через 24 часа роста при выявленных токсигенных свойствах культуры.

С целью выдачи предварительного ответа, в случае множественного роста подозрительных колоний, можно произвести посев нескольких колоний на жидкую питательную среду для постановки РНГА, пополнить дополнительную пробу Заксе (3-5 однотипных колоний, учет через 30 мин. инкубации) и пробу Пизу (5-6 однотипных колоний, учет через 3 часа инкубации). При характерной для коринебактерий дифтерии морфологии колоний в МБС, морфологии клеток при микроскопии, отрицательной пробе Заксе, положительных результатах пробы Пизу, РНГА, можно выдать предварительный ответ об обнаружении культуры, подозрительной на коринебактерии дифтерии через 48 часов (на третьи сутки) с момента первичного посева исследуемого материала.

ТРЕТИЙ ДЕНЬ

Через 24 часа, при появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, положительной пробе на цистиназу, изучаемую культуру идентифицируют как коринебактерий дифтерии токсигенные и выдают документированный ответ.

При отсутствии специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности, чашки инкубируют еще 24 часа.

Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу (после оценки ее чистоты), засевают на среды для определения биохимического варианта (сахароза, глюкоза, крахмал) и фермента уреазы (гидролиз мочевины).

Чашки с первичным посевом исследуемого материала просматривают визуально или с помощью МБС повторно через 36-48 часов инкубации в термостате. При наличии "подозрительных" колоний изучают их токсигенные свойства, цистиназную активность и выделяют чистую культуру на скошенный сывороточный агар.

При отсутствии колоний, подозрительных на коринебактерии дифтерии, выдают окончательный ответ, что коринебактерии дифтерии не выявлены.

При отсутствии роста на чашках первичного посева через 48 часов инкубации, в ряде случаев требуется повторное взятие и исследование материала. Полное отсутствие роста чаще всего свидетельствует о нарушении правил бактериологического обследования (взятия, доставки, посева и культивирования исследуемого материала).

ЧЕТВЕРТЫЙ ДЕНЬ (ПЯТЫЙ)

При появлении специфических линий преципитации на среде для определения токсигенности (через 24 часа инкубации пробы на токсигенность 48-часового роста первичного посева), положительной пробе на цистиназу выдают документированный ответ о выделении токсигенных коринебактерий дифтерии.

Культуру, выросшую на скошенном сывороточном агаре или с пробы Пизу, после определения ее чистоты, засевают на среды для изучения биохимических свойств (среды Гисса с сахарозой, глюкозой, крахмалом, проба Заксе или бульон с мочевиной).

Повторно (через 48 часов) учитывают результаты пробы на токсигенность, поставленной во 2 день исследования. Одновременно производят учет сахаролитических свойств и уреазной активности в пробах, поставленных в 3 день исследования.

При отсутствии специфических линий преципитации через 48 часов после постановки пробы на токсигенность, но при положительных результатах проб на цистиназу, глюкозу, отрицательных результатах проб на уреазу и сахарозу, культуру идентифицируют как коринебактерии дифтерии нетоксигенные, с указанием биохимического варианта.

При выделении токсигенных коринебактерий дифтерии дополнительно выдают ответ о биохимических свойствах (через 72 или 96 часов с момента первичного посева исследуемого материала).

Бактериологическое заключение

Наличие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культуральные и биохимические свойства (сахароза, глюкоза, крахмал) позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, токсигенная, биохимического варианта гравис или митис.

Отсутствие специфических линий преципитации при определении токсигенных свойств, положительная проба на цистиназу, отрицательная проба на уреазу, характерные культуральные и биохимические свойства позволяют заключить, что выделенная культура относится к виду коринебактерий дифтерии, нетоксигенная, биохимического варианта гравис или митис.

При наличии линий преципитации, идентичных специфическим линиям контрольного штамма коринебактерий дифтерии, положительных проб на уреазу, цистиназу, ферментации глюкозы и крахмала, отсутствии ферментации сахарозы, отсутствии редукции нитратов в нитриты, культуру относят к виду коринебактерий ульцеранс, токсигенный вариант.

