Функции гемоглобина в неповрежденных эритроцитах миноги: роль мембраны эритроцитов в регуляции газового транспорта и кислотно-основного баланса

Введение

Гемоглобин имеет важнейшее биологическое значение как наиболее широко распространенный среди современных животных дыхательный пигмент, обладающий уникальными свойствами, связанными с транспортом кислорода и углекислоты.

Одна из важнейших функций организма, определяющая характер и уровень энергетических процессов,-- дыхание или обеспечение его кислородом. Осуществляется эта функция, как известно, неодинаково у различных групп животных. Малоактивные животные (простейшие, губки, кишечнополостные, некоторые черви, моллюски, ракообразные) обеспечиваются кислородом путем простой диффузии через поверхность тела. Высокоактивные животные, нуждающиеся в больших количествах кислорода, обладают соответствующими эффективными механизмами, обеспечивающими поступление кислорода в организм. В частности, насекомые и некоторые другие представители членистоногих обладают трахейной системой, пронизывающей все тело и доставляющей кислород непосредственно тканям и клеткам самых отдаленных от поверхности частей тела. Это чрезвычайно эффективный способ, обеспечивающий высокий уровень энергетических процессов в организме этой группы животных.

Принципиально отличен от первых двух способ обеспечения организма кислородом при помощи дыхательных пигментов крови (позвоночные животные, некоторые черви) или гемолимфы (часть червей, ракообразных, моллюсков). В то время как при дыхании через поверхность тела и при помощи трахей кислород доставляется непосредственно клеткам тела, у пигментсодержащих животных кислород из органов аэрации доставляется клеткам тела посредством дыхательных пигментов крови или гемолимфы.

Следовательно, помимо органов дыхания, в которых происходит обмен газов, у этой группы животных кровь содержит особые вещества -- дыхательные пигменты, способные связывать кислород. Кроме того, у них имеется сосудистая система, по которой движется кровь, вступая в контакт со всеми частями тела.

В настоящее время известно четыре дыхательных пигмента, встречающихся в организме современных животных: гемоглобин, гемоцианин, хлорокруорин и гемэритрин. Из них только гемоцианин содержит медь, в состав остальных входит железо. Близко родственны по структуре гемоглобин и хлорокруорин.

Гемоглобин является основным дыхательным пигментом, распространенным среди всех групп животных

Структура гемоглобина

В состав молекулы гемоглобина входят четыре одинаковые гемовые группы. Гем представляет собой протопорфирин, содержащий центрально расположенный ион двухвалентного железа. Молекула протопорфирина состоит из четырех пиррольных колец, связанных метиновыми мостиками; к кольцам присоединены боковые цепи характерного строения. Ключевую роль в активности гемоглобина играет ион железа, расположенный в центре молекулы протопорфирина. Соединение с этим ионом посредством двух координационных связей и двух связей, образовавшихся вследствие замещения водорода, превращает протопорфирин в гем. Структура гема целиком расположена в одной плоскости. В процессе переноса кислорода гемоглобином молекула Од обратимо связывается с гемом, при этом валентность железа не изменяется.

Присоединяя кислород, гемоглобин (Hb) превращается в оксигемоглобин (HbOx). Чтобы подчеркнуть тот факт, что валентность железа при этом связывании не меняется, реакцию называют не окислением, а оксигенацией; обратный процесс называется дезоксигенацией. Когда хотят специально отметить, что гемоглобин не связан с кислородом, его называют дезоксигемоглобином.

Гем может подвергаться не только оксигенации, но и истинному окислению. При этом железо переходит из двухвалентного состояния в трехвалентное. Окисленный гем называется гематином (мет-гемом), а вся полипептидная молекула в целом - метгемоглобином. В крови человека метгемоглобин содержится в незначительных количествах, но при некоторых заболеваниях и отравлениях определенными ядами его содержание возрастает. Опасность таких состояний заключается в том, что окисленный гемоглобин не способен переносить кислород к тканям.

Видовые свойства гемоглобинов крови различных животных (различные формы кристаллов, сродство гемоглобина к кислороду и др.) определяются особенностями глобина, так как гемы всех исследованных гемоглобинов оказались идентичными.

