Участие медиального мозжечка в механизмах памяти и обучения при формировании различных видов оборонительного поведения

РОССИЙСКАЯ АКАДЕМИЯ МЕДИЦИНСКИХ НАУК

НИИ НОРМАЛЬНОЙ ФИЗИОЛОГИИ

им. П.К. АНОХИНА

На правах рукописи

СТОРОЖЕВА

Зинаида Ивановна

УЧАСТИЕ МЕДИАЛЬНОГО МОЗЖЕЧКА В МЕХАНИЗМАХ ПАМЯТИ И ОБУЧЕНИЯ ПРИ ФОРМИРОВАНИИ РАЗЛИЧНЫХ ВИДОВ ОБОРОНИТЕЛЬНОГО ПОВЕДЕНИЯ

03.03.01 - физиология

Автореферат диссертации на соискание ученой степени

доктора биологических наук

Москва - 2010

Работа выполнена в Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина

Научный консультант:

доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор

Владимир Вячеславович Шерстнев

Официальные оппоненты:

доктор биологических наук, профессор

Валерий Викторович Шульговский

кафедра высшей нервной деятельности

биологического факультета МГУ им.М.В.Ломоносова

доктор биологических наук,

Ольга Николаевна Серова

институт нормальной физиологии им.П.К.Анохина РАМН

доктор медицинских наук, заслуженный деятель науки РФ, профессор

Рита Ушеровна Островская

институт фармакологии им. В.В.Закусова РАМН

Ведущая организация:

Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН

Защита состоится 17 июня в 11.00 на заседании Диссертационного Ученого Совета Д 001.008.01 при Учреждении Российской Академии медицинских наук НИИ нормальной физиологии им. П.К. Анохина РАМН.

Адрес: 125009, Москва, ул. Моховая, д.11, стр.4.

С диссертацией можно ознакомиться в Библиотеке НИИ НФ РАМН.

Автореферат разослан

Ученый секретарь Диссертационного Совета

Кандидат медицинских наук

В.А. Гуменюк

ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ИССЛЕДОВАНИЯ

Актуальность проблемы.

Изучение функциональной роли и особенностей участия различных отделов мозга в интегративной деятельности ЦНС является одной из наиболее актуальных проблем нейробиологии. Наряду с важным теоретическим значением, разработка этой проблемы имеет неоспоримую ценность для выяснения механизмов патогенеза нервно-психических заболеваний, разработки методов их диагностики и терапии. В последнее время все возрастающее внимание в этом плане привлекает мозжечок. Накопленные в лабораторных и клинических исследованиях данные убедительно свидетельствуют, что наряду с регуляцией моторных функций этот отдел мозга вовлечен в обеспечение механизмов памяти и эмоциональных процессов (Schmahmann et al., 2007, Ito, 2005, Калашникова и др., 2000). Однако симптомы, наблюдаемые в клинике при поражениях мозжечка: нарушения абстрактного мышления, внимания, рабочей и зрительно-пространственной памяти, расторможенность и неадекватное поведение (Heath еt al., 1978, 1980, Malm, 1998, Зуева, 2003), достаточно полиморфны, а их систематизация находится на начальном этапе.

В экспериментальных исследованиях участие мозжечка в когнитивных процессах было показано в моделях оборонительного поведения, в то время как в экспериментах с использованием положительного подкрепления были получены отрицательные результаты. Наиболее подробно изучена роль данного отдела мозга в формировании, консолидации и хранении условного мигательного рефлекса (Krupa and Thompson, 1997, Medina et al., 2001). Обнаружено, что с функциями полушарий мозжечка связана инициация мигательной реакции на условный сигнал на стадии генерализации рефлекса, а также структурирование условного ответа во времени на этапе его специализации.

Значительно менее исследовано участие в когнитивных процессах медиального отдела мозжечка - червя, поражения которого наблюдаются при многих нервно-психических заболеваниях, манифестирующих в раннем возрасте (Калашникова и др., 2000, Lawyer G, et al., 2009). Имеются сведения, что с этим отделом мозжечка связано формирование долговременного угашения акустической стартл-реакции (АСР) (Leaton & Supple, 1986, Maschke. et al., 2000), а также консолидация условного обстановочного замирания (Saccetti et al., 2002, 2005) - генерализованных реакций организма, включающих оборонительную и ориентировочную составляющие, обеспечивающих формирование и выполнение более сложных и специфичных оборонительных форм поведения (Н.А. Бернштейн, 1966, Davis, 1984, Richardson and al., 1996).

Высказана гипотеза, что роль мозжечка в процессах обучения и памяти обусловлена существованием в этой структуре собственных внутренних моделей организма и окружающей среды, (Kawato M, Gomi H. 1992, Ito M., 2005). Показано, что механизмы формирования таких моделей связаны со специфичным изменением активности отдельных нейромедиаторных систем. Поступление информации через основные афферентные проекции в мозжечок - лиановидные и мшистые волокна, опосредуется возбуждающими аминокислотами. Кроме того, все большее количество данных указывает, что в формировании и функционировании внутренней модели важную роль играют т.н. «модуляторные», в частности, моноаминергические проекции (Schweighofer N., et al., 2001, 2004). С активностью ГАМК- и глицинэргических интернейронов связывают фильтрацию информации, поступающей по основным афферентным входам, а также изменение свойств внутренней модели под влиянием «модуляторных» проекций (Cavelier P. et al., 2005)

В ряде работ показано, что существенное значение в молекулярно-клеточных механизмах пластичности в мозжечке принадлежит факторам, регулирующим пролиферацию, дифференцировку и выживаемость клеток, (Stansberg C., 2007, Bao et al., 1998, Willson ML et al., 2008). Нейродегенеративные изменения в различных отделах мозжечка выявлены при многих нервно-психических расстройствах (Steinlin M., 2008).

Таким образом, изучение роли мозжечка в процессах обучения и памяти вызывает активный исследовательский интерес. Вместе с тем, механизмы его участия в когнитивных процессах нуждаются в дальнейших исследованиях, а имеющиеся данные зачастую противоречивы. В частности, некоторые авторы (Supple et al., 1988, Fanselow, Poulous, 2005) ставят под сомнение значение медиального мозжечка для консолидации условного замирания, а изменения его активности при формировании угашения АСР, зарегистрированные в различных работах, носят противоположную направленность (Frings M., et al., 2006, Pissiota et al. 2002). Зависимость характера участия мозжечка в формировании следа памяти от интенсивности отрицательного подкрепления и уровня оборонительной мотивации была показана в модели условного замирания (Sacchetti et al., 2007).

