ВВЕДЕНИЕ

Гидроксиапатит Ca₁₀(PO₄)₆(OH)₂ является грубым аналогом минеральной составляющей костной ткани. Одной из основных причин, затрудняющих точную идентификацию биоапатита кости, есть нестехиометричность отношения Ca/P. Молярное отношение Ca/P в образцах биоапатитов может принимать значения, существенно отличающиеся от теоретических (1,67). Причинами этого могут быть как внутрикристаллические вакансии и/или замещения, так и поверхностные реакции обмена или адсорбции. Некоторые авторы к источникам нестехиометричности наряду с дефектностью структуры относят и высокое значение удельной поверхности биоапатита. Естественно, что при толщине кристаллов, не превышающей 2-4 элементарные ячейки, соотношение Ca/P будет определяться не только объемом, но и поверхностью, а любые изменения состава поверхности могут существенно повлиять на состав всего препарата. Очевидно, что все перечисленные причины имеют место, а относительный вклад каждой из них при изучении биокристаллов представляет несомненный интерес.

Определение соотношения Ca/P в биоапатите кальцинируемых тканей затруднено прежде всего из-за проблем разделения органической и минеральной составляющей . Задача отделения органического матрикса от минерала костной ткани с минимальным воздействием на последний решена в некоторых работах путем специальной обработки [3-5]. Однако многоуровневая архитектура строения биоминерала при этом разрушается.

Рядом исследователей отмечается неравномерность распределения Ca и P в элементах ультраструктуры костной ткани. Учитывая современные представления о существовании неапатитного окружения кристаллов биоминерала кости, задача нахождения отношения Ca/P не является однозначной. Содержание Са и Р в биоминерале в целом и в биоапатите, лишенном неапатитного окружения, может быть существенно различным.

Используемые в настоящее время методы химического и рентгеноструктурного определения не являются локальными и эффективны лишь при исследовании образцов однородных синтетических апатитов. В связи с этим приобретают актуальность методы локального определения соотношения Ca/P с указанием ультраструктурных и морфологических деталей анализируемой точки.

В настоящей работе методом растровой электронной микроскопии с рентгеновским микроанализом изучено изменение соотношения Ca/P в образцах биоапатита в ходе рекристаллизации. Применение методов препарирования, включающих пиролитическую и ультразвуковую обработку образцов, позволило выполнять электронно-зондовый рентгеноспектральный микроанализ в точках биоминерла, лишенных неапатитного окружения.

1 МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования были образцы биогенного апатита, полученного из кортикальной части диафиза большой берцовой кости зрелого животного (быка).

Пробоподготовка образцов включала: механическое удаление мягких тканей; пиролитическое удаление органики, т.е. медленный нагрев на воздухе в кварцевой трубчатой микропечи до 450-550 ?С и выдержка при этой температура 40-50 мин до полного прекращения газовыделения.

Образцы в виде небольших пластинок, нарезанных из одной локальной области фрагмента кости, подвергали отжигу в температурном диапазоне, соответствующем рекристаллизации биоапатита (560-720 ?С).

Окончательная подготовка образцов к исследованиям была выполнена в трех различных вариантах.

В первом случае исследуемые костные пластинки наносили на предметный столик с токопроводящим клеем без какой-либо последующей обработки.

Во втором случае исследуемые частички закрепляли в лунках предметного столика с использованием эпоксидного клея ЭДП. После полимеризации клея анализируемая поверхность полировалась алмазной пастой с последующей промывкой дистиллированной водой, а затем образцы подвергались обработке ультразвуком в установке УЗДН-А (ОАО «СЕЛМИ», г.Сумы). Ультразвуковой излучатель находился в сосуде с дистиллированной водой над поверхностью предметного столика с образцами в течение трех минут. Удельная мощность составляла приблизительно 15-20 Вт/см² при рабочей частоте излучателя 22 кГц.

При третьем варианте пробоподготовки отожженные образцы растирали в ступке до мелкодисперсного порошка, затем обрабатывали ультразвуком при тех же условиях, что и в предыдущем случае. Полученную суспензию распыляли с помощью ультразвукового аэрозольного ингалятора с рабочей частотой 1 МГц. Распыленный аэрозоль улавливали на тонкую формваровую пленку, размещенную на медной сеточке для просвечивающей электронной микроскопии.