При отсутствии линий преципитации при определении токсигенных свойств и наличии всех других признаков, характерных для коринебактерий ульцеранс, нетоксигенный вариант, и бактериологический ответ считают отрицательным.

При выделении коринебактерий Гофмана или других дифтероидов, бактериологический ответ считают отрицательным.

В некоторых случаях, при диагностическом обследовании и по эпидпоказаниям, может быть выдан предварительный ответ. Это требует постановки дополнительных проб, наличия качественных питательных сред, тест-системы для постановки РНГА и специально обученного персонала. Предварительный ответ может быть выдан при наличии множественного роста однотипных "подозрительных" колоний на чашках первичного посева после 24 часов инкубации.

Предварительный ответ может быть изменен после окончания бактериологического исследования.



Определение токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с помощью реакции преципитации в геле

В основе метода определения токсигенности коринебактерий дифтерии (тест Элека) лежит процесс встречной иммунодиффузии токсина и антитоксических антител в плотной питательной среде. В местах оптимального количественного соотношения между токсином, продуцируемым коринебактериями, и антитоксином, нанесенным на фильтровальную бумагу, происходит их взаимодействие с образованием преципитата в виде белой линии или "усов".

Токсигенность коринебактерий дифтерии определяют, как правило, в чистой культуре (отдельные колонии или культура со скошенного агара, или с пробы Пизу). Смесь колоний или культуры, загрязненные посторонней микрофлорой, также могут быть испытаны на токсигенность. При отсутствии, в этом случае, преципитатов в агаровом геле, опыт следует повторить с выделенными чистыми культурами.

ПОСТАНОВКА ПРОБЫ

Культуру засевают в виде "бляшек" диаметром 0,6-0,7 см на расстоянии 0,7-0,8 см друг от друга и 0,5 см от края полоски фильтровальной бумаги. На одну чашку следует засевать не более 10 "бляшек". Из них 6 "бляшек" испытуемой культуры, 4-контрольного штамма. При небольшом количестве испытуемого материала засевают 6 контрольных "бляшек" и 4 - испытуемых. Чашки с посевом помещают в термостат при 37 град. C.

Учет результатов

Результат учитывают через 18-24 часа и 48 часов роста. Следует иметь в виду, что препарат антитоксической противодифтерийной сыворотки, помимо антител к дифтерийному антитоксину, содержит антитела к антигенам микробной клетки. Поэтому при постановке пробы на токсигенность с использованием данного препарата преципитаты могут образовываться не только в результате связывания токсина с антитоксином (специфические преципитаты), но и при взаимодействии антибактериальных антител с компонентами клетки коринебактерий дифтерии (неспецифические преципитаты). Последние могут формироваться как у токсигенных, в том числе и у контрольного штамма, так и у нетоксигенных коринебактерий дифтерии. Иногда отмечается появление множественных линий преципитации. Неспецифические преципитаты, как правило, слабо выражены, имеют нечеткие контуры, появляются чаще через 48-72 часа, в редких случаях могут появляться и на первые сутки. Критерием оценки специфичности преципитатов является слияние линий преципитации испытуемого штамма со специфическими линиями контрольного токсигенного штамма. В тех случаях, когда у контрольного штамма формируется несколько линий преципитации, специфическими следует считать более четкие и рано появляющиеся преципитаты. Поэтому просмотр чашек с пробой на токсигенность осуществляют через 18-24 часа от момента ее постановки. Если в течение данного времени у контрольного штамма линии преципитации не обнаруживаются, это свидетельствует о нарушении условий постановки реакции.

Варианты оценки результатов реакции:

1. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются токсигенными, если образуемые ими линии преципитации сливаются или имеют тенденцию к слиянию с соответствующими специфическими линиями контрольного токсигенного штамма.