В связи с этим, необходимым представляется одновременное изучение динамики АСР и поведения замирания при воздействии на активность червя мозжечка. Такое исследование позволяет оценить участие медиального мозжечка в механизмах пластичности и динамической интеграции ориентировочно-исследовательской, активно-оборонительной и пассивно-оборонительной реакций, а также привыкания и сенситизации, соотношение которых в значительной степени определяет характер и динамику более сложных когнитивных процессов. Однако работы, направленные на анализ формирования нескольких видов поведения при воздействии на функции медиального мозжечка в одних и тех же экспериментальных условиях, единичны, а одновременное изучение поведения замирания и АСР ранее не проводилось. Следует также отметить, что исследование нейрохимических механизмов пластичности в мозжечке в большинстве своем были выполнены in vitro. Оценка роли отдельных нейромедиаторных систем этого отдела мозга в механизмах обучения in vivo осуществлена лишь в немногочисленных экспериментах с использованием модели мигательного рефлекса (Jimйnez-Dнaz L et al., 2007, Paredes DA et al., 2008). Данные относительно влияния факторов, регулирующих пролиферацию, дифференцировку и выживаемость клеток мозжечка, на процессы обучения, в литературе отсутствуют.

Цель исследования:

Целью работы явилось изучение нейрофизиологических и нейрохимических механизмов участия медиального мозжечка в регуляции процессов обучения и памяти при формировании различных видов оборонительного поведения

Задачи исследования:

1. Провести сравнительный анализ участия медиального мозжечка и гиппокампа в безусловного (врожденного) поведения замирания, а также формировании кратковременного и долговременного привыкания АСР в условиях различного уровня обстановочного страха и тревоги.

2. Изучить функциональную роль медиального мозжечка в механизмах сенситизации и десенситизации АСР.

3. Исследовать временную динамику вовлечения медиального мозжечка в процессы консолидации долговременного угашения АСР и условного страха, вызванного воздействием обстановочных стимулов (обстановочного страха).

4. Исследовать изменения уровня нейромедиаторных аминокислот и моноаминов в медиальном мозжечке при кратковременном и долговременном угашении АСР, а также формировании условного обстановочного страха.

5. Изучить влияние экспериментально вызванных изменений активности отдельных нейромедиаторных систем червя мозжечка и модуляции процессов роста, развития и гибели клеток мозжечка на кратковременное и долговременное угашение АСР, а также формирование условного обстановочного страха.

6. Исследовать специфичность вовлечения отдельных нейромедиаторных систем червя мозжечка в механизмы консолидации долговременного угашения АСР и условного страха.

Положения, выносимые на защиту:

1. С активностью медиального отдела мозжечка (червя) связаны механизмы реализации врожденного поведения замирания при изменении обстановочной афферентации.

2. На различных этапах формирования приспособительного поведения в условиях оборонительной мотивации медиальный мозжечок принимает участие в процессах кратковременной и долговременной памяти, обеспечивающих выбор адекватной стратегии поведения на основе интеграции генерализованных пассивно-оборонительных, активно-оборонительных и ориентировочных реакций.

3. При отсутствии подкрепления медиальный мозжечок вовлечен в механизмы долговременной десенситизации, обеспечивающие достижение оптимального уровня активно-оборонительного поведения.

4. Специфичное вовлечение червя мозжечка в обеспечение отдельных форм оборонительного поведения обусловлено избирательными и разновременными изменениями активности нейромедиаторных систем различной эргичности в этом отделе мозга:

- с активностью глутаматэргических синаптических процессов, опосредующих сенсорную информацию, приходящую по мшистым волокнам, связано формирование долговременного угашения ориентировочно-исследовательской составляющей АСР;

- серотонинергические проекции в кору медиального мозжечка и ГАМК-глицинергические тормозные интернейроны участвуют в формировании долговременного угашения оборонительной составляющей АСР, а также в формировании обстановочного пассивно-оборонительного поведения замирания;

- механизмы консолидации долговременного привыкания оборонительной составляющей стартл-реакции связаны со снижением активности серотонинергической системы;

- активность тауринэргической системы сопряжена с механизмами кратковременной сенситизации и кратковременного привыкания, а также долговременной десенситизации и долговременного растормаживания стартл-реакции.

5. Участие медиального мозжечка в системных механизмах приспособительного поведения в условиях оборонительной мотивации связано с обеспечением процессов предпусковой интеграции возбуждений на стадии афферентного синтеза, а также с формированием и функционированием акцептора результата действия.

Научная новизна работы: Впервые получены доказательства участия медиального мозжечка в реализации врожденного пассивно-оборонительного поведения замирания при изменении обстановочной афферентации, а также в обеспечении кратковременного привыкания и кратковременной сенситизации генерализованной активно-оборонительной реакции - АСР. Получены ранее неизвестные результаты об особенностях участия червя мозжечка в механизмах сенситизации АСР обстановочными стимулами. Установлено, что вовлечение медиального мозжечка в обеспечение сенситизации АСР реализуется при более низком уровне обстановочного страха и более высокой активно-оборонительной мотивации в сравнении с участием гиппокампа в этом процессе.

Продемонстрировано участие медиального мозжечка в обеспечении процессов долговременной памяти при десенситизации и растормаживании ориентировочной составляющей генерализованной активно-оборонительной реакции - АСР.

Показано, что с функциями медиального мозжечка связаны процессы консолидации долговременного привыкания АСР. Документирована специфичность и временная динамика вовлечения мозжечка в консолидацию привыкания ориентировочной и оборонительной составляющих АСР: через 5 минут после обучения мозжечок участвует в консолидации долговременного угашения оборонительной составляющей АСР, обусловленного процессами десенситизации; спустя 2 часа - в консолидации долговременного привыкания ориентировочно-исследовательской составляющей АСР и условного обстановочного замирания.

Характеризованы особенности участия червя мозжечка в регуляции периодических колебаний амплитуды АСР.

Впервые изучена динамика содержания нейромедиаторов в коре медиального мозжечка на различных стадиях формирования долговременного привыкания АСР и поведения замирания, а также влияние на эти процессы апплицируемых на червь мозжечка агонистов и антагонистов, отдельных нейромедиаторов. Выявлено избирательное вовлечение серотонин- и ГАМК-эргических систем червя мозжечка в формирование условного обстановочного замирания и долговременного привыкания оборонительной составляющей АСР, а также участие глутамат- и таурин-эргических систем в механизмах долговременного угашения ориентировочной составляющей АСР.

Обнаружено нейропротекторное влияние пептида HLDF6 в условиях клеточной гипоксии червя мозжечка.

На основании полученных результатов выдвинуто положение об интегративной роли медиального мозжечка в обеспечении оптимального соотношения ориентировочных, пассивно-оборонительных и активно-оборонительных реакций на различных стадиях формирования приспособительного поведения в условиях оборонительной мотивации. Обосновано представление о том, что с функциями медиального мозжечка связаны механизмы афферентного синтеза и акцептора результата действия. Специфичное вовлечение червя мозжечка в обеспечение отдельных форм оборонительного поведения обусловлено избирательными и разновременными изменениями активности его нейромедиаторных систем.

