Роль цитокінів в апоптозі гепатоцитів при цирозі печінки

Івано-Франківський державний медичний університет

Роль цитокінів в апоптозі гепатоцитів при цирозі печінки

Автор:

А.Д. Захараш, канд. мед. наук, доц.

Довідка

Обстежено 110 хворих на холестатичну форму цирозу печінки. Виконано морфометричне дослідження печінки з 10 аутопсій хворих, які померли від портального цирозу печінки. Встановлено, що у хворих на цироз печінки загибель гепатоцитів розвивається шляхом посиленого апоптозу в результаті системної імунної відповіді, поєднаної з порушенням системи перекисного окислення ліпідів і антиоксидантної системи. Апоптоз лімфоцитів проявляється одночасним підвищенням вмісту CD95+ на тлі збільшення рівня TNF-, ІЛ-1, ІЛ-6, IFN- і зменшенням ІЛ-2 і ІЛ-4 у сироватці крові. Апоптоз гепатоцитів підтверджується морфологічними картинами, типовими для цього процесу, зі змінами морфометричних показників, що характеризують деформацію гепатоцитів та їх ядер.

Вступ

Смерть клітини - необоротне припинення її функцій - настає або в результаті природного старіння клітин (апоптоз), або передчасно через вплив на клітину пошкоджувальних агентів (некроз). Результатом смерті клітини є некроз клітин, який характеризується визначеними біохімічними та морфологічними ознаками. Між апоптозом і некрозом є подібності і відмінності. Такі відмінності важко визначити і тому в печінці при її патологічних станах апоптоз часто розпізнається як некроз [1].

Для пояснення процесів апоптозу потрібен міждисциплінарний підхід, хоча світлова мікроскопія дає досить надійні дані про загибель клітин різними шляхами. Водночас відомі численні спеціальні морфологічні методи, які на сучасному рівні включають виявлення рецепторів на поверхні клітини, що відповідають за апоптоз. До них належать рецептори Fas/APO-1 (кластер диференціювання антигенів 95), який експресується різними клітинами і відіграє роль поверхневого рецептора, що передає цитотоксичний сигнал при зв'язуванні зі специфічними молекулами або антитілами і викликає апоптоз [2].

Апоптоз є наслідком дії на клітини ендогенних і екзогенних факторів і контролюється генетичними, імунними, гормональними та іншими механізмами, окремі ключові моменти яких до цього часу залишаються маловивченими. Питання апоптозу все ширше висвітлюється в літературі і розкриваються нові аспекти цього процесу не тільки щодо клітин крові, але й різних клітин організму, зокрема, гепатоцитів [3]. Відомо, що гепатоцити людини конститутивно експресують Fas-рецептор, і його експресія підвищується при хронічних гепатитах [4]. Нами встановлена кореляція між вмістом Fas-рецепторів, на гепатоцитах і Fas-рецепторів на лімфоцитах периферійної крові. Fas-рецептор (CD95+) належить до суперродини туморнекротизувального фактора (TNF). Його молекули відіграють значну роль у регуляції проліферації і збереження життя клітин. Наявність рецепторів вимагає їх зв'язування зі специфічним лігандом (цитокіном) [5]. Для Fas-рецептора є два відповідних цитокіни TNF- i TNF-. Т.М.Царегородцева и др.[6] зазначають те, що не тільки TNF-, але й ІЛ-1, ІЛ-6, IFN- стимулюють апоптоз. Після зв'язування рецепторів відбувається каскад послідовних реакцій за участю каспаз, які призводять до апоптозу гепатоцитів. C.M.P.Rodrigeus, C.J.Steer [7] вважають, що смерть гепатоцитів через апоптоз характерна для різних патологічних станів печінки, включаючи холестаз. Механізм гепатоцелюлярного пошкодження при холестазі до цього часу остаточно не встановлений, але накопичується все більше фактів, які свідчать за Fas-залежний шлях. В експерименті на мишах встановлено, що при тривалому холестазі апоптоз гепатоцитів зростає і жовчні кислоти індукують апоптоз гепатоцитів через Fas-незалежний шлях, пов'язаний з мітохондріальною дисфункцією [8]. Порушення мітохондрій часто супроводжується активацією перекисного окислення ліпідів і приводить до вивільнення проапоптичних факторів [9,10].

Процесс дослідження

Метою дослідження було визначення ролі цитокінів в апоптозі гепатоцитів при розгортанні клінічної картини холестатичного варіанта цирозу печінки.