2. Испытуемые культуры коринебактерий дифтерии являются нетоксигенными, если:

а) линии преципитации, образуемые испытуемой культурой, отсутствуют, при наличии специфических линий преципитации у контрольного штамма;

б) линии преципитации не могут слиться со специфическими линиями преципитации контрольного штамма, а скрещиваются или имеют тенденцию к скрещиванию с ними (неидентичные, неспецифические линии);

в) линии преципитации испытуемой культуры сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма;

г) линии преципитации испытуемой культуры перекрещиваются со специфическими линиями и сливаются с неспецифическими линиями контрольного штамма.

Очищенный ферментолизом и специфической сорбцией антитоксин не содержит антител к компонентам микробной клетки. При использовании этого препарата неспецифические линии преципитации не образуются.

Методика определения токсигенных свойств коринебактерий дифтерии с использованием индикаторных бумажных дисков с антитоксином

На поверхность чашки Петри со средой для определения токсигенности дифтерийных микробов помещают индикаторные диски с дифтерийным антитоксином. Вокруг каждого диска с антитоксином формируют 5 "бляшек": две "бляшки" - контрольного штамма и три - испытуемые (из одного анализа с подозрительными колониями формируют минимум две "бляшки" из изолированных колоний и одну - из смеси 3-6 однотипных колоний; материалом из этого же анализа можно занять места вокруг другого диска с антитоксином). Все пять "бляшек" располагают симметрично вокруг диска на расстоянии 0,8 см от его края. Диаметр каждой "бляшки" 0,8 см. На одной чашке Петри можно разместить до четырех дисков с антитоксином и, соответственно, до 20 "бляшек" с культурами. Чашки с посевами помещают в термостат при 37 град. C.

Результат реакции учитывают через 18-24 часа, а также - через 48 часов. Наличие линий преципитации между диском с антитоксином и испытуемой культурой свидетельствует о ее токсигенности. Исследуемая культура считается токсичной, если линия преципитации данной культуры сливается под углом с линией преципитации контрольного штамма. Отсутствие линий преципитации у испытуемых культур через 48 часов, при наличии их у контрольных штаммов, указывает на отсутствие токсигенности у изучаемых культур. Линии преципитации у контрольных штаммов должны появляться через 18-24 часа. Более позднее появление линий преципитации требует проверки качества питательной среды или замены контрольного штамма.

Методики определения биохимических признаков определение цистиназной активности (проба Пизу)

Коринебактерий дифтерии и коринебактерий ульцеранс, в отличие от ложнодифтерийной палочки Гофмана и других коринеформных бактерий, обладают ферментом цистиназой.

Испытуемую культуру засевают петлей "уколом" в питательную среду для определения цистиназы, разлитую в узкие пробирки столбиком высотой 3 см. В составе питательной среды имеется цистин и уксусно-кислый свинец. В процессе роста культура продуцирует цистиназу, расщепляющую цистин; а образующийся при этом сероводород вступает в реакцию с уксусно-кислым свинцом, который превращается в серно-кислый свинец - соединение темно-коричневого цвета. Коринебактерий дифтерии и коринебактерий ульцеранс вызывают не только почернение среды по ходу укола, но и образуют вокруг него облачко темно-коричневого цвета на расстоянии примерно 1 см от поверхности среды. Результат реакции учитывают через 24 часа. При наличии множественного роста, для получения ускоренного ответа (через 3 часа), среду инокулируют большим количеством культуры. Одновременно с испытуемыми культурами, производится посев контрольного штамма в отдельную пробирку.



Определение уреазной активности

Ложнодифтерийные палочки Гофмана, коринебактерии ульцеранс и некоторые другие микроорганизмы рода Corynebacterium обладают способностью продуцировать в процессе роста фермент уреазу и расщеплять мочевину. Коринебактерии дифтерии такой способностью не обладают.

Пробу на уреазу можно ставить в 2-х вариантах - по методу Заксе и путем посева на бульон с мочевиной.