Теоретическая и практическая значимость работы. Полученные результаты расширяют и углубляют имеющиеся теоретические представления об участии мозжечка в процессах памяти и обучения. Сформулированные и обоснованные в работе положения о функциональном значении, нейрофизиологических и нейрохимических механизмах вовлечения медиального мозжечка в системную организацию различных видов оборонительного поведения вносят вклад в дальнейшее развитие исследований закономерностей участия этой структуры в интегративной деятельности ЦНС в норме и при развитии психопатологических состояний. Результаты, полученные при изучении динамики АСР и поведения замирания, уточняют современные взгляды на структуру и механизмы кратковременной и долговременной памяти при формировании оборонительного поведения

Оригинальный комплекс методических приемов, использованный в работе, может найти применение в лабораторных и клинических исследованиях, особенностей участия различных отделов мозга в обеспечении когнитивных функций, а также эмоциональных состояний в норме и патологии.

Полученные научные факты могут быть использованы в лекционных курсах по физиологии, нейробиологии и нейрохимии в вузах биологического, медицинского и психологического профиля.

Данные о нейропротекторных эффектах пептида HLDF6 в условиях клеточной гипоксии явились основой для разработки нового лекарственного препарата, обладающего комбинированным нейропротекторным и ноотропным действием, находящегося на данный момент в стадии доклинических испытаний.

Апробация диссертации:

Материалы диссертации были представлены на 1 Европейском форуме по нейронаукам (1^st Forum of European Neurosciеnce) (Берлин, 1998 г.), Всероссийской научной конференции с международным участием, посвященной 150-летию со дня рождения И.П. Павлова, (Москва, 1999 г.), научных конференциях «Интеграция: НИИ - ВУЗ - клиника» ( Москва, 2000, 2001 гг.), Российском симпозиуме по химии и биологии пептидов. (Москва 2003 г.), 6-ом конгрессе IBRO (Прага, 2003 г.) Всероссийской конференции «Нейрохимия: фундаментальные и прикладные аспекты» ( Москва, 2005), Международном симпозиуме «Гиппокамп и память» (Пущино, 2006), Всероссийском съезде физиологического общества им. И. П. Павлова (Москва, 2007), Конференции с международным участием «Нейрохимические механизмы формирования адаптивных и патологических состояний мозга» (С.-Петербург-Колтуши, 2008 г.) итоговых сессиях НИИ НФ им. П. К. Анохина (Москва, 2004, 2005, 2006). Диссертационная работа была апробирована на совместном заседании лаборатории функциональной нейрохимии и лаборатории мотивации НИИ НФ им. П.К. Анохина РАМН 03 июля 2009 г.

Публикации: по материалам диссертации опубликовано 40 печатных работ, из них 19 - статьи в рецензируемых журналах.

Структура и объем диссертации: Работа изложена на 263 страницах, включает разделы: введение, обзор литературы, характеристика методов исследования, результаты и их обсуждение, заключение, выводы и список цитируемой литературы. Работа иллюстрирована 42 рисунками и 27 таблицами. Список цитируемой литературы включает 540 источников, 521 из них на иностранных языках.

ОБЪЕКТЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ

Исследования проведены на крысах-самцах Вистар весом 250-300 г., содержавшихся по три в клетке при температуре 24 ^о С и световом цикле 12/12 в условиях свободного доступа к корму и воде. Время проведения опытов с 11.00 до 15.00 часов

Изучение кратковременного и долговременного привыкания АСР с одновременной регистрацией поведения замирания проводили в камере из плексигласа размером 15х10х17 см., которую устанавливали на платформу, оснащенную тензодатчиком, соединенным с компьютером для фиксации амплитуды АСР. Подача звуковых стимулов осуществлялась усилителем мощности 100Y-101 (Россия) через динамик. Параметры звукового сигнала (широкополосный шум длительностью 500 мс и громкостью 110ДБ) контролировались персональным компьютером. Регистрацию времени замирания - полного отсутствия движения животного, включая движение вибрисс, - осуществляли визуально. За 24 часа до начала обучения крыс адаптировали к экспериментальной камере в течение 5 мин. В ходе сеанса обучения животных помещали в камеру и в течение 5 мин регистрировали реакцию замирания, затем предъявляли 10 звуковых стимулов с интервалом 20 с. Через 24 часа для оценки долговременного угашения АСР и условного замирания проводили сеанс тестирования по той же схеме. В некоторых экспериментах был использован протокол, не включавший процедуры предварительной адаптации животных к экспериментальной камере.

Блокатор натриевых каналов тетродотоксин (ТТХ) в дозе 3 нг вводили за 1 час, через 5 минут и 2 часа после обучения. Азид натрия - блокатор митохондриального комплекса IV, вызывающий клеточную гипоксию, инъецировали в дозе 2 мкг за 5 суток до обучения. Пептид HLDF6 в дозе 5 мкг вводили через 5 минут после введения азида натрия. Белок S100b в дозе 500 нг вводили за 4 часа до начала обучения. Ингибитор синтеза белка циклогексимид инъецировали в дозе 50 мкг через 5 минут, а также через 2 часа после обучения. Ингибитор синтеза РНК актиномицин D вводили в дозе 50 мкг через 5 минут после обучения. Антитела к белку A3G7 в дозе 5 мкг вводили через 2 часа после обучения. Антагонист NMDA рецепторов глутамата APV (2-амино-5-фосфовалериановую кислоту) вводили дозе 5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист АМРА рецепторов глутамата CNQX (6-циано-7~нитрохиноксалин-2,3-дион) вводили в дозе 5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист ГАМК_A/ глициновых рецепторов бикукуллин вводили в дозе 0,5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист ГАМК_Б рецепторов факлофен вводили в дозе 5 мкг за 1 час до обучения. Антагонист 5НТ2 серотониновых рецепторов ритансерин инъецировали в дозе 5 мкг за 1 час обучения или за 1 час до тестирования. Все использованные в работе вещества, кроме пептида HLDF6, синтезированного в Институте биоорганической химии РАН, и антител к белку A3G7, полученных из Института медицинской и биологической кибернетики СО РАН, были приобретены в фирме «Sigma» США.

Вещества вводили через канюли, предварительно вживленные под нембуталовым наркозом по стереотаксическим координатам AP - 11,8; L 0; H -3,5, при помощи инъекционной иглы с ограничителем, соединенной виниловым шлангом с микрошприцем. Объем вводимого раствора составлял 3 мкл. Контрольным животным вводили физиологический раствор. Актиномицин D и CNQX в растворяли в 0.1% диметилсульфоксиде; контрольным крысам этих серий вводили 3 мкл 0,1% диметилсульфоксида в физиологическом растворе.

При изучении эффектов подавления активности мозжечка и гиппокампа использовали ТТХ в дозе 3 нг, который инъецировали в объеме 3мкл в дорзальный гиппокамп за 1 час до обучения через предварительно вживленные канюли (по стереотаксическим координатам АР-3,5 DL±2, H-3). Контрольным животным этих серий вводили 3 мкл физиологического раствора.