Для реалізації поставленої мети було обстежено 110 хворих на цироз печінки невірусної етіології, з яких 60 мали клінічні ознаки холестазу і 50 були контролем. Серед них було 65 чоловіків і 45 жінок. Більшість пацієнтів мали вік від 40 до 70 років ( при холестазі - 81,7%, у контрольній групі - 76,0%). Хворих з хронічними вірусними і алкогольними цирозами печінки не брали для дослідження. Обстеження хворих, крім клінічного, включали УЗД органів черевної порожнини, лабораторні і біохімічні методи. Стан процесів перекисного окислення ліпідів (ПОЛ) оцінювали за кількістю малонового діальдегіду (реакція з тіобарбітуровою кислотою за методом Е.Н. Коробейнікової (1989). Активність каталази визначали за методом О.Н.Воскресенського та ін. (1982), а трансферин і церулоплазмін - за методом Г.О.Бабенка (1968).

Визначення ІЛ-1, ІЛ-2, ІЛ-4, ІЛ-6, ІFN- та TNF- проводили в супернатанті з лімфоцитів периферійної крові. Отримані параметри оцінювали методом імуноферментного аналізу (аналізатор “StatFax 303 Plus”) за допомогою реагентів “ПроКон” (ТЗОВ “Протеїновий контур”, Росія). Для визначення вмісту інтерлейкінів використовували твердофазний імуноферментний метод із застосуванням пероксидази хрону як індикаторного ферменту. У цих же хворих був визначений фенотип субпопуляції лімфоцитів периферійної крові за ідентифікацією диференційованих антигенів у тесті імунофлуоресценції із застосуванням моноклональних антитіл, які належать до кластеру диференціації CD95+(Fas/CD95) - апоптозу лімфоцитів периферійної крові.

Морфологічне і морфометричне дослідження гепатоцитів виконане на аутопсійному матеріалі від 10 хворих, які померли від портального цирозу печінки (дрібновузлова форма) невірусного генезу. Клінічно перебіг цирозу печінки у цих померлих характеризувався холестатичним компонентом. Контролем були шматочки печінки 3 чоловіків без клінічних, біохімічних та лабораторних проявів пошкодження печінки. Зрізи, забарвлені гематоксиліном і еозином, підлягали морфометричному дослідженню за допомогою аналізатора зображень на базі програмного забезпечення UTHSCSA Image Tool. Визначали такі показники: S₁ - площу профілю гепатоцитів та S₂ - площу профілю їх ядер, S₂/S₁ - співвідношення між площею профілю ядра і площею профілю гепатоцита, F₁ - коефіцієнт форми гепатоцита та F₂ - коефіцієнт форми його ядра (F=P/4S, де Р - периметр, S- площа досліджуваного об'єкта) [11]. Для кожного випадку було зроблено виміри 500 одноядерних гепатоцитів, в ядрі яких визначалось ядерце. Ми вимушені були провести ці виміри на аутопсійному матеріалі через те, що виражений внутрішньопечінковий холестаз є одним із протипоказань до пункційної біопсії печінки [12].

Для оцінки ступеня достовірності результатів дослідження застосували варіаційно-статистичний метод аналізу отриманих результатів за допомогою персонального комп'ютера (програма Microsoft Excel). Статистичну обробку проводили за допомогою пакета “STATISTICA for Windows®”.

Результати та їх обговорення

На мікропрепаратах печінки, забарвлених гематоксиліном і еозином, при цирозі печінки з холестатичним компонентом спостерігаються поодинокі гепатоцити, в яких ядро має конденсацію і маргінальне розміщення хроматину. Цілість ядерної оболонки збережена. Цитоплазма у таких гепатоцитах ущільнена. Форма клітин і їх ядер порушена. Ці ознаки, характерні для некрозу і апоптозу, виявляються при першій стадії апоптозу. У деяких гепатоцитах ми спостерігали великі ацидофільні гранули. Зміни форми ядра і клітини, наявність ацидофільних гранул свідчать за апоптоз, оскільки при некрозі в мембранах ядра і клітинній оболонці відбуваються деструктивні зміни [2].

Щоб уникнути суб'єктивізації в оцінці деформації тіла гепатоцита та його ядра, ми застосували морфометричний метод дослідження. Поява численних випинів цитоплазми і деформація ядра, які характерні для процесу апоптозу, підтвердилися змінами показника форми клітини і форми ядра.