Для предотвращения накопления поверхностного заряда при электронно-зондовом эксперименте образцы покрывали тонким слоем (30-50 нм) углерода в вакуумной установке ВУП-5М (ОАО «СЕЛМИ», г.Сумы).

Исследования проводились при помощи сканирующего электронного микроскопа РЭММА102, оснащённого многоканальным рентгеновским спектрометром с волновой дисперсией и дисперсией по энергиям, производства ОАО «СЕЛМИ». Микрофотографии образцов выполнены в режиме вторичных электронов при ускоряющем напряжении U_уск=20 кВ и токе пучка 10^-10 А. Электронное увеличение и размерный маркер указаны на информационной строке под изображением (рис.1). Измерения элементного состава (Са и Р) образцов выполнены при помощи спектрометра с дисперсией по энергиям. Полупроводниковый Si(Li) детектор имел разрешение по энергии, равное 200 эВ. Ускоряющее напряжение для электронного зонда устанавливали U_уск=20 кВ при токе зонда i=3 нА. Время набора спектра в каждой точке 200 с. Зона возбуждения характеристического рентгеновского излучения (ХРИ), формирующего аналитический сигнал, имела размеры порядка 4 мкм. Измерения выполняли в пяти точках на каждом образце, результат усредняли.

Обработка спектрометрической информации, выполнение необходимых калибровочных измерений, расшифровка характеристических рентгеновских спектров, качественный и количественный электронно зондовый анализ проводились с помощью программного обеспечения системы микроанализа. В основе количественного рентгеновского микроанализа лежит предположение о том, что отношение интенсивности генерируемого рентгеновского излучения от химического элемента в образце к интенсивности излучения, генерируемого в эталоне из этого чистого элемента, Kx эквивалентно концентрации элемента в образце Сx [13]. Процедура расчёта состава образца основана на классической схеме ZAF-коррекции матричных эффектов, методом внешнего эталона. Весовая доля исследуемого элемента Сx определяется соотношением:

Сx= Kx Kz Ka Kf Kc, (1)

где Kx - отношение, получаемое из эксперимента;

Kz - поправка на эффект атомного номера из-за различия рассеяния и торможения электронов в образце и эталоне;

Ka - поправка на поглощение генерируемого рентгеновского излучения в образце;

Kf - поправка на эффект флуоресценции из-за характеристического рентгеновского излучения;

Kc - поправка на эффект флуоресценции из-за непрерывного рентгеновского излучения.

При этом определение Сx производится путём итеративного расчёта состава и поправочных ZAF-коэффициентов.

В качестве образца сравнения был использован стехиометрический гидроксиапатит НПП КЕРГАП (г.Киев) после отжига при 900 ?С [14]. Дифрактограммы образца сравнения строго соответствовали кристаллической решетке гидроксиапатита (JCPDS № 9-0432), гомогенность и морфология - поверхности на микронном уровне, а также электропроводящие свойства отвечали требованиям к образцам сравнения для рентгеновского микроанализа. Состав образца сравнения принимался соответствующим брутто-формуле гидроксиапатита.

2 РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ

Факторами воздействия на костную ткань в процессе пробоподготовки были нагрев и ультразвук. При нагреве в исследованном температурном диапазоне (560-720 С) происходит рекристаллизация биоапатита, сопровождающаяся распадом карбонатных комплексов [9,15]. Ультразвуковая обработка костной ткани после пиролиза, как и после специальной химической обработки, приводит к удалению продуктов деструкции органической составляющей, оставляя практически неизмененными кристаллы биоапатита [3-5]. Подтверждением этого являются результаты исследования препаратов биоапатита, подготовленных по третьему варианту. Аэрозольное распыление водной суспензии биоминерала после ультразвукового диспергирования позволяет получить электронно-микроскопическое изображение агрегированных кристаллов биоапатита (рис.1). Из приведенных снимков видно, что агрегаты состоят из мелких частичек с размерами не более 0,2 мкм (200 нм).

Рисунок 1 - Электронно-микроскопическое изображение агрегированных кристаллов биоапатита, препарированных по третьему варианту (см. текст)

Очевидно, что ультразвуковая обработка поверхности отожженных костных частичек приведет к тому же эффекту удаления продуктов пиролиза. Благодаря мостикам, скрепляющим кристаллические частицы, поверхность образца сохраняет свою форму. Приготовленный таким способом образец является более пригодным для рентгеновского микроанализа, чем агрегированные кристаллы после аэрозольного распыления.