Определение внеклеточного содержания нейромедиаторных аминокислот проводили методом внутримозгового диализа на свободноподвижных крысах через микродиализный U-образный зонд (мембрана типа AN-69, проницаемость до 15000 Да, "Hospal", Италия), стереотаксически имплантированный в мозжечок по координатам AP - 11,8; DL 0; H -3,5.под нембуталовым наркозом за 6 часов до начала адаптации крыс к камере. Сбор образцов диализата проводили в течение 10 минут до, во время и после сеанса обучения, а также до, во время и после сеанса тестирования. После обучения собирали 3 пробы от каждого животного, а после тестирования - 1-2 пробы. Определение содержания нейромедиаторных аминокислот проводили методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с флуоресцентной детекцией. Для деривации аминокислот к 25 мкл диализата добавляли 10 мкл о-фтальальдегид-сульфитного реактива в 0,1М боратном буфере (рН 9,5). ГАМК, аспартат, глутамат, глицин и таурин в концентрации 0,001 мг/мл в 0,1 Н НClО4 использовали в качестве стандартной смеси для калибровки прибора. Через 15 мин после инкубации при комнатной температуре 20 мкл раствора наносили на колонку Agilent (США) размером 4,6х250 мм с сорбентом Hypersil ODS 5 mkM (США). Регистрацию продуктов разделения проводили на флуоресцентном детекторе Agilent 1100 (США) при волне возбуждения 230 нм и волне эмиссии 392 нм/ Мобильная фаза состояла из 0,05 М фосфатного буфера (рН 5,6) с 0,025 мМ ЭДТА и 5% метанола.

При исследовании содержания биогенных аминов в гомогенате червя мозжечка животных декапитировали через 5 минут, а также через 2, 4 и 24 часа после обучения, и извлекали червь мозжечка. Определение моноаминов и их метаболитов проводили в надосадочной жидкости после центрифугирования гомогената ткани (1:20 в 0,1Н HClO4 добавлением 0,2 мМ метабисульфита натрия) при 10000g, в течение 10 мин методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с электрохимической детекцией на хроматографе LC - 304T (BAS, WESТ LAFAYETTЕ, США), снабженным инжектором RНEODYNE-7125 (США) с петлей на 20 мкл для нанесения образцов. Изучаемые вещества разделяли на обращeннофазной колонке (3х150 мм) с сорбентом С18, 5 мкм, (МНПП «Элсико», Москва) и определяли электрохимически, используя амперометрический детектор LC-4B с ячейкой TL-5. Маточные стандарты готовили в 0,1Н HClO4 в концентрации 100 мкг/мл с добавлением 0,2 мМ метабисульфита натрия в качестве консерванта. Рабочие стандарты приготовляли из маточных растворов ежедневно. Подвижную фазу (рН=3,9) приготовляли следующим образом: на 1 л деионизированной воды - 5,76 лимонной кислоты, 4,72г КH2PO4, 100мг ЭДТА, 425мг ионопарного реагента октилсульфита натрия и 9% ацетонитрила.

Для определения количества клеток Пуркинье с признаками темноклеточной гипоксической дегенерации при воздействии азида натрия после окончания процедуры тестирования животных декапитировали под тиопенталовым наркозом (50 мг/кг). Мозжечок фиксировали в 4% параформальдегиде и заливали парафином. Срезы толщиной 6 микрон депарафинизировали, окрашивали гематоксилин-эозином и оценивали количество нормальных и гиперхромных клеток Пуркинье визуально под световым микроскопом. От каждого животного исследовали не менее 15 срезов. В каждом срезе анализировали 100 и более клеток Пуркинье.

Регистрацию частоты сердечных сокращений (ЧСС) при формировании долговременного угашения АСР и условного замирания осуществляли при помощи полиграфа П84-01 (Россия). Во время сеанса адаптации и 5-минутного периода перед подачей звукового стимула ЧСС регистрировали в течение 5 с через каждые 20 с, отмечая при этом состояние подвижности или замирания животного. На фоне звуковой стимуляции регистрацию проводили в течение 5 с до и в течение 5 с после подачи сигнала.

Статистическая обработка данных.

При анализе долговременного привыкания АСР оценивали индекс спонтанного восстановления реакции (Iсв) - разность амплитуд последнего ответа в день обучения и первого ответа в день тестирования (Petrinovich, 1984). Достоверное отрицательное значение индекса в группе указывает на нарушение долговременного привыкания. Для характеристики динамики АСР в течение сеансов угашения и тестирования для экспериментальных групп и индивидуальных животных проводили вычисление коэффициентов регрессии амплитуды реакции Аn от номера стимула N в уравнении Аn=A₀-bxN при обучении (b1) и тестировании (b2). Кроме того, различия в динамике АСР между группами оценивали при помощи дисперсионного анализа с повторными измерениями (repeated measures ANOVA). Был использован также t-критерий Стьюдента, непараметрические критерии Вилкоксона и Манна-Уитни и непараметрический корреляционный анализ Спирмена.

РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ

Влияние тетродотоксина на динамику АСР и поведение замирания при введении в червь мозжечка животных с различным уровнем оборонительной мотивации. Сравнение с эффектами введения ТТХ в гиппокамп.

Для выбора адекватной модели обучения оценивали динамику АСР и поведения замирания у животных, которых при обучении помещали в экспериментальную обстановку впервые (неадаптированные крысы), а также у крыс, которых за 24 часа до обучения адаптировали к экспериментальной камере в течение 5 минут (адаптированные крысы).

Согласно литературным данным, брадикардическая реакция отражает ориентировочно-исследовательскую составляющую АСР, а тахикардия является показателем оборонительной компоненты реакции (Taylor, Printz, 1996, Gautier, Cook, 1997, Richardson et al., 1996, Lang & Davis, 2006). Поэтому у животных указанных групп проводили измерение частоты сердечных сокращений (ЧСС) с целью определения соотношения ориентировочно-исследовательской и оборонительной составляющих поведения замирания и АСР.

Обнаружено, что в день обучения ЧСС на фоне замирания перед началом звуковой стимуляции у адаптированных крыс была на 12 % ниже, чем у неадаптированных и на 8% меньше соответствующего показателя во время сеанса адаптации (p<0,05). Таким образом, предварительная адаптация животного к экспериментальному контексту снижает уровень оборонительной мотивации, вызванной изменением обстановочной афферентации.

Таблица 1. Основные показатели динамики АСР и поведения замирания у адаптированных и неадаптированных к обстановке крыс.