а) Для определения уреазы по методу Заксе extempore смешивают 1 часть реактива А и 19 частей реактива В. Смесь разливают в узкие пробирки по 0,1 мл и вносят одну петлю испытуемой чистой культуры со скошенного агара или из пробирки со средой Пизу. Для выдачи ускоренного ответа, при наличии множественного роста однотипных колоний на чашке первичного посева, допускается внесение нескольких колоний в одну пробирку с пробой на уреазу. Результат учитывают после инкубации в термостате при 37 град. C в течение 30 мин.

б) Чистую культуру коринебактерий дифтерии засевают в бульон с мочевиной, разлитый в пробирки по 2-3 мл и помещают в термостат, результат учитывают через 24 часа инкубации при 37 град. C.

Фермент уреаза расщепляет мочевину с образованием аммиака и углекислоты. При этом повышается pH среды и происходит изменение цвета индикатора (покраснение). При отсутствии у исследуемой культуры этого фермента, окрашивания среды не происходит. Рекомендуется одновременно, в отдельную пробирку, засевать контрольный штамм.

Определение сахаролитической активности

Для идентификации коринебактерий дифтерии используют оценку сахаролитической активности выделенных культур на средах Гисса с углеводами - сахарозой, глюкозой, растворимым крахмалом. Каждую пробирку со средой Гисса инокулируют 1 петлей чистой культуры. Результат учитывают через 24 часа, а при отрицательном крахмальном признаке - через 48 часов культивирования посевов в термостате при 37 град. C.

При сбраживании того или иного углевода образуется кислота, происходит восстановление обесцвеченного фуксина и среда приобретает малиновую окраску. Рекомендуется одновременно ставить пробу с контрольным штаммом коринебактерий дифтерии варианта гравис.

Определение нитратредуктазной активности

Способность коринебактерий дифтерии восстанавливать соли азотной кислоты (нитраты) в соли азотистой кислоты (нитриты) является дополнительным признаком, позволяющим дифференцировать коринебактерий ульцеранс.

Производят посев исследуемой культуры в пробирку с нитратным бульоном, инкубируют в течение 24 часов при температуре 37 град. C. Затем добавляют 2-3 капли реактива на нитриты (Грисса или Касаткина). В случае если произошло образование нитритов, среда окрашивается в красный цвет. Если микроорганизм не обладает нитратредуктазой, изменения окраски среды не происходит. Одновременно с опытными пробирками, инкубируют контрольную пробирку со стерильной средой.

Методика постановки реакции непрямой гемагглютинации для выявления дифтерийного токсина (РНГА)

РНГА не является методом, обязательным к постановке в практических бактериологических лабораториях. Вместе с тем, использование его позволяет выявлять слаботоксигенные штаммы C.diphtheriae, определять уровень токсинообразования циркулирующих штаммов и, в некоторых случаях, сокращать сроки индикации дифтерийного токсина.

В настоящее время данный метод может использоваться для выдачи предварительного ответа в ходе бактериологического исследования при наличии в лаборатории тест-системы и специально обученного персонала. В дальнейшем, при накоплении опыта работы с РНГА, усовершенствовании тест-системы возможно включение этой реакции в схему бактериологической диагностики дифтерийной инфекции для ускоренного выявления дифтерийного токсина.

РНГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая использование диагностикума эритроцитарного дифтерийного антительного, действующим началом которого являются связанные с эритроцитами очищенные специфической сорбцией поликлональные антитоксические противодифтерийные антитела (антитоксин), вступающие во взаимодействие лишь с дифтерийным токсином (анатоксином). При наличии в исследуемой пробе токсина образуется специфический комплекс: дифтерийный токсин + сенсибилизированные антитоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

ПОСТАНОВКА РНГА

Во все лунки планшетов вносят по 0,025 мл раствора 1.

Внесение раствора дифтерийного анатоксина в рабочем разведении (1-ый положительный контроль - для оценки чувствительности диагностикума).

