Программированная клеточная смерть (апоптоз)

Выполнила: студентка группы Ф-31

Романенко Нина

Лубны 2009

Апоптоз - это процесс программированной клеточной гибели. Слово «апоптоз» по-гречески означает «опадающий, словно листья с дерева».

Существуют два вида гибели клеток - некроз и апоптоз. Некроз связан с действием повреждающих агентов, приводящих к нарушению целостности клеточной мембраны вследствие ее повреждения или формирования пор и к изоляции внутренней среды клетки от ее окружения. Апоптоз же представляет собой активный процесс реализации программы ее гибели; он может быть вызван действием поступающих извне сигналов, которые сами по себе не являются токсичными или деструктивными. В зависимости от индуцирующих факторов различают несколько вариантов апоптоза, которые можно дифференцировать по биохимическим проявлениям. Как правило, все эти варианты имеют одинаковые заключительные этапы развития и морфологические проявления. В иммунной системе чаще других реализуются три формы апоптоза: апоптоз вследствие дефицита ростовых факторов; апоптоз, индуцированный глюкокортикоидами и другими сходно действующими агентами; и «активационный» апоптоз, развивающийся вследствие дисбаланса активационных сигналов (Ярилин А.А, 1996).

Апоптоз - это регулируемый процесс, контролируемый множеством вне- и внутриклеточных сигналов, который служит для координированной гибели избыточных, «опасных» или поврежденных соматических клеток. Апоптотические процессы включают в себя также механизмы, организующие как упаковку, так и удаление остатков клеток, таким образом предотвращая воспаление окружающих тканей. Заболевания, связанные с угнетением апоптоза, включают в себя рак, аутоиммунные заболевания (например, системную красную волчанку) и многие вирусные инфекции. Заболевания, протекающие с усиленным апоптозом, - это СПИД, нейродегенеративные заболевания, миелодиспластический синдром, ишемические повреждения (инфаркт миокарда), токсический цирроз печени и др. (Zornig M. et al, 2001).

В отличие от некроза, который, включая воспаление, может вовлекать длинную цепь событий, апоптоз развивается стремительно. С того времени как клетка получает информацию, чтобы начать процесс апоптотической гибели, до его завершения проходит лишь несколько часов. Морфологические признаки апоптоза: уменьшение размеров клетки, ее сморщивание, уплотнение и фрагментация хроматина. В ядре формируются осмиофильные скопления хроматина, обычно прилежащие к ядерной оболочке. Данные изменения служат самыми ранними проявлениями апоптоза, предшествующими процессам деградации. На этой стадии прогрессирование апоптоза может быть приостановлено действием ингибиторов. Данная стадия обозначается как преапоптоз. Затем в ядерной мембране образуются инвагинации, и хроматиновые фрагменты отшнуровываются от ядра. Такие фрагменты, окруженные мембраной, называются апоптотическими тельцами. В цитоплазме происходят конденсация и сморщивание гранул без их разрушения, расширение эндоплазматического ретикулума. Для апоптоза характерны потеря ворсинок и нормальной складчатости клеточной мембраны и формирование пузырей на поверхности клетки. Лизис клеток, обнаруживаемый по проницаемости для пррпидиума йодида, регистрируется позже, чем события, связанные с фрагментацией хроматина. Так, если признаки фрагментации могут регистрироваться уже через 1 час после воздействия индуктора, то проникновение пропидиума йодида - только через 3-5 часов.

Апоптоз, в отличие от некроза, когда гибнут одновременно массы соседствующих клеток, развивается изолированно в единичных клетках. Если при некрозе клеток в среду поступает внутриклеточное содержимое, в частности лизосомы, что может привести к развитию и прогрессированию воспаления, то при апоптозе подобные явления отсутствуют. Клетки, подвергшиеся апоптозу, и апоптотические тельца быстро фагоцитируются, причем не только макрофагами, но и «непрофессиональными» фагоцитами, например мезангиальными клетками почек.