Группы животных	Амплитуда первой АСР	Индекс восстановления АСР (Iсв)	Коэффициент регрессии b1 исходно	Коэффициент регрессии b2 через 24 часа	Время замирания исходно (с)	Время замирания через 24 часа
Неадаптиро-ванные (суммарно) n=36	17,9±2,1	-3,54±2,8	0,70±0,13	0,56±0,15	61,6±7,8	118,6±7,8*
Неадаптиро-ванные (b>0) n=13	18,2 ±3,4	-7,9 ±2,9	1,15 ±0,30	0,63 ±0,19	66,0± 9,6	108,2± 9,6*
Неадаптиро- ванные (b=0) n=23	17,4 ±3,0	2,5± 2,64	0,37± 0,19	0,49± 0,19	57,6± 9,4	129,6±12,2
Адаптиро-ванные (суммарно) n=35	13,1±1,2#	0,028±0,10	0,19±0,12#	0,20±0,08#	53,8±10,4	96,8±8,2#*
Адаптиро-ванные (b>0) n=11	11,9±1,8#	-2,82±1,9	0,79±0,14	0,69±0,16	52,8±7,4	130,2±9,8*
Адаптиро-ванные b=0 n=11	12,1±2,7#	0,83±0,49	-0,05±0,21	0,06±0,19	31,8±10,4	73,2±13,6#*
Адаптиро-ванные (b1<0) n=13	14,0±2,4	1,60±0,9	-0,51±0,18	-0,06±0,09	42,6±7,8	70,2±10,8*

* - p<0.05 по сравнению с исходным уровнем, # p<0.05 по сравнению с неадаптированными крысами.

Оценка средне-групповых значений коэффициентов регрессии b1 и b2 показала (табл.1), что неадаптированные крысы в сравнении с адаптированными демонстрируют более выраженное снижение величины АСР во время обучения и при тестировании. Дальнейший анализ обнаруженных различий с оценкой индивидуальных величин коэффициента b1 позволил выявить в группе адаптированных животных три подгруппы, представленные практически в равной пропорции: 1 - крысы с доминированием процесса угашения (b1>0), 2 - крысы без выраженной тенденции в динамике АСР (b1 не демонстрирует достоверных отличий от нуля, поэтому принимаем b1=0), 3 - крысы с доминированием сенситизации (b1<0). В группе неадаптированных животных подгруппа с доминированием сенситизации отсутствовала, при этом около 2/3 от общего числа (23 из 36) составляли животные с b1=0 (табл.1.). Таким образом, предварительная адаптация к обстановке приводит к возникновению у части животных кратковременной сенситизации АСР.

А Б

В Г

Рис.1. Изменения ЧСС после подачи звукового стимула: А - во время обучения у адаптированных крыс, Б - во время обучения у неадаптированных крыс, В - во время тестирования у адаптированных крыс, Г - во время тестирования у неадаптированных крыс. По оси абсцисс - время от начала стимула (с), По оси ординат - изменения ЧСС (1/с).

Существенные межгрупповые отличия обнаружены и в динамике реакций ЧСС на звуковые стимулы. У адаптированных крыс в день обучения в ответ на первый звуковой сигнал наблюдается снижение ЧСС.

Ко второму стимулу брадикардическая реакция угасает, а с 4 по 10 стимул имеет место возрастание ЧСС. В день тестирования снижение ЧСС происходит в ответ на 1-й стимул, на 4-6-й - наблюдается тахикардический ответ; который угасает при дальнейшей стимуляции (рис.1). У неадаптированных животных в день обучения снижение ЧСС наблюдается в ответ на 1-й и 2-й стимулы, затем брадикардическая реакция угасает, но в отличие от адаптированной группы, не сменяется тахикардической: уровень ЧСС после предъявления 3-10 звуковых стимулов не отличается от фоновых величин. В день тестирования у животных этой группы брадикардический ответ наблюдается только на 1-й стимул, а к 7-му стимулу развивается тахикардическая реакция (рис 1).

Таким образом, предварительная адаптация к экспериментальной обстановке повышает выраженность оборонительной составляющей в структуре АСР и вызывает у части животных (около 30%) кратковременную сенситизацию реакции.

Аппликация ТТХ на червь мозжечка неадаптированных крыс за 1 час до обучения вызывала достоверное возрастание времени замирания при первом помещении в экспериментальную камеру (109,0±15,8 с по сравнению с 66,6±6,8 с в контроле, р<0,05). Повышения данного показателя в день тестирования по сравнению с днем обучения в экспериментальной группе не наблюдалось (115,6 ±11,2 с) в то время как в контрольной группе его значение возрастало почти вдвое (до 114,2±8,6). Влияния ТТХ на исходный уровень и динамику АСР в этих условиях обнаружено не было.

Аппликация ТТХ на червь мозжечка адаптированных крыс не влияла на исходный уровень АСР и замирания (табл.2), однако приводила к достоверному уменьшению числа животных, демонстрирующих кратковременную сенситизацию АСР и возрастанию численности подгруппы животных без выраженной динамики реакции. При этом в подгруппе с b1=0 индекс спонтанного восстановления реакции был достоверно отрицательным, т.е. имела место долговременная сенситизация АСР. Во всех подгруппах экспериментальных крыс наблюдалось также нарушение формирования условного обстановочного замирания. При оценке долговременного привыкания АСР по величине коэффициента b2 достоверных различий между группами не обнаружено.

Таблица 2. Влияние тетродотоксина на угашение АСР и поведение замирания при аппликации на червь мозжечка адаптированных к обстановке крыс.

Группы животных	Амплитуда первой АСР	Индекс восстановления АСР	Коэффициент регрессии b1 исходно	Коэффициент регрессии b2 через 24 часа	Время замирания исходно	Время замирания через 24 часа
Контроль (суммарно) n=32	12,3±1,1	0,031±0,9	0,17±0,13	0,29±0,09	54,4±5,3	88,6±11,8*
Контроль (b1>0) n=10	11,5±1,7	-2,51±1,8	0,62±0,14	0,58±0,14	50,6±6,1	70,4±6,3*
Контроль (b1<0) n=12	13,5±2,1	1,51±0,9	-0,57±0,12	-0,04±0,08	37,0±8,6	65,4±12,2*
Контроль (b1=0) n=10	11,8±2,4	0,96±0,51	-0,04±0,13	0,21±0,14	20,6±4,9	64,4±16,2*
ТТХ (суммарно) n=32	12,8± 1,6	-2,9± 1,1^	0,38± 0,16#	0,45± 0,12	58,8±10,0	77,2± 9,4
ТТХ (b1>0) n=14	14,1±2,6	-2,52±1,9	0,86±0,28	0,41±0,18	51,6±16,8	75,6±14,2
ТТХ (b1<0) n=3	12,5±1,9	1,51±0,8	-0,93±0,31	0,34±0,44	53,0±14,6	55,0±12,4
ТТХ (b1=0) n=15	13,3±2,3	-4,2±1,6^#	-0,05±0,24	0,52±0,24	53,4±13,8	79,2±18,8

* - p<0.05 по сравнению с исходным уровнем, # p<0.05 по сравнению с контролем,. ^ - p<0.05 - достоверное отличие от нулевого значения

У адаптированных крыс с введением ТТХ в червь мозжечка обнаружена отрицательная корреляционная зависимость между временем замирания в день обучения до начала звуковой стимуляции и амплитудой первой АСР (r=-0,59, р=0,0017 по сравнению с r=-0,12 р>0,1 в контроле) и положительная корреляционная зависимость (r=0,36, p<0,05) между индексом восстановления реакции и изменением времени замирания в день тестирования по сравнению с днем обучения, (в контрольной группе r=0,19, p>0,1).

