Заготовка, хранение и лабораторное тестирование пуповинной крови

11

Заготовка, хранение и лабораторное тестирование пуповинной крови

Радикальным методом лечения многих фатальных болезней кроветворной системы, как известно, является трансплантация стволовых клеток, выделенных из периферической крови или костного мозга донора. Донорами для таких больных являются родные братья или сестры, вероятность совпадения их HLA_антигенов составляет 1: 4, т.е. 25%. А наличие родных брата или сестры у реципиентов еще более редкое явление, особенно в России. Вероятность нахождения неродственного донора исчисляется значительно большими цифрами - от 1: 50000 до 1: 1000000 (в зависимости от частоты встречаемости данного HLA_антигенного типа доноров и реципиентов в той или иной популяции человека). Подбор и нахождение нужного донора возможен лишь при наличии регистра типированных доноров, исчисляемого сотнями тысяч человек. В частичном решении данной проблемы может помочь создание хранилищ стволовых клеток, получаемых из плацентарной крови.

Так, еще в конце 80-90_х гг. было показано, что пуповинная кровь (ПК) является достаточно богатым источником кроветворных клеток. Например, количество гранулоцитарно-моноцитарных колониеобразующих единиц (КОЕ-ГМ) в пуповинной крови значительно превосходит их содержание в периферической крови взрослых даже после введения ростовых факторов (Christenssen R, 1987), но имеет то же число этих бииотентных клеток, что и костный мозг (2,35 ± 1,26 х Ю'/мл и 2,46 ± 1,48 х 10³/мл (Тгоп с! е Bouchony E., 1993)). В долгосрочной же культуре клеток in vitro отмечена большая пролиферативная активность полиггатентных клеток КОЕ-ГЭММ (колониеобразующая единица гранулоцитарная, эритроцитарная, моноцитарная, мегакариоцитарная), выделенных из ПК, чем клеток, выделенных из костного мозга (Hows J., 1992). Иммунологическими исследованиями также показано, что, несмотря на то что количество клеток с иммунофенотипом CD34* в костном мозге больше, чем в ПК, в 4 раза (1,64 + 0,96 и 0,36 ± 0,33% соответственно), количество клеток с иммунофенотипом CD34' CD38 практически одинаковое (0,02 ± 0,01 и 0,02 ± 0,01 (Нао О. L, 1995)). Однако при стимуляции их колониестимулирующим фактором (КСФ) и интерлейкином_3 (ИЛ_3) уже через двое суток число клеток в ПК увеличивается в 9,6 раза, в то время как количество клеток костного мозга с этим же иммунологическим типом - лишь в 2,5 раза (Gluckman E., 1998).

Имея в распоряжении такой источник кроветворных клеток, можно проводить трансплантации реципиентам с различными заболеваниями системы крови. Так, уже проведены операции по пересадке гемопоэтических клеток пуповинной крови больным с острыми лейкозами, миелодиспластическим синдромом, неходжкин-ской лимфомой, нейробластомой, апластической анемией, врожденными анемиями Фанкони и Дайемонда-Блэкфана, а также при некоторых врожденных заболеваниях (дефиците адгезии лейкоцитов, синдроме Барра, болезни Гюнтера, синдроме Харлера, та-лассемиях) (Абдулкадыров К.М., 2001). Эффективность таких операций, как показала Е. Gluckman (1998), достаточно высокая и не уступает пересадкам костного мозга или периферических стволовых клеток.

Эффективность трансплантаций ПК определяется: 1) HLA - совместимостью донора и реципиента; 2) количеством инфузируе-мых гемопоэтических клеток, так как при недостаточном их числе увеличивается риск развития рецидива осиовного заболевания и неприживления стволовых клеток донора; 3) серонегативным анализом на цитомегаловирус у реципиента; 4) ранней диагностикой заболевания и своевременным началом его лечения; 5) низким риском острого лейкоза; и 6) возрастом реципиента - лучше у детей в возрасте до 1-5 лет (Gluckman E., 1998).