В первую лунку 1-го вертикального ряда планшета (A1) вносят 0,025 мл дифтерийного анатоксина (в разведении 1:100 или 0,1 Lf/мл) и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки (H1) включительно. Разведения анатоксина в лунках: 1-ой - 1:200 или 0,05 Lf/мл, 2-ой - 1:400 или 0,025 Lf/мл, 3-ей - 1:800 или 0,012 Lf/мл, 4-ой - 1:1600 или 0,006 Lf/мл, 5-ой - 1:3200 или 0,003 Lf/мл, 6-ой - 1:6400 или 0,0015 Lf/мл, 7-ой - 1:12800 или 0,0007 Lf/мл, 8-ой -1:25600 или 0,0003 Lf/мл.

Внесение надосадочной жидкости среды культивирования контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии (2 положительный контроль - для оценки качества питательной среды и условий культивирования штаммов).

В 1-ую лунку 2-го вертикального ряда (A2) вносят 0,025 мл этой пробы и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки (H2) включительно (от 1:2 до 1:256).

Внесение надосадочной жидкости среды культивирования контрольного нетоксигенного штамма коринебактерий дифтерии (1-й отрицательный контроль - для оценки специфичности диагностикума).

В 1-ую лунку 3-го вертикального ряда (A3) вносят 0,025 мл этой пробы и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки (H3) включительно (от 1:2 до 1:256).

Внесение пробы жидкой питательной среды, без материала (2-й отрицательный контроль - на отсутствие способности среды культивирования вызывать агглютинацию диагностикума).

В 1-ую лунку 4-го вертикального ряда (A4) вносят 0,025 мл среды культивирования и титруют с двукратным шагом до 5-ой лунки (E4) включительно (от 1:2 до 1:32).

Внесение исследуемых проб.

В первые лунки оставшихся рядов (с 5 по 12) вносят по 0,025 мл надосадка среды культивирования исследуемого материала и титруют с двукратным шагом до 8-ой лунки включительно (от 1:2 до 1:256).

Пробирки с исследуемыми и контрольными пробами перед взятием материала не встряхивать!

Внесение рабочего разведения диагностикума (0,5-процентной концентрации).

а) В 2-3 лунки, содержащие только раствор 1, вносят по 0,025 мл диагностикума (3-й отрицательный контроль - на отсутствие неспецифической агглютинации диагностикума. Контроль ставят на каждом планшете!).

б) Во все лунки с исследуемым материалом, положительными и отрицательными контролями вносят по 0,025 мл диагностикума.

Содержимое лунок перемешивают легким постукиванием пальца по краю планшета. Планшеты закрывают крышками и оставляют на ровной поверхности при температуре 20 град. C (перемещение пластин до учета результатов реакции исключается). Через 2,5-3,5 часа производят учет результатов реакции. Допускается учет результатов реакции через 18-24 часа.

УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Учет результатов осуществляется визуально - по степени агглютинации эритроцитов:

++++ гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки;

+++ агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;

++ части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;

+ на дне лунки образуется широкое, плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;

- осадок в центральной части лунки в виде дискет или кольца с ровным краем.

Чувствительность диагностикума определяется тем максимальным разведением дифтерийного анатоксина, которое еще вызывает агглютинацию сенсибилизированных эритроцитов не менее, чем на три плюса (+++). Диагностикум должен быть по чувствительности не ниже 0,003 Lf/мл (титр анатоксина не ниже 1:3200 - 5 лунка). При более низкой чувствительности (4 лунка и менее) диагностикум бракуется.

Диагностикум не должен давать реакции агглютинации с раствором 1, надосадочной жидкостью среды культивирования контрольного нетоксигенного штамма, средой культивирования без материала.

Качество жидкой питательной среды, используемой для культивирования исследуемого материала и контрольных штаммов, считается удовлетворительным, если положительная реакция (на ++) в ряду разведений контрольного токсигенного штамма коринебактерий дифтерии наблюдается в лунке с разведением не менее 1:32 (5 лунка, E2).