Таблица 3. Влияние ТТХ на динамику АСР и поведение замирания при введении в гиппокамп неадаптированных к экспериментальной обстановке крыс.

Группы животных	Амплитуда первой АСР	Индекс восстановле-ния АСР	Коэффициент регрессии b1 исходно	Коэффициент регрессии b2 через 24 часа	Время замирания исходно	Время замирания через 24 часа
Контроль (суммарно) n=24	19,5±2,3	-5,4±2,1	0,67±0,16	0,70±0,13	66,8±6,8	114,2±8,6*
Контроль (b>0) n=8	23,7 ±2,7	-8,2 ±3,8	1,11 ±0,10	0,94 ±0,37	74,2± 13,2	116,0± 16,2*
Контроль (b=0) n=16	17,4±2,3	-3,6± 2,6	0,07± 0,10	0,43± 0,28	58,8±11,6	105,2 ±18,2*
ТТХ (суммарно) n=18	27,1± 2,5#	-13,2± 4,7#	1,51± 0,34	0,15± 0,33#	53,4 ±11,2	67,4± 16,2
ТТХ (b>0 n=16	26,0± 2,62	-16,5± 2,7#	1,74± 0,13#	0,06± 0,31#	59,8± 22,8	70,4± 15,7
ТТХ b=0 n=4	31,0± 4,89#	- 8,0±5,9	0,59±0,41	0,54±0,39	51,6± 7,8	48,0± 8,2

* - p<0.05 по сравнению с исходным уровнем, # p<0.05 по сравнению с контролем

У неадаптированных крыс введение ТТХ в гиппокамп приводило к возрастанию исходного уровня АСР, стимуляции кратковременного угашения и возникновению долговременной сенситизации реакции, (оцениваемой по показателю спонтанного восстановления и величине коэффициента b2), а также нарушало формирование условного замирания (табл.3).

При введении ТТХ в гиппокамп адаптированных крыс (табл.4) достоверно возрастала численность подгруппы без выраженной динамики АСР (р=0,037) за счет уменьшения количества крыс с кратковременным угашением реакции. В экспериментальной группе этой серии наблюдалось повышение исходного времени замирания в день обучения (табл.4), однако не было обнаружено дальнейшего возрастания времени замирания в день тестирования.

Таким образом, независимо от адаптации к обстановке, введение ТТХ как в гиппокамп, так и в мозжечок, нарушает формирование условной реакции замирания. Эффекты «инактивации» мозжечка и гиппокампа на другие показатели оборонительного поведения зависят от адаптации к экспериментальной обстановке и, в ряде случаев, имеют противоположную направленность: изменения, наблюдаемые при депрессии активности мозжечка у адаптированных животных, сходны с эффектами, наблюдаемыми при депрессии гиппокампа у неадаптированных крыс, и наоборот (табл.5).

Таблица 4. Влияние ТТХ на динамику АСР и поведение замирания при введении в гиппокамп адаптированных к экспериментальной обстановке крыс

Группы животных	Амплитуда первой АСР	Индекс восстановле-ния АСР	Коэффициент регрессии b1 исходно	Коэффициент регрессии b2 через 24 часа	Время замирания исходно	Время замирания через 24 часа
Контроль (суммарно) n=24	13,5±3,5	0,21±0,6	0,25±0,14	0,24±0,11	53,2±8,7	99,2±12,8*
Контроль (b>0) n=9	14,9±3,7	1,58±1,4	0,71±0,16	0,61±0,23	98,5±10,7	136,3±18,1*
Контроль (b=0) n=8	12,8±2,9	0,83±0,42	-0,11±0,19	-0,09±0,10	25,9±6,2	59,2±15,8*
Контроль (b<0) n=7	13,7±4,2	- 1,47±0,5	-0,43±0,14	-0,10±0,08	38,2±7,2	70,9±8,4*
ТТХ (суммарно) n=24	10,1 ± 3,4	0,23± 0,7	0,18± 0,19	0,31± 0,09	112,6±22,8	88,0 ±18,4
ТТХ (b>0) n=3	11,8± 4,9	-1,64±1,1	0,94± 0,37	0,52± 0,18	40± 9,9	58,8± 12,2
ТТХ b=0 n=15	9,9 ± 3,0	0,48± 0,29	0,07± 0,08	0,08± 0,09	158,2 ±8,4	88,0 ±22,4
ТТХ (b<0) n=7	10,6± 2,7	1,02±0,85	-0,81± 0,39	-0,32± 0,19	82,0 ±26,2	107,5 ±39,9

*- p<0.05 по сравнению с исходным уровнем,

Учитывая данные о соотношении ориентировочно-исследовательской и оборонительной составляющих поведения замирания и АСР у адаптированных и неадаптированных крыс, можно сделать вывод, что подавление активности мозжечка оказывает влияние на эти формы поведения в условиях более высокого уровня оборонительной составляющей, а при доминировании ориентировочной компоненты более выраженные эффекты наблюдаются при подавлении активности гиппокампа.

Таблица 5. Эффекты нарушений функций мозжечка и гиппокампа на поведение замирания и угашение АСР у адаптированных и неадаптированных животных.

Структура, в которую вводили ТТХ/опыт адаптации к контексту	Кратковре-менное угашение АСР	Спонтанное Восстановле- ние АСР	Замирание исходно	Возрастание замирания в день тестирования
Мозжечок, неадаптированные	0	0	+	-
Гиппокамп, недаптированные	+	+	0	-
Мозжечок, адаптированные	+	+	0	-
Гиппокамп, адаптированные	-	0	+	-

Исходя из полученных результатов, дальнейшие эксперименты проводили на адаптированных к обстановке животных

Эффекты вызванные азидом натрия. Исследование протекторного влияния пептида HLDF6. Введение NaN3 приводило к т.н. темноклеточной дегенерации клеток Пуркинье, характерной для гипоксических поражений.

Таблица 6. Влияние азида натрия и пептида HLDF6 на динамику АСР и поведение замирания при аппликации на червь мозжечка за 5 дней до обучения.