Одно из основных проявлений апоптоза реализуется в ядре клетки и состоит в фрагментации ДНК. Сначала происходит образование крупных фрагментов ДНК (700, 200-250, 50-70 тыс. пар оснований), несколько позже - 30-50 тыс. пар оснований. Уже на этой стадии регистрируются конденсация хроматина и выпячивание ядерной мембраны, характерные для апоптоза. Полагают, что именно этот начальный этап фрагментации хроматина является ключевым событием апоптоза, после которого процесс становится необратимым. Заключительный этап фрагментации ДНК - ее межнуклеосомная деградация, т. е. расщепление в результате формирования разрывов между нуклеосомами с формированием фрагментов, содержащих 180-190 пар оснований. Именно эти фрагменты выявляются в виде «лесенки» при электрофорезе ДНК, который широко используется в качестве метода идентификации апоптоза. Деградация ДНК обусловливает выход в растворимую фазу низкомолекулярных фрагментов ДНК - полидезокснрибонуклеотидов, определение которых также используется для регистрации апоптоза. Межнуклеосомная деградация ДНК происходит с участием Ca^L>*, Mg^-зависимой эндонуклеазы.

К ключевым дистальным механизмам реализации апоптоза относят активацию сериновых и цистеиновых протеаз, или каспаз (CASPASES - Cysteine Aspartate-Specific Proteases). Эти протеазы ответственны за систематическое лишение оболочки тех клеток, которые становятся комиттированными к гибели. Каспазы являются рдними из наиболее специфичных протеаз, и это свойство делает их особенно подходящими для тонкой регуляции контроля протеолиза в процессе апоптотической гибели. С 1993 г. было идентифицировано более 12 каспаз, играющих ключевую роль в инициации или реализации апоптоза. Каспазы синтезируются в виде проферментов-предшественников, которые затем переходят в активные формы в результате протеолиза. Ключевая роль каспаз в реализации апоптотической программы делает их очевидными терапевтическими мишенями для контроля за неадекватным апоптозом. Повышенная активность каспаз ускоряет процессы апоптоза, что может лежать в основе таких нейродегенеративных заболеваний, как болезнь Альцгеймера и болезнь Хантингтона. Так, каспаза-3 и -12 участвуют в тфотеолитическом расщеплении амилоидр прекурсорного протеина при болезни Альцгеймера и образовании апоптозиндуцирующего амилоидогенного Арпептида. Инактивация каспаз может также ускорять онкогенез.

Большинство внешних сигналов к развитию апоптоза являются физиологическими. Pix источниками служат глюкокортикоиды, антигены или их аналоги - некоторые цитокины (фактор некроза опухолей альфа (ФНОа), интерфероны). Существует индуктор с единственно направленными на осуществление апоптоза функциями - Fas-лиганд (FasL) и Fas-рецептор (Fas, APO-1, CD95). Fas-антиген является трансмембранным гликопротеином I чина, состоящим из 335 аминокислот, с молекулярным весом 36 кД. Он имеет структурную гомологию с рецепторами ФНО и фактора роста нервов, экспрессируется на многих типах клеток, включая как лимфоидные, так и нелимфоидные ткани, в том числе сердца, печени, почек и яичников, причем экспрессия Fas усиливается при активации клеток. Внутриклеточный домен Аро I/Fas структурно гомологичен «домену гибели» рецептора ФНО и является необходимым для передачи апоптотического сигнала. FasL - трансмембранный протеин II типа, массой 40 кД семейства ФНО. Он экспрессируется преимущественно на активированных Т-клетках, В-клетках, естественных киллерах, тканях яичка, передней глазной камеры, почки, легкого. Мембраносвязанная форма FasL может в результате действия металлопротеиназы конвертироваться в растворимую форм)', которая может действовать как патологический агент, вызывая повреждение тканей (Berke G., 1997).

Гены Fas и FasL выполняют критические функции в осуществлении апоптоза, неоходимые для развития, функционирования и регуляции иммунной системы. Эти функции включают в себя делецию аутореактивных Т-клеток, наряду с элиминацией актвированых Т-клеток. Неожиданным оказался тот факт, что FasL может играть важную роль в лммунопривилегированных сайтах, являющихся уникальными анатомическими образованиями, где гнето-несовместимые или злокачественные ткани могут длительно существовать.

Способность различных ростовых факторов, включая цитоки-ны, защищать клетки от развития апоптоза хорошо известна для развивающихся кроветворных клеток. В случае апоптоза лимфоцитов (активационного и индуцированного кортикоидами) показан защитный эффект интерлейкинов (ИЛ) ИЛ-1, ИЛ-2, ИЛ-4, ИЛ-7, у-интерферона, тогда как ФНОос является апоптогенным фактором.