За зміни форми клітин свідчить показник форми гепатоцитів (F₁), який збільшився до 1,370,13 (контроль - 0,9410,002, р<0,05). Переважна більшість гепатоцитів на гістограмі розміщується в межах понад 1,20-1,25 (98,4%), тоді як у контролі межі розподілу гепатоцитів за цим показником знаходяться між 1,0 і 1,20. Встановлені зміни цього показника пояснюються вираженою деформацією гепатоцитів.

Відповідно змінюється і форма ядра гепатоцита. Показник форми ядер гепатоцитів становить 1,340,15 (контроль _ 0,9500,002, р<0,05). На відміну від контролю майже відсутні ядра з показником їх форми (F₂), меншим від 1,10 (1,9%). Водночас кількісно переважають ядра з показником понад 1,10 -1,40 (98,1%). У нормі в гістограмі цього показника виявляються відношення зворотної спрямованості.

Площа профілю гепатоцитів у середньому зменшилася до 118,4823,54 мкм² (контроль - 182,17 2,54 мкм², р<0,05), а площа профілю ядер гепатоцитів - до 23,082,55 мкм² (контроль -35,320,60 мкм², р<0,05). Деформація тіл та зменшення площі гепатоцитів свідчать на користь пошкодження в клітинах елементів цитоскелета і є типовою морфологічною ознакою апоптичної клітини [13].

У пацієнтів ми визначали клітини з рецептором CD95+ в периферійній крові і встановили, що їх кількість стає 6,500,87 у хворих на холестатичну форму цирозу печінки, тоді як у контрольній групі (без холестазу) їх виявляється значно менше - 3,750,63 (норма _ 2,180,22, р<0,05). Зіставляючи цей показник з вмістом TNF-, ми зауважили, що його рівень у цих хворих підвищився і досяг 345,5023,60 пг/мл (у здорових _ 104,328,63 пг/мл, р<0,05). У контрольній групі (пацієнти без ознак холестазу) цей показник також зростає (до 134,206,35 пг/мл), але в меншому ступені, порівняно з холестатичною формою цирозу печінки. При первинному біліарному цирозі також спостерігається значне підвищення TNF- [14].

Відомо, що TNF- запускає процеси апоптозу клітин. Результати нашого дослідження хворих на цироз печінки показують активацію клітин через зміну їх рецепторного апарату і збільшення експресії CD95+. Маючи на увазі, що Fas-рецептор експресується не тільки на лімфоцитах, ми допускаємо думку про системну відповідь, появу Fas-рецептора водночас і на гепатоцитах. У результаті слід очікувати зростання апоптозу гепатоцитів. А.Е.Грязин и др.[15] спостерігав прямий кореляційний взаємозв'язок рівня апоптозу і сироваткової концентрації TNF- при хронічному гепатиті С, що, на їх думку, свідчить за важливу роль даного цитокіну в розвитку системної запальної реакції.

Гепатоцити можуть підлягати такому впливу ще й у результаті активізації ПОЛ і пригнічення АОС. При визначенні стану процесів ПОЛ та АОС у хворих із холестатичною формою цирозу печінки нами встановлено, що вміст малонового діальдегіду в них підвищується до 5,450,11 нмоль/л (контроль _ 4,920,28 нмоль/л, р<0,05, здорові люди - 3,870,13 нмоль/л). Вміст каталази у хворих при холестатичній формі цирозу печінки зростає до 78,810,68 мг Н₂О₂ /л (у хворих без холестазу _ 73,291,04 мг Н₂О₂ /л, р<0,05; у здорових - 68,770,58 мг Н₂О₂ /л). Зміни цих двох показників свідчать за порушення процесів ПОЛ у бік підвищеного утворення вільних радикалів і хронічного перебігу захворювання. У цих же хворих (холестатична форма) значно зменшується вміст церулоплазміну і трансферину, відповідно до 11,850,64 ммоль/л і 0,1850,004 ммоль/л (у здорових - 28,920,48 ммоль/л та 0,1990,003 ммоль/л, р<0,05). При цирозі печінки без холестазу ці показники мають менш виражені зміни, відповідно 12,180,74 ммоль/л і 0,1790,0021 ммоль/л. Відмічені зрушення стверджують погіршення стану АОС в обох групах хворих, що більш виражені в пацієнтів із холестатичним синдромом. За даними A.M.Diehl [16], TNF- є потенціально токсичним цитокіном і може індукувати пошкодження мембран мітохондрій шляхом активації вільнорадикальних реакцій. Тобто при цирозі печінки з холестатичним компонентом накладаються імунологічні і оксидативні впливи, які підсилюють один одного.