Группы животных	Амплитуда первой АСР	Индекс восстанов-ления АСР	Коэффициент регрессии b1 исходно	Коэффициент регрессии b2 через 24 часа	Время замирания исходно	Время замирания через 24 часа
Физ. р-р (суммарно) n=21	14,9± 2,5	0,5± 0,47	0,43± 0,25	0,35± 0,17#	62,6± 15,6	100,8± 10,2*
Физ. р-р (b>0) n=7	17,0± 3,5	-4,0 ±2,2	1,77± 0,46	0,44± 0,11	95,2± 8,4	123,5± 9,8*
Физ. р-р (b=0) n=7	14,3 ±5,9	-0,7± 2,6	0,38± 0,16	0,39 ± 0,23	34,6 ±10,1	77,4± 11,0*
Физ. р-р (b<0) n=7	12,4± 3,4	5,0 ±2,8	-1,6± 0,44	-1,03± 0,48	54,0 ±10,4	85,6± 9,2
NaN3 (суммарно) n=22	14,6± 2,2	-5,3 ±2,3# ^	0,07 ±0,24	0,41± 0,21	49,0± 10,4	65,8± 11,6
NaN3 (b>0) n=3	27,3± 2,3	-5,3 ±3,7	2,4± 0,37	0,36± 0,34	86,2± 12,4	73,5± 19,6
NaN3 (b=0) n=11	11,7± 1,8	-9,7 ±3,9#^	0,36± 0,34	0,55 ±0,26	42,9± 8,6	64,2± 11,2
NaN3 (b<0) n=8	11,2± 3,2	1,0 ±1,8	-1,2± 0,23	0,28± 0,35	62,2± 9,9	64,0± 9,0
NaN3+HLDF6 (суммарно) n=24	15,1± 3,7	3,05 ±3,22	0,13±0,34	0,6± 0,29	59,9± 8,0	92,0± 9,7 *
NaN3+НLDF6 (b>0) n=4	24,0 ±4,9	2,0 ±3,1	2,48± 1,0	1,25± 0,34	58,0 ±6,2	79,0± 7,2*
NaN3+HLDF6 (b=0) n=12	11,4± 3,6	-1,5 ±3,3	0,45± 3,1	0,64± 0,37	72,6± 6,6	93,2± 8,2*
NaN3+HLDF6(b<0) n=8	11,0 ±2,5	6,8 ±1,5#	-2,36± 1,0	0,42± 0,25	62,5 ±6,1	94,0 ±10,2*

*- p<0,05 - отличия от исходного уровня. ^ p<0,05 - отличия от контроля, # p<0,05 отличия от нулевого значения

В контроле число таких клеток составило 21±6%, что соответствует литературным данным и, возможно, связано с глутаматной токсичностью (Pae EK, et al., 2005). После введения NaN3 количество поврежденных клеток Пуркинье возрастало до 63±3%, тогда как аппликация HLDF6 через 5 мин после азида натрия достоверно снижала его до 42±4% (p<0,05).

Обнаружено, что время замирания в сеансе адаптации в группе, получавшей NaN3, было достоверно выше, чем в контроле (98,4±10,2 с по сравнению с 65,2±8,1с p<0,05) и снижалось до 61,4±9,6 с при воздействии HLDF6. Введение NaN3 вызывало нарушение кратковременного угашения АСР (табл.6), ассоциированное с уменьшением количества крыс, демонстрирующих привыкание (b1>0) и увеличением числа животных без выраженной динамики реакции (b1=0), , а также подавление долговременного угашения АСР по показателю спонтанного восстановления (преимущественно в подгруппе с b1=0) и нарушение формирования условного замирания.

Введение пептида HLDF6 не влияло на показатели динамики АСР в день обучения, однако восстанавливало долговременное угашение АСР и формирование поведения замирания, нарушенные азидом натрия (табл.6).

Эффекты белка S100b в дозе, вызывающей апоптоз. Глиальный белок S100b, секретируемый астроцитами в межклеточное пространство, в зависимости от концентрации, оказывает протекторное или проапоптотическое действие на нервные клетки (Rothermundt al., 2003). Аппликация S100b на червь мозжечка крыс за 4 часа до начала обучения в дозе, которая, согласно литературным данным, вызывает апоптоз (500 нг/3мкл), приводила к подавлению кратковременного привыкания (табл.7). На индекс спонтанного восстановления существенного влияния введение S100b не оказывало, однако у всех крыс было нарушено долговременное привыкание, оцениваемое по коэффициенту b2, а также формирование условного обстановочного замирания.

Полученные результаты свидетельствуют, что с функциями мозжечка связан контроль безусловной реакции замирания при высоком уровне оборонительной мотивации, направленный на предотвращение избыточного проявления пассивно-оборонительного поведения, и обеспечивающий адекватный уровень ориентировочно-исследовательской активности. Так, аппликация ТТХ и NaN3 на червь мозжечка приводила к возрастанию времени замирания животных при первом помещении в экспериментальную камеру. Кроме того, обнаружено, что подавление активности червя мозжечка нарушает формирование условного обстановочного замирания. Документированные нами факты также указывают на участие червя мозжечка в обеспечении кратковременного привыкания и кратковременной сенситизации АСР.

Таблица 7. Влияние белка S100b в дозе 500 нг на динамику АСР и поведение замирания при аппликации на червь мозжечка крыс за 4 часа до обучения.

Группы животных	Амплитуда первой АСР	Индекс восстановле- ния АСР	Коэффициент регрессии b1 исходно	Коэффициент регрессии b2 через 24 часа	Время замирания исходно	Время замирания через 24 часа
Контроль (суммарно) n=20	16,4 ± 2,9	2,1± 1,9	0,29± 0,17	0,56 ± 0,22	52,8± 4,4	78,4± 6,6*
Контроль (b>0) n=7	18,4± 2,9	-2,0 ±2,3	1,03± 0,47	0,52± 0,23	77,0± 10,4	102,8± 9,2*
Контроль (b=0) n=8	16,0 ±3,6	3,38± 2,7	0,31± 0,51	0,57± 0,37	35,8± 8,2	64,8± 5,9*
Контроль (b<0) n=5	13,2 ±3,9	5,1 ± 3,2	-1,58± 0,62	-0,57± 0,29	43,6± 7,4	91,2 ±6,0*
S100b (суммарно) n=21	11,2 ±2,7	2,2 ± 1,4	-0,39± 0,35^	0,23± 0,16^	64,0± 7,8	63,8± 5,6
S100b (b>0) n=0	-	-	-	-	-	-
S100b n=15 (b=0)	10,1± 3,02	2,3 ±2,0	-0,18 ± 0,49	0,2 ±0,34	69,4±9,6	64,2± 8,6
S100b n=6 (b<0)	12,0± 3,14	2,0 ±1,8	-2,00± 0,44	0,26± 0,27	87,6± 5,5	72,2± 9,8