Вот некоторые преимущества заготовки стволовых клеток ПК перед клетками костного мозга:

отсутствует риск здоровью матери и ребенка (донора);

не требуется общая анестезия при эксфузии ПК;

значительно ниже риск передачи некоторых латентных инфекций (в частности, цитомегаловирусной) от донора реципиенту, чем при использовании КМ или периферических стволовых клеток взрослых доноров;

неограниченная возможность длительного хранения гемопоэтических клеток ПК в замороженном состоянии при ультранизких температурах, что позволяет накапливать и сохранять различные HLA_типы стволовых клеток, в то время как потенциальные доноры КМ со временем выбывают из донорского Регистра по разным причинам (болезни, возрастные ограничения, отказ донора, финансовые трудности и т.д.);

замороженные образцы ПК могут предоставляться по требованию в любой центр трансплантации костного мозга, что устраняет задержки и неуверенность, которые нередко возникают из-за затрудненного поиска донора и заготовки костного мозга;

появляется возможность биологического страхования жизни ребенка, от которого получена данная порция крови, при возникновении у него заболевания системы крови (Абдулка-дыров К. М, 2000).

Основным недостатком ПК как источника кроветворных клеток является малый объем получаемой крови. Поэтому для снижения потерь клеток при заготовке, фракционировании, криоконсервировании и лабораторном тестировании необходима следующая схема оптимальной работы с пуповинной кровью.

Заготовка пуповинной крови

Донором плацентарной крови является новорожденный ребенок. Но так как отбор донора непосредственно осуществить не представляется возможным из-за его внутриутробного нахождения, то оценивают состояние роженицы по результатам обследования (физикальным и лабораторным), которые уже имеются на момент родов. Отбор проводят по следующим параметрам: отсутствие в анамнезе и при обследовании у роженицы таких инфекционных заболеваний, как гепатит В (HBs_антиген) или С, сифилис (RW_реакция Вассермана), ВИЧ инфекции (ВИЧ1 и ВИЧ2). При выявлении любой инфекции или наличии таковой в анамнезе эксфузию крови не проводят. Не рекомендуется проводить экс-фузию ПК при наличии любого инфекционно-септического заболевания роженицы из-за увеличения риска бактериального осеменения ПК.

Перед эксфузией берется письменное согласие матери на добровольную безвозмездную дачу плацентарной крови.

Перед родами в стерильных условиях готовят систему, состоящую из контейнера «Компопласт 300», в который при помощи шприца вводят раствор «глюгицир» в количестве 30 мл, и измеряют массу контейнера с гемоконсервантом. Непосредственно перед родами соединяют «Компопласт 300» с устройством для взятия крови «ВК 10-01». Для эксфузии можно использовать и готовую систему для получения пуповинной крови - Davol suction evacuator (CR Bard, Cranston, RI).

Эксфузию крови осуществляют при естественных родах в родильном зале и после кесарева сечения в операционной или предоперационной. При естественных родах эксфузию крови после рождения ребенка можно осуществлять в двух вариантах: 1) когда плацента не отделилась и находится внутри матки - in utero; и 2) когда плацента выделена из полости матки - ex utero (Абдулка-дыров К.М., 2002).

При естественных родах эксфузию крови производят после рождения ребенка и отделения его от последа (наложение зажима на пуповинный канатик). Пуповинный канатик на протяжении 10-12 см в месте предполагаемой пункции тщательно обрабатывают 5% настойкой йода и 70% раствором этилового спирта. После этого производят пункцию вены пуповинного канатика иглой от системы «ВК 10-01», соединенной с «Компопласт 300». Контейнер с гемоконсервантом необходимо расположить на 50 - 70 см ниже уровня живота роженицы для того, чтобы кровь самопроизвольно оттекала по соединительным трубкам в контейнер под действием силы тяжести. По завершении процедуры соединительную трубку от контейнера перекрывают карабином и накладывают два плотных узла, а устройство для взятия крови «ВК 10-01» отсоединяют и выбрасывают.

Из артерий пуповинного канатика одноразовым 10 мл шприцом насасывают кровь для первичного обследования ПК на латентные инфекции и групповую принадлежность и переводят в ваку-тейнер.

В случае, когда плацента уже выделена из полости матки, ее укладывают на специальную рамку с отверстием для пуповинного канатика плодной поверхностью книзу. При отсутствии рамки экс-фузию ПК можно осуществить при помощи ассистента, который должен обхватить плаценту руками плодной поверхностью книзу и приподнять ее на 50-70 см выше уровня расположения контейнера. Обработку и дезинфекцию поверхности пуновинного канатика, пункцию вены и дренаж осуществляют таким же способом, как описано выше.

