Тетяна Панова,

кандидат біологічних наук, доцент,

Донецький державний медичний університет

ім. М. Горького

МОЖЛИВОСТІ МОДУЛЯЦІЇ ОПІОЇДНИХ РЕЦЕПТОРІВ

Пошуки нових можливостей впливу на опіоїдну сигналізацію - актуальне питання сучасної фізіології і медицини. Важливість цих пошуків обумовлена гострою соціальною і медичною шкодою, яку спричиняє наркоманія суспільству в цілому і окремій людині, що зловживає наркотиками. Адже при зловживанні наркотиками в першу чергу ушкоджується саме опіоїдна система мозку. Сучасні підходи до лікування цього захворювання основані на застосуванні агоністів або антагоністів опіоїдних рецепторів. Агоністи використовують, коли треба підмінити "важкі наркотики (героїн, морфін) "легкими" (метадон, бупренорфін) - так звана заміщуюча терапія [1]. Вважається, що шкода від таких "легких" наркотиків менша, ніж від "важких". Антагоністи використовують, коли треба нейтралізувати або запобігти дії наркотиків [2]. В обох підходах разом з певними досягненнями і перевагами є безліч недоліків. Найголовніші з них: розвиток залежності від самих ліків ("легких" наркотиків), важкий абстинентний синдром, який провокується антагоністами і не усувається навіть тривалим загальним наркозом, рецидиви вживання наркотиків.

Сучасна фармакологія пропонує велику кількість різноманітних опіоїдних агоністів і антагоністів, які відрізняються активністю, тривалістю дії, вибірковістю дії на окремі типи і підтипи рецепторів і т.і.

На морфійзалежних щурах нами показано антиабстиненту дію нової речовини - коменової кислоти [3]. Ця речовина має природне походження, але дотепер було відомо лише про її ранозагоюючі властивості. Яким чином вона взаємодіє з мембраною клітини? Чи пов'язана ця взаємодія з опіоїдними рецепторами? В літературі ми не зустріли відповідей на ці питання.

Метою цієї роботи було вивчення механізму впливу коменової кислоти на трансмембранну опіатну сигналізацію. Виділяють як мінімум три типи опіатних рецепторів: ?, ?, та ?. Самостійність інших типів опіатних рецепторів остаточно поки ще не доведена [7]. У регуляцію функціональної активності церебральної системи винагороди, одного з основних компонентів формування пристрасті, залучені опіатні рецептори всіх трьох типів [5]. Опіатні рецептори викликають клітинну відповідь за допомогою активації G-білків сімейства Gi/Go, чутливих до коклюшного токсину, що регулюють різні ефектори. До основних ефектів опіатів відносять інгібіцію аденілатциклази, активацію калієвої і пригнічення кальцієвої провідності [7].

Одним з найбільш вдалих прийомів вивчення ефективності сигналізації рецепторно-G-білкової системи є використання радіоактивного негідролізатного аналогу ГТФ, який зв'язується з ? субодиницями G-білків при активації агоністом відповідних рецепторів. Оскільки ГДФ-зв'язана форма ? субодиниць є неактивною у відношенні ефекторів, то й оцінити ступінь активації рецепторно-G-білкової системи з використанням [³⁵S]ГТФ?S на тлі значного надлишку ГДФ можна зі значним ступенем вірогідності [10]. У цьому розділі досліджували вплив коменової кислоти на активацію G-білків агоністом ?-опіатних рецепторів (DALE) і агоністом переважно ?-опіатних рецепторів (морфін) у плазматичних мембранах з мозку щура.

[³⁵S]ГТФ?S (1162 Ки/ммоль), Перколл, носії для хроматографії і сцинтиляційний коктейль ASC були отримані від Amersham Pharmacia Biotech (Великобританія). Сахароза (molecular research grade) від Beckman (США). Суміш інгібіторів протеаз (“Complete^TM, EDTA-free”), ГДФ Na-сіль, ГТФ(?S) гуанозін-5'-O-(3-тіотрифосфат) HPLC-очищений були від Roshe/Boehringer (США). Скло-волоконні фільтри Whatman GF/В від Whatman Со. (Великобританія). Інші реактиви були вироблені Sigma (США).

Для виділення плазматичних мембран з мозку щурів використали 10 самців щурів. Тварин анестезували ефірним наркозом, декапітували і тканини мозку подрібнювали на льоді.