Как следует из соотношения (1), концентрации элементов были определены в весовых процентах. Молярному отношению Са/Р в стехиометрическом гидроксиапатите 1,67 соответствует весовое значение 2,16.

Измеренные отношения Ca/P во всех образцах костной ткани, препарированных без ультразвуковой обработки, были несколько выше теоретического значения. Разброс измеренных значений соответствовал общепринятым представлениям о распределении минеральной составляющей костной ткани по структурным (морфологическим) деталям и данным предыдущих исследований.

Данные определения отношения Ca/P в ряде образцов костной ткани после отжига при различных температурах и ультразвуковой обработки представлены на рис.2. Из полученной зависимости видно, что при отжиге биоапатит из кальций-дефицитного превращается в стехиометрический. Разброс измеренных значений Ca/P при этом резко уменьшается. Температура превращения 640-680 °С соответствует температуре начала рекристаллизации биогенного апатита. Температурный переход кальций-дефицитного (нестехиометрического) биоапатита в стехиометрический должен обеспечиваться притоком кальция извне. Источником кальция может быть только неапатитное окружение кристаллов биоминерала. Пиролитическая и ультразвуковая обработка разрушает и удаляет эти обогащенные кальцием слои, окружающие биокристаллы. После ультразвуковой обработки анализ точек с достаточно высокой плотностью позволяет определить отношение Ca/P именно в биоапатите без влияния на результат неапатитного окружения биокристаллов.

Рисунок 2 - Изменение весового отношения Ca/P при рекристаллизации биоапатита (пунктирная линия соответствует теоретическому отношению)

Переход кальция в биоминерал для образцов не достигших соответствующей температуры не происходит. Удаление неапатитных поверхностных слоев, являющихся источником кальция, снижает определяемое соотношение Са/Р. После термоактивируемого перехода кальция в биоминерал и образования стехиометрического гидроксиапатита удаление оставшихся продуктов термодеструкции органического матрикса и неапатитного окружения кристаллов уже не влияет на стехиометричность Са/Р в биоапатите.

Полученные результаты являются убедительным подтверждением данных просвечивающей электронной микроскопии [2], в соответствии с которыми размеры кристаллов в темнопольном изображении меньше, чем в светлом поле, и первое изображение соответствует апатитной части кристалла, а второе - всему кристаллу в целом.

Эти экспериментальные данные позволяют нам лучше понять результаты, полученные в ходе исследования пиролитического удаления СО₃^2- из биоминерала кости при начальных стадиях рекристаллизации, не сопровождающегося существенным изменением субструктурных параметров/

Проведенные исследования доказывают, что неапатитным окружением Са-дефицитных кристаллов биоапатита являются слои, содержащие СаСО₃, термодеструкция которых приводит к выделению СО₂ и проникновению освободившегося Са в вакансионные позиции решетки биоапатита. Однако эти слои не являются в полном смысле отдельной и полноценной фазой карбоната кальция. Поверхностный карбонат кальция не входит в кристаллическую решетку биоапатита и не связан с ней прочными химическими связями, поскольку его удаление не требует больших затрат энергии.

ВЫВОДЫ

1 Препарирование образцов костной ткани, включающее пиролиз и ультразвуковую обработку позволяет удалять продукты деструкции органического матрикса и неапатитное окружение биокристаллов.

2 Применение описанных процедур препарирования обеспечивает выполнение электронно-зондового рентгеноспектрального микроанализа в точках биоминерала, лишенных неапатитного окружения.

3 Рекристаллизация биоапатита, приводящая к образованию бездефектного стехиометрического гидроксиапатита, сопровождается диффузией кальция из неапатитного окружения кристаллов в их объем.

4 Неапатитное окружение кристаллов биоминерала представляет собой, главным образом, карбонат кальция, который при терморазложении и удалении CO₂ становится источником кальция для восстановления кальций дефицитного биоапатита до стехиометрического гидроксиапатита.

5 Поверхностный карбонат кальция не связан химически с биоапатитом.