Положительными считаются пробы, давшие реакцию агглютинации с сенсибилизированными эритроцитами не менее, чем на два плюса (++). Содержание токсина в исследуемой пробе выражается величиной титра (1:2, 1:4, 1:8, 1:16, 1:32 и т.д.).

Данный метод позволяет определить относительное (условное) количественное содержание токсина в исследуемых пробах. Для этого необходимо умножить выраженное в Lf/мл значение чувствительности тест-системы на обратную величину титра исследуемой пробы. Например, чувствительность тест-системы 0,0015 Lf/мл (реакция агглютинации на +++ в 6-ой лунке ряда разведений дифтерийного анатоксина, или F1). Титр исследуемой пробы 1:4 (реакция агглютинации на ++).

Относительное количество токсина в этой пробе равно 0,006 Lf/мл (0,0015 Lf/мл x 4 = 0,006 Lf/мл).

Методика постановки реакции пассивной гемагглютинации для выявления дифтерийных антитоксических антител (РПГА)

Для изучения напряженности противодифтерийного иммунитета проводят определение уровня антитоксических противодифтерийных антител в сыворотке крови человека в РПГА.

РПГА - двухкомпонентная реакция, предполагающая взаимодействие диагностикума эритроцитарного дифтерийного антигенного, который представляет собой эритроциты с адсорбированным на них дифтерийным анатоксином, и антитоксических противодифтерийных антител, находящихся в сыворотке крови обследуемых. При наличии в исследуемой сыворотке антитоксина образуется специфический комплекс: антитоксин + сенсибилизированные анатоксином эритроциты. В результате формируется осадок в виде агглютината эритроцитов.

РПГА рекомендуется ставить одновременно с двумя диагностикумами - дифтерийным и столбнячным. Данную реакцию ставят микрометодом, при котором используются малые количества сыворотки крови, растворов и реактивов. Также, по сравнению с макрометодом, микрометод более чувствителен и специфичен. Описанная в данном разделе методика постановки РПГА содержит основные требования, предъявляемые к этой реакции.

Взятие крови для постановки РПГА осуществляют обученные медицинские работники ЛПУ. Кровь берут из пальца в объеме 0,7-1,0 мл. Не допускается взятие крови из вены специально для постановки РПГА. Вместе с тем, возможно использование крови, взятой из вены для проведения комплексных исследований.

Постановку РПГА должен осуществлять специально обученный персонал.

Правила сбора и обработки проб крови для определения антитоксических противодифтерийных и противостолбнячных антител

Обследуемый тщательно моет руки с мылом в теплой воде. Подушечку концевой фаланги безымянного пальца левой руки обрабатывают 70% спиртом, место сгиба у концевой фаланги прижимают для лучшего кровенаполнения и наносят два укола стерильным одноразовым скарификатором на расстоянии 2 мм один от другого или один укол двумя скарификаторами взятыми вместе. Массируя опущенный палец, капли крови собирают в стерильную центрифужную пробирку, направляя их "одной дорожкой". Собирают не менее 0,7-1,0 мл крови. Ранку обрабатывают настойкой йода.

Пробирку закрывают ватно-марлевой пробкой и оставляют в наклонном положении для образования "скошенного" сгустка. На пробирке должен быть указан номер, соответствующий записи в журнале регистрации. Через час пробирку переводят в вертикальное положение. При этом сгусток остается на стенке пробирки, а свободная от эритроцитов сыворотка собирается на дне. Сыворотку переносят в другую пробирку.

В лабораторию для постановки РПГА доставляют либо пробирку со сгустком либо пробирку с сывороткой. Сыворотка может быть заморожена и храниться при температуре -20 град. C. Замораживать и оттаивать сыворотку крови рекомендуется не более одного раза.

Постановка РПГА

Во все лунки планшета вносят по 0,025 мл разведенного ФБР с твином.