* p<0,05 - отличия от исходного уровня, ^ p<0,05 - отличия от контроля

# p<0,05 отличия от нулевого значения

При анализе данных о влиянии нарушения функций червя мозжечка на долговременное привыкание АСР, следует учитывать, что привыкание и сенситизация как формы неассоциативного обучения являются системным результатом согласованной работы различных отделов ЦНС, функционирующих в качестве интегрирующих и дифференцирующих элементов (Г.В.Гершуни, 1968, Thompson and Spenser, 1972, Poon and Young, 2006). На начальном этапе стимуляции в условиях постоянно изменяющейся активности ЦНС работа системы недостаточно скоординирована, вследствие чего возможна избыточность привыкания или сенситизации. В процессе обучения уровень взаимосодействия элементов системы повышается, что находит отражение в изменении параметров динамики реакции (в частности, значений коэффициентов линейной регрессии), а также в сохранении достигнутого при обучении уровня реакции, либо в ее спонтанном восстановлении, компенсирующем избыточную кратковременную сенситизацию или привыкание. Анализ динамики АСР у совокупной выборки адаптированных контрольных животных в описанных экспериментах (табл. 2, 4, 6-8) показывает, что у крыс с доминированием кратковременной сенситизации спонтанное восстановление проявляется как снижение амплитуды первой АСР в сеансе тестирования по сравнению с амплитудой последней АСР сеанса обучения, т.е. имеет место долговременная десенситизация. Напротив, у крыс с доминированием кратковременного угашения имеет место долговременное растормаживание, т.е. повышение амплитуды первой реакции (рис.2). При изменении активности медиального мозжечка может наблюдаться подавление как кратковременной сенситизации, так и кратковременного угашения с одновременным нарушением спонтанного восстановления амплитуды АСР в первой пробе сеанса тестирования. Нарушение спонтанного восстановления имеет место в подгруппах без выраженной динамики, т.е. именно тех, численность которых увеличивается при уменьшении количества крыс, демонстрирующих привыкание или сенситизацию.

Учитывая, что в структуре первой АСР сеанса тестирования доминирует ориентировочно-исследовательская составляющая, можно заключить, что при формировании приспособительного поведения в условиях интенсивной акустической стимуляции с функциями медиального мозжечка связаны механизмы долговременного растормаживания и долговременной десенситизации АСР, обеспечивающие оптимальный уровень ориентировочно-исследовательской составляющей активно-оборонительного поведения при повторном помещении животного в экспериментальную обстановку. Кроме того, возникновение положительной корреляции между показателями условного страха и спонтанного восстановления АСР при подавлении активности червя мозжечка свидетельствует об участии этого отдела мозга в обеспечении интеграции пассивно- и активно-оборонительных реакций.

Участие червя мозжечка в консолидации долговременного привыкания АСР и условного обстановочного страха.

При изучении вовлечения медиального мозжечка в механизмы консолидации различных видов оборонительного поведения в качестве одного из инструментов исследования использовали ингибитор синтеза белка циклогексимид (ЦГ). Аппликация ЦГ на червь мозжечка через 5 минут после обучения не оказывала влияния на спонтанное восстановление АСР (рис.3), но вызывала достоверное снижение коэффициента регрессии b2 (0,07±0,23 по сравнению с 1,03±0,36 в контроле, р<0,05 ). Дисперсионный анализ выявил различия в динамике АСР между контрольной и экспериментальной группами во второй половине сеансе тестирования (с 6 по 10 стимулы, p=0,0038); но не в первой его половине (p=0,58), (рис. 3.). Сходные данные получены при аппликации на червь мозжечка ингибитора синтеза мРНК актиномицина D: достоверные различия с контролем наблюдались во второй половине тестирования (p=0,0014), а коэффициент b2 у экспериментальных животных составил 0,28±0,21 по сравнению с 1,1±0,29 в контроле р<0,05). Ни ЦГ , ни актиномицин D при аппликации на червь мозжечка через 5 минут после обучения не оказывали существенного влияния на поведение замирания в день тестирования (рис.3).

Согласно полученным нами данным (рис.1), во второй половине сеанса тестирования у контрольных животных происходит угашение оборонительной составляющей АСР. Таким образом, ингибиторы синтеза белка и РНК при ведении в червь мозжечка избирательно подавляют привыкание оборонительной компоненты стартл-реакции.

При аппликации ЦГ на червь мозжечка через 2 часа после сеанса угашения, наблюдалось достоверное спонтанное восстановление реакции (Iсв=-5,3 ±2,1), а значения коэффициента b2 не отличались от контрольного (рис.4). Время замирания в сеансе тестирования у экспериментальных крыс было достоверно ниже, чем у контрольных (62,6 ±15,5 по сравнению с 109,9±13,5, р<0,05), при этом наблюдалась отрицательная корреляционная зависимость между возрастанием времени замирания и индексом спонтанного восстановления реакции ( r=-0,53, p=0,024), которой не было выявлено у животных, получавших физиологический раствор.

Аналогичное влияние оказывали моноклональные антитела к белку А3G7, обладающему нейроростовыми и нейротрофическими эффектами (Ельникова и др., 1992, 1995). У животных, которым через 2 часа после обучения апплицировали на червь мозжечка антитела к A3G7 в дозе 5 мкг (рис.4), наблюдалось достоверное спонтанное восстановление АСР (Iсв=-6,25± 2,4) и подавление консолидации/хранения поведения условного замирания (возрастание времени замирания в день тестирования по сравнению с днем обучения составило 21,2± 8,3 с, по сравнению с 54,2± 10,4 с в контроле). Сходные данные относительно избирательного влияния на угашение оборонительной составляющей АСР и на консолидацию обстановочного страха были получены нами ранее при введении в мозжечок антител к белку S100b и мозгоспецифичным лектинам через 2 часа после сеанса обучения (Sherstnev et al., 2000, 2003).

Таким образом, обнаружено, что через 5 минут после обучения с функциями червя мозжечка связаны механизмы консолидации долговременного привыкания оборонительной составляющей АСР, а через 2 часа - консолидация привыкания ориентировочно-исследовательской составляющей стартл-реакции и обстановочного условного замирания. Нарушение функций мозжечка на стадии консолидации приводит к разнонаправленным долговременным изменениям пассивно- и активно-оборонительных форм поведения (привыкания АСР и условного замирания), в то время как на этапе формирования эти изменения носят однонаправленный характер.

В немногочисленных исследованиях, посвященных данному вопросу, получены противоречивые сведения о временных параметрах участия мозжечка в процессах консолидации долговременной памяти при формировании различных видов поведения (Cooke еt al. 2004, Такehara et al., 2003). Высказываются мнения, что при формировании моторных навыков процессы консолидации кинематической внутренней модели, обеспечивающей быстрое движение к цели и основанной на сенсорной информации, и динамической внутренней модели, основанной на проприоцептивной информации (или копиях моторных команд) имеют разные временные параметры. (Krakauer et al., 1999, 2006). Полученные нами данные согласуются с этим предположением и указывают, что подобная разновременность характерна также для консолидации различных форм оборонительного поведения и, по крайней мере, отчасти связана с особенностями вовлечения мозжечка в эти процессы.