Гемоглобин миноги

Функционирование гемоглобина в эритроцитах миноги предлагает уникальное среди позвоночных решение газового транспорта. Гемоглобин миноги в неповрежденных эритроцитах находится в олигомерном\мономерном равновесии и обладает сходным с остальными активными рыбами кислородным сродством. Проницаемость мембраны эритроцитов миноги для кислотных и основных эквивалентов очень низка и таким образом бикарбонат плазмы не может в достаточной степени дегидрироваться до CO₂ пока кровь находится в жабрах. Это потенциальное ограничение на выведение CO₂ преодолевается высоким внутриэритроцитарным pH и изменениями pH внутри эритроцита связанными с оксигенацией из-за относительной непроницаемости мембраны эритроцитов для кислотных эквивалентов внутриэритроцитарный гемоглобин не принимает участие в кислотно-основном забуферивании внеклеточного компартмента. Вследствие этого внеклеточные кислотные заряды вызывают заметные изменения pH плазмы.

Функции гемоглобина миног в основном изучались в разбавленных растворах. На основании этих исследований ясно, что гемоглобин миноги в растворах показывает как кооперативность, так и эффекты Бора и Хэлдена. Кроме того, сродство гемоглобина к кислороду у миноги зависти от концентрации гемоглобина в растворе. Это открытие, а так же наблюдение, что молекулярная масса деоксигенированного гемоглобина больше, чем оксигенированного показывают, что в миногах кооперативность связывания кислорода и влияние протонов на сродство гемоглобина к кислороду вызваны обратимыми реакциями ассоциации\диссоциации олигомеров\мономеров. Это явление противоположно ситуации с гемоглобином у всех других позвоночных, у которых эти эффекты являются результатом конформационных изменений тетрамерной молекулы.

Поведение гемоглобина миноги в растворе может быть объяснено следующей моделью: димерная\олигомерная форма молекулы имеет низкое сродство к кислороду вследствие ограничений, следующих из взаимодействий между субъединицами. В димере связывание кислорода ослабляет эти взаимодействия, молекула диссоциирует на субъединицы, вследствие чего сродство к кислороду каждой субъединицы возрастает. Вероятно, что дистальный гистидин (Е7) вовлечен в аллостерический переход: в мономерной форме он находится во внутренней позиции внутри гемового кармана (где он может образовывать водородную связь с кислородом), а в димерной форме гистидин (Е7) находится в наружном положении (где он формирует водородную связь с аспартатом и глутаматом соседней молекулы). Эффект Бора в таком случае объясняется различием между значениями pK гистидина во внутреннем положении (5,5-6,0) и во внешнем (ок. 8,0).

До недавнего времени было затруднительно интерпретировать данные по связыванию кислорода цельной кровью на основе поведения гемоглобина в растворе: например, сродство крови миноги к кислороду оказалось намного больше, чем ожидаемое на основании поведения гемоглобина в растворе, а так же численное значение фактора Бора, оцененное для всей крови оказалось намного ниже, ожидаемого на основании данных из раствора.

Противоречие между данными по связыванию кислорода гемоглобином в растворах и в эритроцитах было разрешено после открытия уникального среди позвоночных свойства мембраны эритроцитов миноги: ее проницаемость для кислотных и основных эквивалентов, а так же для хлорида очень низка. Вследствие очень незначительного пассивного транспорта кислотных эквивалентов через эритроцитарную мембрану внутриклеточные значения pH поддерживаются на высоком уровне в основном Na+/H+ обменом через мембрану.

Это уникальное свойство мембраны влияет на функционирование гемоглобина в эритроцитах миноги, на газовый транспорт и кислотно-основную регуляцию.

Сродство гемоглобина к кислороду у миноги

Сродство гемоглобина к кислороду у миноги такое же, как и у других активных рыб. Поддержание этого сродства к кислороду требует, чтобы внутриэритроцинарный pH сохранялся на более высоком уровне, чем у костных рыб. Lampetra fluviatilis и Petromyzon marinus поддерживают внутриэритроцитарный pH используя механизм, подобный натриево-протоновому обмену.

Кооперативность связывания кислорода

Деоксигенированный гемоглобин миноги находится в олигомерной форме, обладающей низким сродством к кислороду, которая стабилизирована при низких значениях pH (при очень низком pH диссоциация не наблюдается). При увеличении значений pH взаимодействия между индивидуальными цепочками олигомеров ослабляются, и оксигенация вызывает диссоциацию обладающих низким сродством к кислороду олигомеров на обладающие высоким сродством мономеры. Чем выше значение pH, тем ниже требуемое для диссоциации олигомеров парциальное давление CO₂.