Плазматичні мембрани одержували в такий спосіб: тканини мозку від 4 тварин гомогенізували на льоді в скляному гомогенізаторі у 8-кратному обсязі забуференого HEPES-NMDG (25 мМ, pН 7.3) розчину 250 мМ сахарози із сумішшю інгібіторів протеаз (Boerhinger), 1 мМ ЕГТА, 1 мМ ДТТ і 2 мМ MgSO₄. Грубий гомогенат центрифугували 5 хв (1000 g) при 4^oС. Поділ мембран проводили за методом M.A. Kiebler et al. (1999) [4] з деякими модифікаціями. Супернатант наносився на східчастий градієнт (по 6 мл 11%, 17%, 25% і 33%) розчину Перколла у забуференому HEPES-NMDG (25 мМ, pН 7.3) розчині 250 мМ сахарози, 1 мМ ЕГТА. Градієнт центрифугували при 4^oС в Beckman ультрацентрифузі в SW40Ti-роторі при кутовій швидкості (?) і часі (t), розрахованих по формулі 2,6x10⁹ ?²t для 32500 g. Фракція плазматичних мембран відбиралася, поділялася на рівні частини і заморожувалася в рідкому азоті, де і зберігалася до використання. Перед проведенням експерименту аліквота мембран (1,5 мг) наносилася на стовпчик з Sepharose 2CL-B (2,5х16 см), урівноважену інкубаційним буфером без гуанінових нуклеотидів, сапоніну й опіатних лігандів. Фракція плазматичних мембран, яка вийшла у вільному обсязі, преінкубірувалася із ГДФ і сапоніном (50 мкг/мл) протягом 60 хв при 5^oС. У деяких випадках мембрани преінкубірувалися додатково з коменовою кислотою (100 мкМ).

Перед додаванням [³⁵S]GTP?S мембрани преінкубірувалися з агоністом 5 хв при 30^o. Мембрани інкубірували 60 хв при 30^o у кінцевому обсязі 100 мкл інкубаційного розчину, що містив: HEPES-NMDG - 25 мМ (pН 7.3), 1 мМ ЕГТА, MgSO₄ - 2 мМ, 50 мкг/мл сапоніну, 1 мМ ДТТ і 1 нМ [³⁵S]GTP?S, різні концентрації ГДФ, різні концентрації агоністу опіатних рецепторів, 0,8-2,0 мкг мембранного білка на пробу [8], з деякими модифікаціями. У різних експериментах KCl чи NaCl додавався до концентрації 20 мМ, при цьому концентрація NMDG-Cl (pН 7.3) доводилася до 80 мМ. Кінцева концентрація іонів Cl^- складала 100 мМ у всіх випадках. Реакція зупинялася 2,5 мл охолодженого на льоді Tris-HCl буферу 25 мМ (pН 7.3), MgSO₄ - 2 мМ і 100 мМ NaCl і негайною (1,0-1,5 с) фільтрацією через скловолоконні фільтри Whatman GF/В. Фільтри промивалися двічі тим же розчином, висушувалися і радіоактивність проб визначалася в сцинтиляційному лічильнику Rackbetta LKB-4000 (LKB, Sweden).

Кількість білка визначали модифікованим методом Бредфорда [9], використовуючи як стандарт сироватковий альбумін бика.

Статистична обробка результатів експериментів і побудова графіків проводилася з використанням програми Origin 4.0 (Microcal Software, Inc. Northampton, США).

Для стимуляції зв'язування [³⁵S]ГТФ?S опіатними агоністами абсолютно необхідний ГДФ. Концентрація ГДФ, яка необхідна для максимального ефекту, варіює в різних рецепторних системах [10]. Крім того, відомо, що для максимального агоніст-залежного зв'язування [³⁵S]ГТФ?S необхідна присутність іонів Na, що знижує рівень базальної активності G-білків за рахунок інгібірування агоніст-незалежної (конститутивної) активності рецепторів [8]. У якості агоністів використовували DALE (селективний ліганд ?-опіатних рецепторів) і морфін (активує переважно ?-опіатні рецептори) [7]. Для визначення концентрації ГДФ, необхідної для максимальної агоніст-залежної стимуляції зв'язування [³⁵S]ГТФ?S, досліджували залежність зв'язування [³⁵S]ГТФ?S від концентрації ГДФ у присутності 20 мМ NaCl. Починаючи з концентрації 1 мкМ, ГДФ знижує зв'язування [³⁵S]ГТФ?S дозо-залежним чином. Максимальна агоніст-залежна стимуляція спостерігається при 10-100 мкМ ГДФ, причому ефект морфіну виявляється при менших концентраціях ГДФ, у порівнянні з DALE. Подальші дослідження проводилися при 10 і 100 мкМ ГДФ для морфіну і DALE відповідно.

Попередні дослідження показали, що коменова кислота сама по собі помітно не впливає на базальне зв'язування [³⁵S]ГТФ?S, але після преінкубації з плазматичними мембранами модулює рівень агонист-залежної стимуляції. Ефект коменової кислоти виявляється при концентрації понад 10-100 мкМ. Для з'ясування характеру модулюючого впливу коменової кислоти досліджували її вплив на залежність зв'язування [³⁵S]ГТФ?S від концентрації DALE і морфіну.