В реализации апоптоза участвует система циклического АМФ (цАМФ), повышение уровня которого внутри клетки вследствие активации аденилатциклазы и фосфолипазы А2 или ингибирования фосфодиэстеразы цАМФ может стать сигналом к быстрой фрагментации ДНК и гибели клеток. Эффект цАМФ реализуется через активацию протеинкиназы А. Непосредственной причиной гибели клеток при апоптозе служит истощение пула АТФ, являющееся следствием активации полп (АОР-рибоза)полимеразы в ответ на повреждение ДНК.

Функцию регуляторов выбора клетками, содержащими множественные разрывы ДНК (например, вследствие действия радиации), между вступлением в цикл (с последующей гибелью) и остановкой в фазе G, выполняют продукты протоонкогенов - ранний актнвационный белок с-птус и онкосупрессор р53. В обычных условиях активации экспрессия с-шус сопутствует выходу клеток в цикл. При удалении ростовых факторов его экспрессия ослабляется п клетка задерживается в фазе G_r В случае повышенной экспрессии с-пгус на фоне устранения ростового фактора клетки входят в S-фазу и подвергаются апоптозу.

Белок р53 играет важную роль, в норме являясь отрицательным регулятором пролиферации клеток; те же клетки, в которых р53 инактивирован, имеют преимущество в ростовых потенциях. Утрата или мутации его гена приводят к подавлению апоптоза и в то же время - к учащению развития опухолей после действия ионизирующей радиации. Наоборот, трансфекция гена р53 в опухолевые клетки обусловливает их апоптоз. После действия факторов, вызывающих повреждение ДНК (радиация, УФ-излучение), экспрессия р53 в клетках существенно усиливается. Под влиянием р53 клетки, имеющие множественные разрывы ДНК, задерживаются в фазе G,, а если входят в S-фазу (например, в случае опухолевой трансформации), то подвергаются апоптозу. Мутации гена р53 позволяют таким клеткам сохранять жизнеспособность в митозе, что чревато выживанием клеток, подвергшихся опухолевой трансформации; при этом опухолевые клетки оказываются резистентными к лучевой и химиотерапии (Tokino Т., Nakamura Y, 2000). Мутация гена р53 обнаруживается более чем в половине случаев злокачественных опухолей, частота ее повышается при длительной химиотерапии. У детей мутация р53 чаще наблюдается при остром лимфобластном лейкозе, составляя около 12%, и всегда является неблагсшриятным прогностическим фактором.

Активная природа апоптоза и родство его сигнальных путей с активационными предполагают существование внутриклеточных механизмов ингибирования апоптоза, а также возможность создания подходов к его модификации, в том числе медикаментозной. Наиболее известным ингибитором апоптоза является ген bcl-2, продукт которого имеет молекулярную массу 26 кД и экспрессируется на мембране митохондрий и в меньшей степени - на поверхности клеток. Вс1-2 был сначала идентифицирован в клетках В-клеточной лимфомы (отсюда его название - B-cell lymphoma) как результат хромосомной транслокации t (14; 18), ведущей к высокой экспрессии Вс1-2 в этих опухолях. Вс1-2 содержится в юных кроветворных клетках, про-В-лимфоцитах, CD4 CD8 тимоцитах, зрелых долгоживущих Т- и В-клетках, клетках памяти. Вне кроветворной и иммунной систем bcl-2 обнаруживается в быстро делящихся эпителиальных клетках, клетках секреторного эпителия, нейронах. У этого гена есть гомолог-антагонист - bcl-x (или Ьах), экспрессия которого предотвращает развитие апоптоза, но может также отменять защитное действие bcl-2. Белок Вс1-2 препятствует повышению концентрации Са²' в ядре, необходимого для запуска апоптоза. Однако иногда в результате различных генетических процессов (чаще всего - хромосомных транслокаций) ген bcl-2 претерпевает неадекватную активацию, приводящую к гиперпродукции белка Bcl-2 в различных клеточных популяциях, в результате чего клетки теряют способность к своевременному отмиранию. Появление среди них клеток с опухолевой трансформацией приводит к неконтролируемому росту и развитию злокачественного процесса. Кроме того, белок Bcl-2 играет одну из главных ролей в развитии химиорезистентности.

Повышенный синтез Bcl-2 обнаруживается в большинстве случаев В-клеточных фолликулярных лимфом и в 1/3 случаев диффузных крупноклеточных лимфом. Уровень Bcl-2 повышен при широком спектре онкологических заболеваний, включая рак молочной железы, простаты, толстого кишечника и легкого.