Эффект протонов на функции гемоглобина

Ранние исследования влияния pH на кислород-связывающие свойства крови миноги допускали, что фактор Бора мал (примерно от -0,1 до -0,3). Однако в тех исследованиях сродство гемоглобина к кислороду рассматривалось как функция от внеклеточного pH, поскольку в то время уникальность регуляции внутриклеточного pH в эритроцитах миноги не была известна. Более поздние исследования, в которых изменение сродства к кислороду соотносили с внутриклеточным pH показали, что фактор Бора достаточно велик. У Petromyzon marinus при 10° С и pHi=7.3-7.6 значение фактора Бора (?logP50/?pHi) оказались равны -0,63, а в Lampetra fluviatilis при 18?С и при pHi=6,7-8,0 фактор Бора равен 1,03. Для Lampetra fluviatilis это значение показывает освобождение одного протона на один мономерный гемоглобин. Подобное же значение было получено на основе небикарбонатной буферной способности эритроцита, внутриэритроцитарной концентрации гемоглобина и внутриклеточных изменений pH при оксигенации. Таким образом эффект Бора гемоглобина миноги происходит из-за выпуска одного протона на одну цепочку гемоглобина при оксигенации.

У миноги эффекты Бора и Хэлдена ориентированы на транспорт CO₂. Эффект Хэлдена в интактных эритроцитах миноги настолько велик, что внутриэритроцитарный pH венозной крови выше, чем артериальной. Роль эффекта Хэлдена в транспорте CO₂ кровью миноги становится ясной, если рассмотреть механизм этого транспорта. Вследствие относительной непроницаемости мембраны эритроцитов миноги для бикарбоната и других кислотно-основных эквивалентов, карбоангидраза, содержащаяся в эритроците недоступна для бикарбоната плазмы. Вследствие этого только небольшой процент бикарбоната плазмы может быть превращен в CO₂ в некатализируемой реакции дегидратации, когда кровь проходит через жабры, потому, что полупериод некатализируемой реакции равен 1 минуте при 15 ?С, а время пребывания крови в жабрах всего несколько секунд. Таким образом, большинство удаляемого из крови CO₂ в жабрах приходит из эритроцитарных бикарбонатных запасов и эффективность транспорта CO₂ зависит от того, какое его количество эритроциты смогут загрузить в тканях и выгрузить в жабрах. Главные факторы, влияющие на это: изменение давления CO₂ в кровообращении и кривые диссоциации CO₂. На основании кривых диссоциации CO₂ для деоксигенированных и оксигенированных эритроцитов Lampetra fluviatilis понятно, что более 80 % уменьшения содержания CO₂ в эритроцитах может быть приписано к зависящему от оксигенации уменьшению содержания CO₂ и менее чем 20 %-к уменьшению давления CO₂. Оксигенация не влияет на содержание CO₂ в плазме. Зависящее от оксигенации уменьшение внутриэритроцитарного содержания CO₂ полностью объясняется зависящим от оксигенации уменьшением внуриэритроцитарного pH, вызванным эффектом Хэлдана. Таким образом, основываясь на данных in vitro можно сказать, что эффекты Бора и Хэлдана определяюще влияют на транспорт CO₂ кровью миноги. Хотя данные in vivo немного отличны, они так же показывают ведущую роль эритроцитов миноги в экскреции CO₂ в сравнении: только 15 % выводимого CO₂ у радужной форели происходит из эритроцитов.

Из-за высокого венозного внутриэритроцитарного pH (на 0.15-0.2 ед. выше, чем в артериальной) у Petromuzon marinus CO₂ эффективно загружается в эритроцитарные запасы, в основном в виде бикарбоната. Вследствие уменьшения давления CO₂ крови в жабрах, а так же, вследствие уменьшения внутриэритроцитарного pH из-за высвобождения протонов благодаря оксигенации гемоглобина, CO₂ интенсивно выгружается в жабрах. Таким образом, уменьшение общего содержания CO₂ при прохождении крови через жабры у миноги подобно таковому у активных костных рыб, таких как радужная форель, за исключением того факта, что бикарбонат плазмы у миноги играет очень ограниченную роль в выведении CO₂ из-за медленного проникновения бикарбоната через мембрану.