При кесаревом сечении эксфузия крови аналогична. Однако следует подчеркнуть, что в этом случае ее следует осуществлять незамедлительно. Это связано с тем, что во время операции при ручном отделении плаценты от слизистой матки нередко происходит массивное механическое повреждение маточной поверхности последа, что приводит к высвобождению и попаданию в ПК большого количества тканевого тромбон. тетина, который запускает механизм массивного внутрисосудистого свертывания крови. В таких случаях ПК может свернуться еще до начала эксфузии крови.

Объем ПК определяют путем взвешивания контейнера на весах.

Пластикатный мешок с кровью маркируется и отправляется в сумке-холодильнике или в защищенном от перепада температуры контейнере в банк ПК или на гематологическое отделение. В маркировке указывают: название лечебно-профилактического учреждения, название компонента, объем и название консервирующего средства, паспортные данные матери, пол ребенка и его массу, дату и время эксфузии крови, температурный режим хранения. Сроки хранения цельной крови с гемоконсервантом при температуре от +20 до +24 °С не должны превышать 24 часов с момента эксфузии до ее фракционирования. В противном случае наступает гибель клеточных предшественников.

Для первичного обследования цельной ПК берут 1 мл крови из контейнера для подсчета количества лейкоцитов, определения их жизнеспособности (по стандартным методикам). Основную часть крови подвергают фракционированию и подготавливают к криоконсервированию. Если количество ядросодержащих клеток меньше 0,5 х 10^!) или объем цельной крови меньше 45 мл, такую единицу крови не фракционируют и расценивают как непригодную для хранения в качестве потенциального трансплантата.

Выделение стволовых клеток ПК и последующее их приготовление для криоконсервирования проводится в ламинарном боксе или условиях, приближенных к операционной, с соблюдением правил асептики.

ПК разделяют на фракции путем центрифугирования при частоте 2000 об./мин в течение 25 минут. Плазму переводят во второй контейнер «Компопласт 300». Удаленную плазму восполняют эквивалентным объемом физиологического раствора натрия хлорида с глюгициром (в соотношениях 4: 1) и тщательно перемешивают, после чего добавляют седементирующее средство для осаждения эритроцитов. Если используется 3% раствор желатина, то осаждение эритроцитов проводят в течение 25-30 минут дважды при комнатной температуре. Соотношение крови и раствора желатина 1: 1. Если используется 6-10% раствор гидроксиэтилкрахма-ла в соотношении 1: 4, то осаждение эритроцитов проводят в течение 40-45 мин при тех же условиях. К полученной клеточной взвеси с небольшой примесью эритроцитов добавляют 0,9% раствор натрия хлорида и дважды центрифугируют по 10 мин при частоте 2000 об./мин. Клеточный осадок, состоящий из ядерных клеток, собирается шприцом и подготавливается для криоконсервирования.

Выделенную плазму используют для серологического тестирования па латентные инфекции (1,5 мл), для приготовления ограждающего раствора, используемого при криоконсервировании выделенных ядросодержащих клеток (не менее 15 мл), и для хранения (две пробирки по 2 мл, которые могут потребоваться для проведения повторного тестирования на инфекционные агенты и их маркеры).

Лабораторное тестирование пуповинной крови. Применение ПК и ее компонентов, прежде всего гемопоэтических клеток, в клинической практике требует лабораторного тестирования на выявление бактериального загрязнения, вирусного и паразитарного персистирования, а также HLA_типирования и исследования на содержание гемопоэтических предшественников.

Следуя Европейским стандартам безопасности приготовления и использования компонентов крови (Guide to the preparation, use and quality assurance of blood components, 2001), каждый образец ПК тестируется на групповую принадлежность крови по AB0 и Rh(D), проводится HLA_типирование, определение АлАТ, исследуется на наличие HBs_антигена, антител к вирусу гепатита С и цитомегаловирусной инфекции, сифилису, Т-клеточному лейкозу человека (HTLV-I и - II), токсоплазмозу, а также определяется жизнеспособность лейкоцитов. Кроме этого, осуществляется бактериологический посев на стерильность.

Для полного лабораторного тестирования ПК необходимо около 10 мл крови: вышеперечисленные исследования требуют до 4 мл крови, а оставшиеся 6 мл центрифугируют. Полученную плазму замораживают и хранят в банке крови, а лимфоциты выделяют в градиенте плотности (фиколл-верографин или гистопак), крио-консервируют и в последующем используют для дальнейшего тестирования (постановка полимеразной цепной реакции на цитомегаловирусную инфекцию, ВИЧ, повторное определение HLA-reнотипа, если необходимо). Замороженные лимфоциты хранят в двух пробирках в отдельных биологических хранилищах в жидком азоте.