Визначаючи рівень IFN-, ми встановили, що вміст цього цитокіну також значно збільшується у хворих на холестатичну форму цирозу печінки - 261,06,66 пг/мл (р<0,05), у контрольній групі - 134,351,76 пг/мл (р<0,05), у нормі _ 34,561,28 пг/мл. INF- може індукувати апоптоз шляхом підготовки гепатоцитів та їх преактивації [17]. До того ж INF-, маючи імуномодулюючий ефект, є типовим цитокіном і регулятором імунної системи, проявляє противірусні ефекти, стимулює продукцію інших цитокінів, індукує синтез специфічних ферментів, посилює специфічну цитотоксичність лімфоцитів відносно клітин-мішеней [18].

Водночас вміст ІЛ-2 зменшився на 34,9% і досяг 112,801,77 пг/мл (норма _ 172,2012,30 пг/мл, р<0,05), а рівень ІЛ-4 становив 10,770,26 (у контрольній групі _ 13,210,62, р<0,05; у нормі _ 14,940,33). Тобто порушується ендогенна програма захисту клітин від апоптозу [19].

За нашими даними, рівень ІЛ-1 в обстежених хворих на цироз печінки з холестазом у середньому був підвищений на 35,7% порівняно зі здоровими і досягав 38,630,26 пг/мл (норма _ 28,330,49 пг/мл, р<0,05). Вміст ІЛ-6 підвищився до 129,172,09 пг/мл (у контрольній групі - 55,231,11 пг/мл, р<0,05; у здорових осіб - 12,181,65 пг/мл). В.Т.Ивашкин и др.[20] вважають, що вміст ІЛ-6 корелює з важкістю цирозу. У патогенезі пошкодження печінки і розвитку системної запальної реакції при хронічному гепатиті С саме ці прозапальні цитокіни відіграють неабияку роль [21]. Прозапальні цитокіни, що виробляються макрофагами печінки, готують зірчасті клітини (клітини Іто) до фіброгенної відповіді на ростові фактори, які, у свою чергу, посилюють синтез колагену.

Б.Н.Левитан и др. [22], вивчаючи цитокіновий профіль крові при цирозах печінки, наголошують на тому, що у таких хворих при наростанні печінково-клітинної недостатності в крові відбуваються накопичення дестабілізованих форм TNF-, різноспрямована реакція прозапальних (TNF- і ІЛ-1) і протизапальних цитокінів (ІЛ-4), що призводить до порушення активації і диференціювання імунокомпетентних клітин, а звідси _ до розвитку імунопатологічних реакцій, патології гомеостазу і прямого пошкоджувального ефекту цитокінів.

На підставі отриманих даних ми вважаємо, що при цирозі, особливо при його холестатичній формі, у розгортанні пошкоджувальних паренхіму печінки процесів лежать складні імунологічні механізми, переплетені з порушенням ПОЛ і недостатністю АОС. Ці фактори тягнуть за собою активацію апоптозу гепатоцитів, розростання сполучної тканини, фібротизацію печінки. Клінічно в обстежених хворих на фоні відомих специфічних для холестазу проявів - жовтяниці, шкірного свербежу, гіпохолічного калу, а також підвищеного рівня прямого і кон'югованого білірубіну, лужної фосфатази і гамма-глутамілтранспептидази - спостерігаються більш виражені диспептичні прояви, зміни в клінічному та біохімічному аналізах крові, частіше виникають симптоми гепатоцелюлярної недостатності і портальної гіпертензії, порушення білкової і детоксикаційної функції печінки.

Запропонований морфометричний, біохімічний та імунологічний підходи до визначення стану гепатоцитів є об'єктивним і суттєвим доповненням у перспективі подальших досліджень захворювань печінки та їх лікування.

Висновки

1 У хворих на цироз печінки загибель гепатоцитів розвивається шляхом посиленого апоптозу в результаті системної імунної відповіді, поєднаної з порушенням системи перекисного окислення ліпідів і антиоксидантної системи.

2 Апоптоз лімфоцитів проявляється одночасним підвищенням вмісту CD95+ на тлі збільшення рівня TNF-, ІЛ-1, ІЛ-6, IFN- і зменшенням ІЛ-2 і ІЛ-4 у сироватці крові.

3 Апоптоз гепатоцитів підтверджується морфологічними картинами, типовими для цього процесу, зі змінами морфометричних показників, що характеризують деформацію гепатоцитів та їх ядер.

Список літератури