SUMMARY

The Ca/P variations in the temperature range from 560 C to 720 C were examined for samples of bone apatite treated by techniques including thermopyrolysis and subsequent ultrasonic disaggregation (120 W, 22 kHz peak output frequency). This permits to obtain isolated crystal free of organic components and non-apatitic environments. An explicit change in the Ca/P value during the annealing was observed: the calcium-deficient apatite transforms into stoichiometric one at recrystallization temperature. This transformation can be provided by Ca coming from the external source i.e. from the Ca-rich non-apatitic environment in the biomineral. This work supports the idea that the non-apatitic environment of calcium-deficient bioapatite crystals is represented by CaCO₃ containing layers whose thermodestruction leads to carbonate elimination and subsequent penetration of the released Ca into lattice vacancies.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

Montel G., Bonel G., Heughebaert J.C., Trombe J.C. and Rey C. New concepts in the composition, crystallization and growth of the mineral component of calcified tissues // J,Crystal Growth.- 1981.-V.53.-P.73-99.

Rey C., Calcium phosphate biomaterials and bone mineral. Differences in composition, structures and properties // Biomaterials.- 1990.-V.11.-P.13-15.

Kim H.M., Rey C., Glimcher M.J. Isolation of Calcium-Phosphate Crystals of Bone by Non-Aqueous Methods at Low Temperature // J Bone Miner Res.- 1995.-V.10(10).-P.1589-1601.

Weiner S., Price P.A. Disaggregation of Bone Into Crystals // Calcif Tissue Int.- 1986.-№39.-P.365-375.

Kim H.M., Rey C., Glimcher M.J. X-Ray Diffraction, Electron Microscopy, and Fourier Transform Infrared Spectroscopy of Apatite Crystals Isolated From Chicen and Bovine Calcified Cartilage // Calcif Tissue Int.- 1996.-V.59.-P.58-63.

Glimcher M.J., Bonar L.C., Grynpas M.D., Landis W.J. and Roufosse A.H. Recent studies of bone mineral: is the amorphous calcium phosphate theory valid? J,Crystal Growth.- 1981.-V.53.-P.100-119.

Brik A.B., Brik V.B. Mechanisms of Diffusion in Biominerals and Bone Demineralization at Space Flights // Минерал. журн.-1998.-T.20, №5.-С.46-61.

Brik A.B., Ulyanchich N.V., Kenner G.H. et al. EPR of the impurity crystal phases in biominerals and their synthetic analogues // Минерал. журн.-2001.-T.23, №1.-С.23-37.

Balmain N., Legros R., and Bonel G. X-ray diffraction of calcined bone tissue: a reliable method for the determination of bone Ca/P molar ratio // Calcif Tissue Int.- 1982.- №34.- S93-S98.

Ishikawa K., Ducheyne P., Radin S.Determination of the Ca/P ratio in calcium-deficient hydroxyapatite using X-ray diffraction analysis // J.Materials science: Materials in medicine.- 1993.-V.4.-P.165-168.

Legros R., Balmain N., and Bonel G. Structure and Composition of the Mineral Phase of Periosteal Bone // J Chem Res. (S).- 1986.-P.8-9.

Данильченко C.Н., Проценко И.Е., Ульянчич Н.В. и др. Температурная зависимость субструктуры кристаллов гидроксилапатита // Вісник Сумського державног університету.-2001.-№3-4 (24-25).-С.84-92.

Практическая растровая электронная микроскопия / Под редакцией Дж.Гоулдстейна и Х.Яковица / Пер. с англ. под ред. В.И.Петрова. - М.: Мир, 1978.-656с.

Ульянчич Н.В., Лихнякевич Т.Г. Использование синтетического керамического гидроксилапатита (КЕРГАП) для регенерации костной ткани Ортопед. травматол.- 2000.- №2.- С.138-141.

Данильченко С.М., Покровський В.О., Богатирьов В.М. та ін. Дослідження локалізації карбонатів в мінералі кісткової тканини методами рентгеноструктурного аналізу та температурно-програмованої десорбційної мас-спектрометрії // Фізика і хімія твердого тіла.-2003.-(в печати).

Данильченко C.Н., Бугай А.Н., Павленко П.А. и др. Исследование деминерализованной костной ткани методом растровой электронной микроскопии // Ортопед. травматол.- 2000.-№2.-С.32-34.