Ниже приведен перечень необходимых исследований для оценки качества и количества пуповинной крови (табл. 62). Исследование клеток после их размораживания необходимо для оценки качества трансплантата, прогнозирования времени приживления кроветворных клеток, восстановления гемопоэза у реципиента, а также оценки пригодности данной единицы стволовых клеток в зависимости от массы тела больного.

Бактериологический посев на стерильность (Голосова Т.В., 1995) производят после фракционирования ПК из оставшейся эритро-цитной массы, что снижает потери гемопоэтических клеток. Определение биохимических показателей ПК (АлАТ и / или АсАТ, билирубина), групповой принадлежности (АВО и Rh фактор), HLA_фенотипа проводится из крови, взятой из артерии пуповины в пробирку-вакутейнер или из цельного образца крови. Серологические исследования сыворотки (плазмы) ПК на латентные инфекции (ВИЧ-инфекция, вирусные гепатиты В и С, цитомегало-впруснуя инфекция, сифилис, токсоплазмоз и HTLV-I и - II проводят с полученной при фракционировании ПК плазмой (достаточно 1,5 мл).

В случае выявления в ПК антител класса IgG к вирусным гепатитам В или С, а также к ВИЧ, такой образец крови считается непригодным. Однако при планируемой родственной трансплантации данная единица крови фракционируется и замораживается, а через 3 и б месяцев у младенца повторно берется кровь на данные маркеры инфекций. Также необходимо повторить обследования через вышеупомянутые сроки при отрицательных результатах лабораторных тестов, если хоть один из маркеров этих инфекций был выявлен в крови матери, но отсутствовал в пуповинной крови.

Типирование клеток ПК по HLA_системе проводится в специализированных учреждениях, имеющих в своей структуре лаборатории тканевого типирования. Для HLA_типирования необходимы лимфоциты, которые получают путем фракционирования крови, собранной в вакутейнер, или из цельного образца (достаточно 4-5 мл ПК). Выделенные лимфоциты разделяют на две части: одну часть используют для HLA_типирования по I классу (иммунологическое исследование), а вторую замораживают и хранят в 2 мл криопробирках в жидком азоте с последующим размораживанием и исследованием клеток реакцией ПЦР по II классу HLA Определение кроветворных предшественников ПК исследуется в выделенных клетках после фракционирования ПК. Исследуют содержание КОЕ-ГМ и число клеток с иммунологическим типом CD34*.

Для определения содержания клеток с иммунологическим типом CD34⁺ необходимо вначале получить взвесь лимфоцитов в градиенте плотности (гистопак, фиколл-верографин), которые смешивают с ФИТЦ или ФЭ конъюгированными антителами к кластерам дифференциации CD34 и ФИТЦ или ФЭ конъюгирован-ным контролем. В качестве контроля используются соответствующие ФИТЦ или ФЭ конъюгированные овечьи антитела к F(ab') фрагментам мышиных антител, которые соответствуют используемым для типирования по дифференцировочным антигенам. Затем инкубируют 30-40 минут при +4 °С в месте, защищенном от видимого света. Окрашенные антителами клетки отмывают от «не-связавшихся» антител в PBS (раствор фосфатного буфера) путем центрифугирования при частоте 1500 об/мин в течение 10 мин. Исследование содержания клеток с иммунологическим фенотипом CD34* проводят в проточном цитофлюориметре EPICS (Coulter/США или аналогичный).

Криоконсервирование стволовых клеток пуповинной крови

Гемопоэтические клетки ПК хранят в замороженном состоянии при низких и ультранизких температурах: -80 °С (в специальных холодильных камерах); -150 °С (в парах жидкого азота); -196 °С (в емкостях с жидким азотом). Длительность хранения стволовых клеток при -80 °С не превышает 6 месяцев, а длительность хранения при температурах от -150 до -196 °С - более 15 лет. Стволовые клетки пуповинной крови с положительным тестом маркеров инфекционных болезней необходимо хранить отдельно.

Приготовление ограждающего раствора осуществляется в ламинарном боксе на ледяной бане (для поддержания температуры +4-+ 8 °С). В основу. ограждающего раствора входит криопротек-тор - ДМСО (диметилсульфоксид). Для приготовления такого раствора используют 10% ДМСО, 20% аутологичной плазмы и 40% среды RPMI (все составляющие рассчитываются на конечную концентрацию). Также возможно использование 10% раствора гид-роксиэтилкрахмала вместо среды RPMI (Romanenko N. А, 2001).