Развитию лимфопролиферативных процессов способствуют ситуации, при которых ослабляется апоптотическая элиминация генетически дефектных клеток, в норме контролируемая белком р53. Это может происходить не только при мутации соответствующего гена, но и в связи с ослаблением других механизмов реализации апоптоза. Так, при хроническом лимфолейкозе, волосатоклеточном лейкозе, лимфомах, лимфогранулематозе обнаружено ослабление активности Са~*-, Mg-'-зависимой эндонуклеазы, что может способствовать развитию злокачественной лимфопролиферации. Связь между апоптозом и злокачественными новообразованиями проявляется еще и формированием множественной лекарственной резистентности при повышенной экспрессии факторов, подавляющих развитие апоптоза - продуктов генов bcl-2, bcl-x и ингибиторов каспаз.

Генетически обусловленные нарушения апонтотического механизма приводят к развитию заболевания с очерченной клинической и иммунологической картиной, которое получило название аутоиммунного лимфопролиферативного синдрома (АЛПС). Вначале св. зь подобного синдрома с дефектом апоптоза была обнаружена у лабораторных животных: в 1978 г. описана мышиная линия, характеризовавшаяся лимфоаденопатией, спленомегалией и аутоиммунными нарушениями. Соответствующая аутосомно-рецессивная мутация, открытая в 1991 г., получила название 1рг (lymphoproliferation). Далее было установлено, что данная мутация относится к гену Fas. Вскоре в гене FasL была обнаружена другая мутация со сходным фенотипом, названная gld (generalized lymphoproliferative disease). У линейных lpr- и gld-мышей наблюдалась высокая продукция аутоантител классов IgG и IgM, кроме того, у них обнаруживались анти-ДНК-антитела и ревматоидный фактор; эти животные погибали от нефрита и артрита.

У человека хроническая лимфоаденопатия, симулирующая злокачественную лимфому, в сочетании с аутоиммунными проявлениями была описана еще в 1967 г. и названа синдромом Canale-Smith. В 1995 г. были обнаружены мутации в гене Fas у больных lpr-подобным синдромом, затем эти мутации удалось выявить у многих больных с синдромом Canale-Smith (Rieux-Laucat F. et al, 1995). В последующем были описаны случаи АЛИС без мутации в гене Fas; так, обнаружена мутация в гене FasL у больного системной красной волчанкой в сочетании с лимфопролиферацией.

Методы терапевтического воздействия на процессы апоптоза. Уничтожение опухолевых клеток под действием химиолрепаратов основано на генерации различных повреждений, ко орые клетка интерпретирует как сигнал к запуску апоптотической программы. Для реализации этой программы необходимы следующие условия: проникновение препарата в клетку, создание адекватной внутриклеточной концентрации активной формы препарата; наличие внутриклеточных мишеней, воспринимающих действие препарата и включающих при этом программу апоптоза; возможность для опухолевой клетки осуществить генетически детерминированную программу самоуничтожения.

Наиболее чувствительны к внешним неблагоприятным воздействиям клетки в фазе синтеза ДНК, наименее - в G(|- фазе. Противоопухолевые препараты включают апоптоз в основном через две сигнальные системы: через ген р53 и через Fas-рецептор/ФНО. Антрациклиновые антибиотики, проникнув в плазматическую мембрану, участвуют в запуске механизма CD95 (Раз)-индуцированного апоитоза. Указанные препараты вызывают блок G,-M фазы в низких концентрациях и аккумуляцию клеток в середине S-фазы при высоких концентрациях. Например, идарубицин вызывает апоптоз опухолевых клеток в 5 раз эффективнее, чем даунорубицин. Пусковым механизмом апоптоза, связанным с индукцией FAS/ ФНО-региона, может являться в некоторых случаях и образование активных форм кислорода (ROS - Reactive Oxygen Species).

Алкалоиды, в частности, винкристин, в низких дозах способны вызывать увеличение экспрессии гена Ьах, который участвует в запуске апоптоза, и блокировать путем гиперфосфорилирования ген bcl-2. Антиметаболиты, в частности цитозар, вызывают апоптоз в G, - и S-фазе клеточного цикла.