Петлей вместимостью 0,025 мл в 1 лунку ряда вносят 0,025 мл разведенной 1:5 прогретой, адсорбированной испытуемой сыворотки, тщательно перемешивают, получают разведение 1:10 и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из 10 лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл. Для экономии всех ингредиентов титрование сывороток можно проводить в 8 лунках по короткому ряду планшета.

Если испытуемые сыворотки разведены 1:10, то в 1 лунку планшета вносят по 0,025 мл разведенной 1:10 испытуемой сыворотки. Внесение сыворотки в этом случае осуществляют мерной пипеткой (с наконечником). Титрование сыворотки начинают со 2 лунки.

Для контроля на отсутствие агглютининов к эритроцитам барана, при постановке РПГА "по длинному ряду", в 11 лунку петлей вносят 0,025 мл испытуемой сыворотки, прогретой, адсорбированной, разведенной 1:10 (или 1:5), перемешивают и переносят 0,025 мл в 12 лунку. Из 12 лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл. При титровании "по короткому ряду" этот контроль для испытуемых сывороток ставят на специально выделенных рядах этого же планшета (в редких случаях - в отдельном планшете).

Внесение сыворотки противодифтерийной контрольной (для оценки чувствительности эритроцитарного диагностикума).

В 1 лунку ряда вносят 0,025 мл разведенной СДК, получают разведение 1:200, содержимое лунки тщательно перемешивают петлей и, перенося по 0,025 мл раствора из предыдущей лунки в последующую, делают двукратные разведения до 10 лунки включительно. Из десятой лунки, после перемешивания, удаляют 0,025 мл, 11 и 12 лунки, содержащие по 0,025 мл разведенного ФБР с твином, являются контролем диагностикума на отсутствие спонтанной агглютинации.

В 1 лунку ряда, так же как и при титрировании испытуемых сывороток, лучше не вносить 0,025 мл разведенного ФБР с твином. При этом, в 1 и 2 лунки мерной пипеткой с наконечником вносят по 0,025 мл СДК, разведенной 1:100. Титрование СДК начинают со 2 лунки.

Контроль на чувствительность диагностикума следует ставить при каждом опыте!

При постановке РПГА "по длинному ряду", в 11 и 12 лунки с испытуемой сывороткой вносят по 0,025 мл рабочего разведения контрольных эритроцитов барана. При постановке РПГА "по короткому ряду", контрольные эритроциты барана вносят в две специально выделенные лунки для каждой испытуемой сыворотки (см. п. 2).

Флакон с разведенным диагностикумом тщательно встряхивают до образования однородной взвеси эритроцитов и капельницей вносят по 0,025 мл (одна капля) диагностикума в каждую лунку до конца ряда с разведениями контрольной сыворотки и с 1 до 10 лунки включительно с разведениями испытуемых сывороток (или с 1 до 8 лунки с разведениями испытуемых сывороток при постановке реакции "по короткому ряду".

Разведенный диагностикум может быть использован в течение недели, если его активность соответствует требуемой.

Равномерное распределение эритроцитов в лунках пластин достигается путем постукивания по углам пластины. Пластины остаются на ровной поверхности в течение 2,5-3,5 часов при температуре 20 град. C (перемещение пластин до учета результатов реакции исключается). Допускается учет результатов реакции через 18-24 часа.

УЧЕТ И ИНТЕРПРЕТАЦИЯ РЕЗУЛЬТАТОВ

Результаты РПГА оценивают визуально - по степени агглютинации эритроцитов:

++++ гемагглютинат тонким слоем выстилает все дно лунки;

+++ агглютинировавшие эритроциты ровным слоем выстилают дно лунки, но размер агглютината меньше, может наблюдаться фестончатое утолщение края осадка;

++ агглютинировавшие эритроциты располагаются в центральной части лунки, окружены слоем эритроцитов в виде кольца;

+ на дне лунки образуется широкое, плотное кольцо с незначительной агглютинацией по краю;

- осадок в центральной части лунки в виде диска или кольца с ровным краем.