Предварительно охлажденную до температуры +4 °С (в холодильнике или на ледяной бане) взвесь ядерных клеток для снижения цитотоксического действия криопротектора ДМСО набирают одноразовым стерильным шприцом и переводят в мешок для криоконсервирования (Baxter/США или Fresenius/Германия). После этого на ледяной бане по каплям приливают ограждающий раствор, после чего мешок герметически запаивают и переносят в аппарат программного замораживания.

При использовании для криоконсервирования мешков емкостью 50 мл к 10,0 мл охлажденной до +4 °С аутологичной плазмы добавляют (по каплям с постоянным механическим помешиванием) 5 мл ДМСО и 20,0 мл среды RPMI (или 20,0 мл 10% раствора HES). Такой ограждающий раствор охлаждают до +4 «С на водяной бане или в холодильной камере, после чего медленно, при постоянном механическом помешивании приливают к 15,0 мл охлажденной до +4-+ 8 °С клеточной взвеси. После этого мешок запаивают и переносят в аппарат программного замораживания.

Предварительно камера аппарата (Кгуо 560-16 или аналогичный) должна быть охлаждена до +4 °С. В качестве биологического имитатора клеточной взвеси, используют тот же ограждающий раствор и такую же концентрацию клеточной взвеси, полученную из крови взрослого донора. Разницу температур в камере аппарата и пробирках с клеточной взвесью на период процесса кристаллизации жидкой фазы устанавливают в Д15 °С. При замораживании в мешках для глубокой заморозки скорость охлаждения оценивают по камере программного замораживателя и устанавливают от 1 °С/мин до 3 «С/мин (рекомендуемая скорость - 1 °С/мин). Замораживание проводится по четырехступенчатой программе.

1_й этап - снижение температуры с +4 до -20 °С со скоростью

1 °С/мин. На этом этапе происходит кристаллизация клеточной взвеси (обычно в пределах от -5 до -20 °С). В этот период происходит выброс латентного тепла, что приводит к кратковременному повышению температуры на 2-6 °С. При программном замораживании аппарат подает дополнительное количество паров жидкого азота и кристаллизация проходит более быстро, что не предотвращает гибель клеток.

2_й этап - снижение температуры с -20 до -40 °С со скоростью

2 °С/мин.

3_й этап - снижение температуры с -40 до -80 °С со скоростью 4 °С/мин.

4_й этап - снижение температуры с -80 до -140 °С со скоростью 20 °С/мин с последующим погружением пробирок или мешков с клеточной взвесью в жидкий азот (t = -196 °С) или его пары (t = -150 °С), где клетки пуповинной крови хранятся в течение длительного срока (см. рис. 27).

Размораживание клеточной взвеси (осуществляют в отделении трансплантации непосредственно перед инфузией стволовых клеток реципиенту) проводят на водяной бане при температуре +40 °С (допустимые колебания температуры воды от +38 до +40 °С) в течение 1,5-2,0 минут или до момента полного оттаивания кусочков льда в мешке, что легко определить визуально. Сразу же после размораживания мешок с клеточной взвесью помещают на ледяную баню для поддержания температуры +4 «С, при которой токсическое действие молекул ДМСО на клетки сводится к минимуму. После тщательного перемешивания из пробирок или мешка берут до 0,6 мл клеточной взвеси и определяют сохранность клеток (количество ЯСК, их сохранность, КОЕ-ГМ, иммунофенотип CD34⁺).

По данным многих авторов, доза трансплантата из пуповинной крови для эффективной трансплантации считается от 3,7 х 10⁷ ядерных клеток в расчете на кг массы тела реципиента (Gluckman E., 1998). При использовании меньших доз отмечено существенное увеличение риска рецидива основного заболевания (в частности, острых лейкозов) и несосоятельности трансплантата. Именно поэтому в данной главе столь подробно приведены сведения о получении и криоконсервировании клеток пуповинной крови.

В заключение следует отметить, что заготовка гемопоэтических клеток пуповинной крови важна не только для планируемой родственной трансплантации. Создание банка пуповинной крови в России поможет при решении проблемы поиска совместимого трансплантата, прежде всего для больных детей, страдающих фатальными заболеваниями кроветворной системы.