Опухолевые клетки, в том числе и лейкемические, имеют свои метаболические особенности, связанные, как правило, с нарушениями в механизмах апоптоза. Эти нарушения могут способствовать тому, что опухолевая клетка не будет элиминироваться даже при наличии в ней повреждений, вызванных химиопрепаратами. Дефекты механизмов апоптоза должны отражаться на чувствительности лейкозных клеток к химиопрепаратам. Выявление плохой чувствительности к ним в тестах in vitro в сочетании с низким уровнем спонтанного апоптоза бластных клеток в дебюте заболевания при остром лейкозе дает основания для прогнозирования развития лекарственной резистентности и коррекции тактики терапии (перевод на лечение по высокому риску) (Астрелина Т. А, 2000).

Установление при опухолях мутаций, ведущих к снижению апоптоза, имеет не только академический интерес, но и ведет к развитию новых способов противоопухолевой терапии, т. е. мутации генов, контролирующих процессы клеточной гибели, нарушают чувствительность опухолевых клеток к воздействию противоопухолевых препаратов, механизм действия которых связан с индукцией апоптоза. Так, например, эффективность химиотерапии может зависеть от уровня экспрессии Вс1-2 опухолевыми клетками. Подход, направленный на снижение Вс1-2 с использованием антисмысловых олигонуклеотидов, уже показал обнадеживающие результаты в доклинических и клинических испытаниях.

Метод краткосрочного культивирования клеток опухоли in vitro в присутствии химиотерапевтических препаратов для оценки эффективности их действия в качестве индукторов апоптоза находит все более широкое применение как в России, так и за рубежом. Данный тест достаточно прост и удобен для определения чувствительности опухолевых клеток к химиопрепаратам. Так, в США действует специальная программа рациональной противоопухолевой терапии, которая предполагает определение в лабораторных условиях чувствительности опухолевых клеток конкретного больного к индукции апоптоза различными противоопухолевыми препаратами. Это позволяет не только выбрать оптимальную схему терапии, но и исключить применение препаратов, которые неэффективны в тестах in vitro (Абраменко И.В., Фильченков А.А, 2003).

Основные методы определения апоптоза

1. Учет апоптотических клеток по характерной морфологии ядра (конденсированный и фрагментированный хроматин) с использованием флуоресцентных красителей акридинового оранжевого и этидиум бромида и флюоресцентного микроскопа.

2. Выявление изменений в плазматической мембране с помощью белка аннексина V. В апоптотических клетках фосфолипид фосфатидилсерин (ФС) переориентируется и локализуется на поверхности клеточной мембраны. Его локализация на мембране наблюдается, начиная с ранней стадии апоптоза до полной деградации клетки. Связываясь с ФС на поверхности клетки, аннексии V, конъюгированный с флуорохромом, служит маркером апоптоза. Обычно аннексии V используют в комбинации с пропидиум йодидом (ПИ), что позволяет определять одновременно интактные клетки, клетки в раннем апоптозе (положительные по аннексину V и отрицательные по ПИ) и в «позднем» апоптозе или в некрозе (положительные и по аннексину V, и по ПИ).

3. Определение межнуклеосомной деградации (фрагментации) ДНК - регистрация образования «лесенки» ДНК с помощью гельэлектрофореза.

4. Оценка фрагментации ДНК in situ в гистологических срезах TUNEL-метод, основанный на флюоресцентной метке окончаний отрезков ДНК (З'-ОН-окончания, образовавшиеся в результате фрагментации ДНК) с использованием биотин-конъюгированного дезоксиуридинтрифосфата (dUTP) в реакции, катализируемой экзогенной терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой (TdT).

5. Определение экспрессии Fas-антигена на поверхности клетки с помощью моноклональных антител к CD95. Это позволяет, с использованием проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии, выявить популяцию клеток, несущих Fas-антиген, т. е. потенциально способных вступить в апоптоз.

6. Определение экспрессии внутриклеточного bcl-2 с помощью моноклональных антител и проточной цитометрии или флуоресцентной микроскопии.

Таким образом, апоптоз является одним из основных механизмов поддержания тканевого гомеостаза. Особенно важен этот механизм для иммунной и кроветворной систем, так как с его помощью осуществляется контроль клеточной пролиферации и элиминация аутоагрессивных клонов. Изучение факторов, модулирующих развитие апоптоза, может стать основой для разработки подходов к фармакологическому контролю апоптоза, который играет важную роль в развитии многих заболеваний.