Реакция в контролях на отсутствие в испытуемой сыворотке агглютининов к эритроцитам барана и на отсутствие спонтанной агглютинации диагностикума должна быть отрицательной. Если испытуемая сыворотка в лунках с контрольными эритроцитами дает гемагглютинацию, нужно повторно адсорбировать из нее гетерогемагглютинины: то есть повторно провести обработку сыворотки 50-процентными формалинизированными эритроцитами.

За титр испытуемой и контрольной сывороток принимают последнее разведение, дающее агглютинацию эритроцитов на два плюса (++).

При определении специфической активности (чувствительности) диагностикума, агглютинация на два плюса с сывороткой противодифтерийной контрольной должна быть не ниже 1:3200 и не выше 1:12800, что соответствует 5-7 лункам. В противном случае диагностикум бракуется и реакция не учитывается. (Активность столбнячного диагностикума с противостолбнячной контрольной сывороткой должна быть не ниже, чем 1:1280.)

Условно-защитным титром как противодифтерийных, так и противостолбнячных антител принимается титр 1:20.

Испытуемые сыворотки с титром противодифтерийных антитоксических антител 1:20 и менее подлежат повторному исследованию в РПГА с использованием уже разведенной 1:5 или 1:10, прогретой, адсорбированной эритроцитами барана сыворотки. При наличии достаточного количества нативной сыворотки, ее вновь разводят 1:5 или 1:10, прогревают, сорбируют эритроцитами барана и исследуют в РПГА. За окончательный результат исследования принимают более высокий титр.

Не рекомендуется использовать РПГА для дифференциальной диагностики дифтерийной инфекции и носительства токсигенных коринебактерий дифтерии, поскольку нарастание титра антитоксических антител может иметь место как в том, так и в другом случае. Кроме того, 4-кратного нарастания титра реакции, которое некоторыми исследователями трактуется как критерий наличия дифтерийной инфекции, может не наблюдаться, поскольку РПГА является полуколичественным методом, с допустимой ошибкой метода +/- одно разведение. Однако РПГА позволяет оценить состояние антитоксического противодифтерийного иммунитета у больного и, в некоторой степени, прогнозировать течение и исход заболевания.



Заключение

Изменения клиники дифтерии в период резкого снижения заболеваемости создали большие трудности для клинической диагностики, несмотря на то, что на протяжении последних лет значительно расширились знания в отношении ряда заболеваний, которые раньше принимались за дифтерию. Следует учесть, что редкость случаев заболевания дифтерией ведет к тому, что у врачей притупляется бдительность к нему.

Для больного дифтерией требуется раннее применение специфической терапии, и поэтому первоначальный диагноз должен ставиться на основании клинической картины болезни; ожидание результатов бактериологического исследования отдаляет начало лечения. Вместе с тем правильная диагностика дифтерии только на основании клинических данных далеко не всегда возможна и предположение о заболевании дифтерией нередко оказывается неверным.

Значение бактериологического исследования для окончательной диагностики дифтерии в последние годы возросло, во-первых, потому, что увеличился удельный вес дифтерии с недостаточно типичной клинической картиной болезни, а во-вторых, потому, что значительно улучшилось качество бактериологической диагностики дифтерии.

Помимо результатов бактериологических исследований, для окончательного диагноза имеют значение последующее клиническое наблюдение, дополнительные анамнестические данные, выявление эпидемиологической ситуации.



Список использованных источников

1. МУ 4.2.698-98 Лабораторная диагностика дифтерийной инфекции.

2. В.И Покровский. Инфекционные болезни и эпидемиология. М. - 2007 г.

3. Н. Титова. Дифтерия: вакцинация, современные методы лабораторной диагностики. Сестринское дело »» №5-6 1998 г.

4. С. Д. Носова. Руководство по инфекционным болезням у детей. М, - "Медицина", 1972 г.