У присутності NaCl (20 мМ) агоніст-залежна активація G-білків відбувається за участю тільки високоафінних до DALE рецепторів (EC₅₀ ~ 70 нМ), і коменова кислота (100 мк) не впливає на цей процес. У присутності коменової кислоти з'являється агонист-залежна активація G-білків низькоафінними рецепторами з EC₅₀ ~ 5 мкМ, що кількісно складає ~70% від активації високоафінними рецепторами. У той же час коменова кислота (100 мк) знижує агоніст-залежну активацію G-білків високоафінними до морфіну рецепторами. При цьому загальна кількість активованих G-білків не змінюється.

Оскільки іони Na самі по собі мають модулюючу дію на опіатні рецептори, для подальшого дослідження впливу коменової кислоти на залежність зв'язування [³⁵S]ГТФ?S від концентрації агоністів іони Na були замінені на іони K, щоб зберегти іонну силу інкубаційного розчину. При цьому відбувається збільшення базального і зниження величини агоніст-залежного зв'язування [³⁵S]ГТФ?S. У присутності КCl (20 мМ) коменова кислота (100 мк) зменшує агоніст-залежну активацію G-білків високоафінними до DALE рецепторами на 40-50%. Активація G-білків низькоафінними рецепторами, навпаки, збільшується (~1,5 рази). EC₅₀ при цьому не міняється (~12 нМ і ~10 мк для високо- і низькоафінних рецепторів, відповідно). Відсутність змін у величині EC₅₀ свідчить про те, що коменова кислота не впливає на афінність рецепторів до агоністу. Таким чином, на тлі дії коменової кислоти при максимальній з використаних концентрацій DALE (40 мк) співвідношення G-білків, активованих високо- і низькоафінними рецепторами зменшується більш ніж у 3 рази без помітної зміни загальної кількості активованих G-білків.

У присутності КCl (20 мМ) коменова кислота (100 мк) не впливає на агоніст-залежну активацію G-білків високоафінними до морфіну рецепторами. Активація G-білків низькоафінними рецепторами збільшується приблизно на 25 %.

Результати радіолігандних досліджень показали, що в присутності як Na⁺, так і К⁺ коменова кислота збільшує агоніст-залежну активацію G-білків через низькоафінні до DALE рецептори. Цими рецепторами може бути або частина популяції ?-опіатних рецепторів, або рецептори інших підтипів, наприклад, ?-опіатні рецептори. Вплив коменової кислоти на активацію G-білків через високоафінні ?-опіатні рецептори залежить від іонного складу середовища: у присутності К⁺ вона зменшується, а в присутності Na⁺ залишається незмінною. У результаті такої модуляції може істотно змінюватися співвідношення активації G-білків, що контролюють сигнальні шляхи, залежні від ?-опіатних рецепторів і рецепторів низькоафінних до DALE. На тлі насичуючих концентрацій агоністу (десятки мк) коменова кислота приводить до збільшення внеску низькоафінних до DALE рецепторів у регуляцію внутрішньоклітинних ефекторів.

Ситуація з морфіном багато в чому протилежна: у присутності Na⁺ чи К⁺ коменова кислота, відповідно, або знижує, або збільшує агоніст-залежну активацію G-білків. Низькоафінні до морфіну рецептори можуть відноситися до особливої популяції ?-опіатних рецепторів або до ?-опіатних рецепторів, оскільки останні також активуються морфіном при великих концентраціях.

Розходження в ефектах коменової кислоти на агоніст-залежну активацію G-білків у присутності Na⁺ чи К⁺, вочевидь, обумовлено специфічною дією іонів Na на опіатні рецептори. Відомо, що іони Na, зв'язуючись з опіатними рецепторами змінюють конформацію молекул рецепторів, у результаті чого відбувається зменшення їхньої спорідненості до агоністів [6], а також зниження спонтанної, агоніст-незалежної активації ними G-білків [8]. Можна припустити, що така зміна конформації опіатних рецепторів у присутності Na⁺ робить процес активації G-білків нечутливим до дії коменової кислоти. Модуляція рецепторної активації G-білків коменовою кислотою ймовірно зв'язана зі зміною кількості активних опіатних чи рецепторів сполучених з ними G-білків. У результаті такої модуляції може істотно змінюватися співвідношення активації G-білків, що контролюють сигнальні шляхи, залежні від ?- і ?-опіатних рецепторів.

Згідно нашим даним, коменова кислота підвищує спорідненість лігандів саме до мюрецепторів, що збігається з полегшенням протікання абстинентного синдрому.