Влияние концентрации гемоглобина на его функционирование

В разбавленных растворах сродство к кислороду гемоглобина миноги заметно зависит от его концентрации. Увеличение концентрации уменьшает сродство благодаря возрастанию процента низкосродственных олигомеров. Так как гемоглобин в интактных эритроцитах показывает кооперативность и эффект Бора, вероятно, реакции ассоциации\диссоциации гемоглобина протекают также и в эритроците. Если это имеет место, то сродство гемоглобина к кислороду должно зависеть от изменения клеточного объема (которое влияет на внутриклеточную концентрацию гемоглобина). Эта зависимость была проверена экспериментально путем осмотического сжатия клеток и последующего измерения P50. Результаты показали уменьшение сродства с уменьшением объема клетки. Кроме этого уменьшения сжатые эритроциты обычно имеют более высокий pH, чем эритроциты с нормальным объемом. Таким образом, концентрационные изменения оказываются способными вызывать изменения в агрегации молекул гемоглобина и, следовательно, сродства гемоглобина к кислороду. Пока не ясно, являются ли подобные изменения объема частью нормальной физиологической регуляцией функции гемоглобина, однако данные об адаптировавшихся к гипоксии Lampetra fluviatilis показывают, что средняя концентрация гемоглобина в эритроците становится ниже, после недели адаптации к гипоксии, чем при нормоксии.

Ограничение буферных свойств гемоглобина вследствие низкой проницаемости мембраны эритроцитов миноги к кислотным эквивалентам.

Общая схема забуферивания внеклеточных кислотных зарядов у позвоночных такова: входящий в плазму протон реагирует с ионом бикарбоната и образует CO₂ и Н₂О. Образовавшийся СO₂ диффундирует в эритроцит и гидратируется до бикарбоната и протона. Протоны поглощаются внутриклеточным буфером (в особенности гемоглобином), а бикарбонат может покинуть клетку через анионобменник, таким образом, пополняя внеклеточные буферные запасы. Хотя эритроциарная буферная способность у миног существует, эта схема к ним не применима из-за медленного прохождения бикарбоната через мембрану эритроцита, следовательно, внеклеточные кислотные заряды могут быть забуференны только буфером плазмы, а небикарбонатная буферная способность плазмы очень низка. Таким образом, внеклеточные кислотные заряды вызывают заметные изменения pH крови (внеклеточного pH) миног. Например, выдержка Lampetra fluviatilis в течение 24 часов при pH=4,0 вызвала уменьшение pH плазмы на 0,9 ед., а подобные действия с радужной форелью вызвали уменьшение всего на 0,1-0,3 ед.

Заключение

Функционирование гемоглобина в эритроцитах миноги предлагает уникальное среди позвоночных решение газового транспорта. Кооперативность связывания кислорода и влияние протонов на сродство гемоглобина к кислороду проявляются у миноги из-за реакции диссоциации\асоциации молекул гемоглобина. Вследствие низкой проницаемости мембраны эритроцитов для бикарбоната только небольшая часть бикарбоната плазмы может быть дегидрирована до СO₂ в течение пребывания крови в жабрах. Однако это ограничение преодолевается высоким внутриклеточным pH и заметными изменениями pH, связанными с оксигенацией. Таким образом, эффективность экскреции CO₂ увеличивается.

Хотя транспорт О₂ и CO₂ кровью миноги так же эффективен, как у активных костных рыб, забуферивание внеклеточных кислотных зарядов неэффективно (из-за непроницаемости мембраны эритроцитов для кислотных эквивалентов). Как следствие: внеклеточные кислотные заряды вызывают заметные колебания pH плазмы у миног.

Таким образом, главное преимущество, полученное, вследствие эволюции анионного обмена, связано не с газовым транспортом, а с буферной системой крови.

Список используемой литературы

3. Коржуев П.А. (1964) Гемоглобин: сравнительная физиология и биохимия., Москва. изд. «Наука»

4. Nikinmaa, M., Airaksinen, S., Virkki, L.V., (1995) Haemoglobin function in intact lamprey erythrocytes: interactions with membrane function in the regulation of gas transport and acid-base balance. J. Exp. Biol.

5. Ferguson, R.A. Sehdev, N. Bagatto B. Tufts B.L. (1992) In vitro interactions betveen oxygen and carbon dioxide transport in the blood of the sea lampry (Petromyzon Marinus)., J. Exp. Biol.