Таким чином, особливості модулюючого впливу коменової кислоти на опіоїдну рецепцію можуть бути обумовлені неоднаковим її впливом на різні підтипи опіоїдних рецепторів. Якщо зіставити це з тим, що: 1) і самі ліганди опіоїдних рецепторів (навіть дуже близькі по будові: морфін, героїн, їхні метаболіти) мають різну спорідненість не тільки до різних підтипів і популяцій рецепторів, але навіть до різних сайтів тих самих рецепторів, 2) в окремі тимчасові інтервали після прийому наркотику процентне співвідношення основного ліганду (морфіну) і його метаболітів різне, стає зрозумілим, наскільки велике різноманіття можливих варіантів здійснення коменовою кислотою своєї дії.

Резюмуючи вищесказане, можна зробити такі висновки:

1. Оскільки в присутності коменової кислоти істотно не міняється загальна кількість активованих G-білків у плазматичних мембранах, напрошується висновок про те, що коменова кислота не активує опіоїдні рецептори. Це дає коменовій кислоті перевагу перед поширеними лікарськими речовинами (“легкими” наркотиками), що використовуються сьогодні для купірування абстинентного синдрому, але самі згодом викликають звикання і фізичну залежність, тому що активують опіоїдні рецептори.

2. Але в той же час коменова кислота є алостеричним модулятором опіоїдних рецепторів. Модуляція відбувається складним чином вибірково. У присутності коменової кислоти міняється характер активації різних типів рецепторів. Змінюється їх афінність. Зростає частка низькоафінних дельта-рецепторів з 0% до 70% від кількості активованих високоафінних дельта-рецепторів при активації їх аналогом лей-енкефаліну DALE, тобто зростає спорідненість ендогенних енкефалінів з дельта-рецепторами. Це має важливе значення в умовах морфійзалежного мозку, у якому активність ендогенної енкефалінової системи пригнічена, що провокує потребу в екзогенному наркотику. В той же час коменова кислота знижує агоніст-залежну активацію G-білків високоафінними до морфіну рецепторами. Це можна трактувати як пригнічуючий вплив цієї речовини на зв'язування морфіну з мю-рецепторами, що також можна вважати корисним для відмови від наркотику. У цілому ж загальна кількість активованих опіоїдних рецепторів залишалася постійною: величина EC₅₀ не мінялася, тобто відбувався просто перерозподіл у складі рецепторів.

3. Такі властивості коменової кислоти сприяють відновленню ушкодженої опіоїдної системи мозку, що пояснює її купіруючий ефект на морфійний абстинентний синдром і більш швидке одужання.

ЛІТЕРАТУРА

1. Иванец Н.Н., Альтшулер В.Б. Заместительная терапия наркомании метадоном и другими опиоидными наркотиками: происхождение, суть и тенденции // Вопросы наркологии.- 2004.- №2.- С. 3-7.

2. Иванец Н.Н., Анохина И.П., Винникова М.А. Опыт применения антаксона при лечении опийной наркомании // М.: НИИ наркологии МЗ РФ, 2000.- 11 с.

3. Казаков В.Н., Панова Т.И., Крылов Б.В., Панов Ю.Е. Купирование морфийного абстинентного синдрома у крыс с помощью коменовой кислоты Нейрофизиология /Neurophisiology.-2003.-Т.35.-№1.-с.50-55.

4. Kiebler M.A., Lopez-Garcia J.C., Leopold P.L. Purification and characterization of rat hippocampal CA3-dendritic spines associated with mossy fiber terminals // FEBS Lett.-1999.- No 445.- P. 80-86.

5. Kluttz B.W., Vrana K.E., Dworkin S.I., Childers S.D. Effects of morphine on forskolin-stimulated pro-enkephalin nRNA levels in rat striatum: a model for acute and chronic opioid actions in brain // Mol. Brain Res.- 1995.- Vol. 32, No 2.- P. 313-320.

6. Ott S., Costa T. Guanine nucleotide-mediated inhibition of opioid agonist binding. Modulatory effects of ions and of receptor occupancy // Biochem. Pharmacol.-1989.- No 38.- P. 1931-1939.

7. Quock R. M., Burkey T. H., Varga E., Hosohata Y., Hosohata K., Cowell S.M., Slate C.A., Ehlert F.J., Roeske W.R., Yamamura H.I. The The delta-Opioid Receptor: Molecular Pharmacology, Signal Transduction, and the Determination of Drug Efficacy // Pharmacological reviews.- 1999.- Vol. 51, No 3.- P. 503-532.

9. SplittgerberA. G., Sohl J. Nonlinearity in protein assays by the Coomassie blue dye-binding method // Anal. Biochem.-1989.- No 179.- P. 198-201.

10. Szekeres P. G., Traynor J. R. Delta opioid modulation of the binding of guanosine-5'-O-(3-[35S]thio)triphosphate to NG108-15 cell membranes: characterization of agonist and inverse agonist effects // J. Pharmacol. Exp. Ther.- 1997.- Vol. 283.- 1276-1284.